1、第二章 工业微生物基础 了解工业生产常用的微生物及要求，了解工业微生物菌种的选育与改良。掌握工业微生物菌种的保藏，衰退与复壮。重点掌握种子的扩大培养和制备工艺。种类多、分布广生长迅速，繁殖快代谢能力强适应性强，容易培养易变性发酵工业所用菌种总趋势野生菌种转向变异菌种自然选育转向代谢育种诱发基因突变转向基因重组的定向育种工业用微生物菌种要求菌种不是病原菌发酵周期短菌种纯净对设备要求低抗噬菌体能力强诱变敏感能够利用廉价原料利于分离原核单细胞生物，是自然界分布最广、数量最多的一类微生物。有球菌、杆菌、螺旋菌三类。发酵工业中常用的杆菌，它易形成芽孢。工业生产常用杆菌有：枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌
2、、短杆菌等。主要用于生产淀粉酶、乳酸、乙酸和氨基酸等单细胞真核生物，自然界普遍存在，主要分布于含糖较多的酸性环境中。酵母菌多为腐生，以芽殖形式进行繁殖。工业上用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。主要用于酿酒、制作面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白。真核生物，俗称丝状真菌。主要分布于偏酸环境中，多为好氧性，腐生。繁殖能力很强。工业上常用的霉菌有：红曲霉、曲霉、青霉等。主要用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等易引起工业原料、产品和农副产品变质。原核生物类群，菌落成放射状，分布广，多存在于微碱性土壤中，多腐生。最大的经济价值在于能产生多种抗生素。是一种感染原核生物
3、的病毒，能严重危害发酵生产。发掘、利用、改善和保护有益微生物控制、消灭和改造有害微生物原料廉价、生长迅速、目的产物产量高易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期短抗杂菌和噬菌体的能力强菌种遗传性稳定，不易变异和退化，不产生有害物质发酵法生产产品，首先要由一个良好的菌种。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。菌种选育包括自然选育和诱变选育。自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。采样增殖培养纯种分离性能测定 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利其他菌型生长的条件，以促使目标菌种大量繁殖，从而有利于分离。1.选育的目的 改善菌种的
4、特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用。2.基本方法 自然选育、生产育种、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技术和体外重组DNA等。诱变育种代谢控制育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白质结构改变，而使细胞的功能发生改变。改变代谢通路的育种改变代谢自动调节系统的育种不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品的质量，扩大品种，简化生产工艺。速度快，收效显著和方法简便等优点。诱变育种缺乏定向性，且工作量大，有的诱变因素对某些菌种的作用不明显。物理诱变剂化学诱变剂主要为各种射线，如紫外线
5、，x射线、射线、射线、射线和超声波等。其中主要以紫外线应用最为广泛。在紫外线作用下能使DNA链断裂、DNA分子内和分子间发生交联、从而导致菌体的遗传性状发生改变。化学诱变剂作用于微生物细胞，能够特异地与某些基团起作用，即引起物质的原发损伤和细胞代谢方式的改变，失去原有特性，并建立起新的表型。1.常用工业用微生物的种类有哪些？每种列举三个典型代表，并说明其主要的发酵产品？2.简述工业用微生物菌种的要求？ 保持生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡菌种保藏原理 根据菌种的特点 考虑经济和方法菌种保藏方法 常规保藏 永久保藏菌种保藏注意 注意菌种状态 菌种保藏所用的基质 注意操作1.经长期保藏后菌种存活
6、健在。2.保证高产突变菌株不改变表型或基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高能力。1.根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。2.保藏时，一般利用菌种的休眠体，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质添加保护剂或酸度中和剂等。3.考虑经济适用性、方法简单可行。 由于微生物的生物多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。斜面低温保藏法液体石蜡封存保藏法固体曲保藏法砂土管保藏法冷冻干燥法液氮超低温保藏法暂时保藏法长期
7、保藏法斜面低温保藏法液体石蜡封存保藏法砂土管保藏法冷冻干燥法液氮超低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4左右的冰箱中继续保藏，每隔一定时间（保藏期）再接换至新的培养基斜面上，生长后继续保藏，如此连续。该法优缺点 优点：简单易行、存活率高、利于推广； 缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被感染。液体石蜡封存保藏法 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，又防止了水分挥发，使培养物不会干裂。 使用于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧细菌等，但对很多厌氧性细菌的保藏效果差。固体曲保藏法 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏
