1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离分离与与计数计数一一. .研究思路研究思路 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。 因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数微，淘汰了绝大多数微生物只有生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNA DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量大量复制复制的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求使用使用耐高温（耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶
2、。聚合酶。原因：原因：启示：启示：3、选择培养基、选择培养基l在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许特定特定种类的微生物生长，种类的微生物生长，同时同时抑制抑制或或阻止阻止 其他种类微生物生长的培养其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。基，称作选择培养基。4、配制选择培养基的依据、配制选择培养基的依据l 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。物质以达到选择的目的。l例如：培养基中不加入有机物可以选择培养例如：培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养以选择培
3、养 的微生物，加入的微生物，加入高浓度的食高浓度的食盐盐可选择培养可选择培养金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌等。等。自养型自养型固氮固氮5 5、本课题使用的培养基的配方：、本课题使用的培养基的配方：4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基 是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是 当样品的稀释度足够高时，培养基表当样
4、品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。 当样品的稀释度足够高时，培养基表当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。1、1个菌落个菌落 1个活菌。个活菌。2、统计的菌落数、统计的菌落
5、数 实际活的细菌数。实际活的细菌数。3、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般至少要涂布至少要涂布3个平板。个平板。4、重复实验结果中小于、重复实验结果中小于30菌落的不用。菌落的不用。不一定不一定统计的菌落数往往比活菌的实际数目统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，因此统计，因此统计结果一般用结果一般用 表示。表示。低低菌落数而不是活菌数菌落数而不是活菌数 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中
6、，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板
7、） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值（1）设置对照的目的：）设置对照的目的：（2）对照实验：）对照实验： 指除了指除了 的条件外，其他条件都的条件外，其他条件都 的实验。的实验。满足该条件的称为满足该条件的称为 对照组对照组，未满足该条件的称为，未满足该条件的称为 实验组实验组。被测试被测试相同相同实验组：实验组：对照组：设置对照对照组：设置对照 - 同等条件下，培养空白培养基。同等条件下，培养空白培养基。菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养设置对照的方法：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。空白对照：不给对照组任何处理因素
8、。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。的解释有两种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。（一）土壤取样（土壤是天然培养基）（一）土壤取样（土壤是天然培养基） （1 1）取样的位置：）
9、取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，土壤，天然培养基，含有大量的微生物，土壤土壤中中7070 9090是细菌，细菌适宜在酸碱度接近是细菌，细菌适宜在酸碱度接近中性中性的的的潮湿土壤中生长。在富含有机质的土壤层的的潮湿土壤中生长。在富含有机质的土壤层的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数的细菌。处中分布着绝大多数的细菌。 （2 2）取样要求：）取样要求：铲去表层土铲去表层土。注意无菌操作：注意无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具在使用前都要灭菌。灭菌。应在火焰旁称取土壤。并在火焰附近将土样到入锥形瓶应在火焰旁称取土壤。并在
10、火焰附近将土样到入锥形瓶并塞好棉塞。并塞好棉塞。l制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液 实验时要对实验时要对培养皿作好标培养皿作好标记。记。注明培养注明培养基类型、培养基类型、培养时间、稀释度、时间、稀释度、培养物等培养物等。 观察：观察：筛选后必鉴定筛选后
11、必鉴定- -鉴别培养基鉴别培养基l鉴别培养基：不影响微生物的生存鉴别培养基：不影响微生物的生存l 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的微生物，微生物，l如加入伊红如加入伊红- -美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否大肠杆菌（如有，菌落呈深色，并带有中是否大肠杆菌（如有，菌落呈深色，并带有金属光泽）金属光泽）酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚
12、红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）样品的稀释操作是否成功（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2个或个或2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成
13、功，并能够进行菌落的计数。则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致（三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。生差异的原因。（一）、无菌操作（一）、无菌操作l1、土壤取样、土壤取样l 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使封
14、中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。用前都要灭菌。2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。培养基。3、样品的稀释：、样品的稀释：注注 意意、为了保证结果准确，一般选择菌落数在、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平的平板上进行计数。板上进行计数。、为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以、为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。、统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或、统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因
15、为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。、涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个、涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左个左右为最好。右为最好。l（1）、应在火焰旁称取土壤）、应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒。将称好的土样倒入盛有入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。 l（2）、
16、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火）、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。焰旁进行。l（3）、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原）、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在得菌落数在30300之间、适于计数的平板。之间、适于计数的平板。l（4）、如果得到了）、如果得到了2个或个或2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。（三）、制定计划（三）、制定计划
