1、第三章第三章 生物催化剂的来源与筛选生物催化剂的来源与筛选 大 纲31 概述32 微生物酶筛选的策略33 微生物和酶的一般筛选方法34 优良菌种选育35 从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法31 概 述 311 生物催化剂的概念 1 生物催化剂：是生物反应过程中起催化作用的游离或固定化酶的总称。 2 分 类 结 构形 式细 胞酶多细胞生物体游离型催化剂固定化催化剂312 生物催化剂来源与多样性313 生物催化剂的寻找和发现 提高筛选效率的基本原则需要设计合适的用酶方法，使得目标反应非常清楚需要在有希望的微生物中寻找具有合适活性的微生物需要建立方便和敏感的分析系统尽可能多的搜寻微生物32 微生
2、物酶筛选的策略321 常规生物催化剂筛选的一般策略设计反应过程选择合适的酶或产酶微生物建立有效且方便的分析方法生物催化剂筛选的反应过程的设计图3-1 海因酶和N-氨基甲酰氨基酸水解酶两步选择性水解制备D-对羟基苯基甘氨酸生物催化剂筛选的反应过程的设计例：生物法：腈水合酶与酰胺酶催化反应生产丙烯酰胺CH2CHCOOHCH2CHCN腈水合酶H2OCH2CHCONH2H2O酰胺酶传统法：铜催化丙烯腈的水合生产丙烯酰胺除去O2丙烯腈水水合作用浓缩除去Cu离子，脱色丙烯酰胺产物催化剂的回收制备催化剂的分离未反应的丙烯腈酶或产酶微生物的筛选一般产酶微生物筛选的原则 能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶
3、； 微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； 微生物所产生的酶最好有比较高的专一性 所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安全微生物 微生物的遗传稳定性应该比较高生物催化剂筛选的主要途径 （1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选生物催化剂 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选322 从极端微生物中筛选极端酶的策略极端酶（extremozyme） 是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应的中间型是常态微生物（mesophilic organism）产生的酶。如何进行极端酶的研究和开发 必须有足够的酶，这就涉及极端微生物的
4、培养 依赖极端酶在中间宿主中的表达表3-1 某些有应用前景的超级嗜高温酶酶功 能酶活力的最适温度/葡萄糖异构酶葡萄糖果糖，生产高果糖糖浆95木聚糖酶木浆和纸生产中水解木聚糖105-淀粉酶淀粉水解8590纤维二糖水解酶纤维素水解105-葡聚糖酶A，-葡聚糖酶B纤维素水解95-甘露聚糖酶甘露聚糖水解92-半乳糖苷酶半乳甘露聚糖水解100105-葡萄糖苷酶纤维二糖水解105-木糖苷酶木二糖水解未 定-半乳糖苷酶乳糖水解80323 未培养生物催化剂的发现策略 未培养微生物（uncultured microorganism） 美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出“不能培养微生物（no
5、nculturable microorganism）” 的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到无营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减，代谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因此他们用“活的但不能培养（viable but nonculturable, VBNC)”一语描述这种潜伏状态的细菌。 33 微生物和酶的一般筛选方法331从自然界发现产酶微生物(1) 采样(2) 富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量较少时，设计一种选择型培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势
6、种。分为分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方式。(3) 分离(4) 筛选图3-2 从自然界发现产酶微生物的方法332 生物催化剂的高效筛选高通量筛选（high-through screening, HTS）是近年来发展起来的一种新型筛选技术，其特点是微量、快速、灵敏、准确，在短时间内可以检测大量的微生物。34 优良菌种选育优良生产菌种应该具备的基本特点：生产菌种应该具备在较短的发酵周期内产生大量发酵物在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的反应产物或副产物，以便于分离纯化。能利用多种来源的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性较小，可用价廉易得的原材料进行培养，以降低发酵成本
7、。对需要添加的前体物质（底物）有耐受力，并且不将底物、产物作为一般碳源利用。具有抗杂菌污染，抗噬菌体感染的能力。发酵泡沫少，利于提高装料系数、提高单罐产量、降低发酵成本生长繁殖能力强，有较快的生长速率，遗传特性稳定。341 自然选育自然选育（spontaneous mutation）：未经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。复 壮多因素低剂量的诱变效应互变异构效应342 诱变选育诱变育种的原理突 变基因突变染色体畸变表3-2 常用的各类诱变剂物理诱变剂紫外线、快中子、X射线、射线、激光、等离子束等化学诱变剂碱基类似物2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤硫酸二乙酯（DES）、甲
8、基硫酸乙酯、亚硝基乙基脲（EMS）、亚硝基甲基脲（NEU）、亚硝酸（NA）、氮芥（NM）、4-硝基喹啉（4-NQO）、乙烯亚胺（EI）、羟胺在DNA分子中插入或使之缺失1个或几个碱基物质生物诱变剂噬菌体、转座子诱变育种的基本方法诱变育种诱 变筛 选营养缺陷型突变菌株筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株筛选组成型突变菌株筛选抗性突变菌株筛选出发菌株的选择诱变剂种类和剂量的选择诱变剂使用方法的选择35 从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法从土壤和水样中提取DNA 土样 分离去除细菌 分离收集DNA片段 用限制酶剪切DNA PCR扩增 克隆到BAC载体内 转化培养微生物（大肠杆菌） 筛选转化株 功能基因 新酶土壤微生物DNA文库的构建