8、期在1年以上。 操作简单，经济实惠，工厂多选用。砂土保藏法 兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻 ，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度越低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20 以下，同时应该认真掌握冷冻速度和解冻速度。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。普通冷冻保藏技术-20超低温冷冻保藏技术-60-80液氮冷冻保藏技术液氮温度可达到-196普通冷冻保藏技术超低温保藏技术一次解冻的菌株不宜再次保藏注意控制保藏温度，培
9、养瓶或试管应严格密封方法简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏适宜长期保藏微生物菌株，温度一般控制在-60 以下保藏前处理复杂液氮超低温保藏法简便易行，关键是液氮、冰箱。要点是：将要保藏的菌种置于冷冻保护剂中，密封于安瓿瓶内，先将菌液降至0 ，再以每分钟降低1 的速度降至-35 ，然后将安瓿瓶置于液氮中保藏。冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬浮液中的水分生化，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。大部分微生物菌种可以在冷干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冷干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。是在细胞群体中发生的一系列生物学性状由量变到质变的逐步
10、演变过程。大量群体中的自发突变。对产量性状来讲，菌种的负变就是衰退；典型性状变得不典型；生长速度缓慢；代谢产物生产能力降低；抗不良环境条件能力减弱。菌种保藏不妥善菌种发生突变或回复菌种生长条件不满足菌种连续传代菌种连续传代是退化直接原是退化直接原因因菌种遗传特性的改变菌种生理状况的改变异核现象导致微生物群体发生变异。自发突变导致菌体遗传特性改变。突变所产生的变种或杂交重组所形成具有不同基因型的个体。菌种群体不纯。菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。某些活化或阻遏状态的基因，改变菌种生理状态。菌种衰退防止办法优质保藏传代良好菌种复壮菌种分离、纯化性能改变衰退原因1.选育生产性能稳定
11、的菌株作为生产菌株经诱变等处理的菌种要连续传代、分离纯化，防止回复突变。2.控制传代次数尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降到最低，减少自发突变3.创造良好的培养条件创造一个适合原种的生长条件，就可以在一定程度上防止菌种衰退。4.利用不同类型的细胞进行接种传代5.采取有效的菌种保藏方法 菌种发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产能力等指标，从衰退的群体中筛选出少数尚未发生退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施纯种分离分离出保持原有典型性状的菌株扩大培养，恢复菌株的典型性通过寄主体进行复壮接种到相应的寄主体内再重新分离菌株淘汰已衰退的个体低温下处理低温存活个体中保留未退化的
12、健壮个体 是发酵生产的第一道工序，称为种子制备。 使菌体数量增加，并具有高质量的生产种子供发酵使用。为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还有获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间保证生产固体培养孢子制备霉菌孢子制备细菌培养物的制备液体培养摇瓶种子制备种子罐种子制备孢子培养 是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵都有明显的影响。种子制备 是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入道液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。摇瓶种子制备 某些孢子发芽和菌
13、丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再入种子罐。 摇瓶相当于微缩种子罐，其培养配方和培养条件与种子罐相似。种子罐种子制备 工艺过程因菌种不同，一般分为一级种子、二级种子和三级种子制备。 种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和培养方法，从而保证种子正常生长。工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类。静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，接种后，不通空气进行培养通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，必须提供氧气，又称为好气性培养。 表面培养是一种好氧静置培养法 菌体生长速度与培养基的深度有关表面培养 浅盘固体培养和深层固体培养 统称为曲法培养固体培养 根据要求选择最佳培养条件液体深层培养1.灭菌发酵工业要求纯培养，对培养基进行加热灭菌2.温度控制培养基灭菌后，冷却至培养温度通冷却水循环3.通气、搅拌空气进入先通过滤器除杂菌搅拌将空气分散 种子培养的目的是获得健壮和足够量的菌体 菌体形态、浓度及培养液外观是种子质量的重要指标细胞或菌体 种子液的糖、氮、磷含量的变化和PH变化 种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标生化指标 种子液中产物的生成量是重要的指标 某种酶的活力是一种较新的方法产物生成量和酶活力
