1、20XX年度本科生毕业论文（设计）蛹虫草生物学特性研究院 系：生命科学与技术学院 专 业：设施农业科学与工程 年 级：XXX 学生姓名：XXXX 学 号：XXXX 导师及职称：XXX（副教授） 20XX年XX月2014 Annual Graduation Thesis (Project) of the College UndergraduateResearch on biology characters of Alternaria spp. from black spot disease in Dendrobium officinale Kimura et MigoDepartment: Co
2、llege of Life Science and TechnologyMajor: Protected Agricultural Science and EngineeringGrade: 2011Students Name: Ma Wen-huiStudent No.: 201101130217Tutor: Associate Professor Kong QiongApril, 20XX毕业论文（设计）原创性声明本人所呈交的毕业论文（设计）是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本论
3、文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 日期： 2014年5月4日 毕业论文（设计）授权使用说明本论文（设计）作者完全了解XX学院有关保留、使用毕业论文（设计）的规定，学校有权保留论文（设计）并向相关部门送交论文（设计）的电子版和纸质版。有权将论文（设计）用于非赢利目的的少量复制并允许论文（设计）进入学校图书馆被查阅。学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容。保密的论文（设计）在解密后适用本规定。 作者签名： 指导教师签名：XXX 日期： 20XX年 月 日 日期： 20XX年 月 日 毕业论文（设计）答辩委员会(答辩小组)成员名单姓名职称单位
4、备注生命科学与技术学院生命科学与技术学院生命科学与技术学院XX学院本科毕业论文 (设计)摘 要 蛹虫草是一种经济价值较高的药食两用真菌。但是其生长过程需要一定的环境条件，目前，人们对于蛹虫草的生长发育规律不是非常明确，而这便制约了蛹虫草的规模化生产。本文通过对蛹虫草平板菌丝生长特性的研究，确定出较优的培养基配方，然后对液体培养配方以及摇床转速的优化、碳源、氮源及维生素B对菌丝菌丝体干重和产孢量的影响进行研究，探讨了不同培养基配方对蛹虫草子实体生长发育的影响。得出蛹虫草的生物学特性，从而为大规模工厂生产化的到一定的理论依据。关键词：蛹虫草；固体培养；液体培养；温差；光照时间ABSTRACT Co
5、rdyceps militaris is a kind of high economic value of medicine and food fungi. But its growth process needs certain environmental conditions, at present, the law of the people for the growth of cordyceps militaris is not very clear, which has restricted the large-scale production of cordyceps milita
6、ris. In this paper, through the study of cordyceps militaris hyphae growth characteristics, identify the optimal culture medium formula, and then the optimization of liquid culture formula and table speed, carbon source, nitrogen source and vitamin B to mycelium dry weight of mycelium and spore prod
7、uction quantity is studied, the influence of different culture medium formula on cordyceps militaris fruiting body growth and development. It is concluded that the biological characteristics of cordyceps militaris, thus for large-scale factory production to a certain theoretical basis.Key words: cor
8、dyceps militaris; Solid cultivation; Liquid culture; Temperature difference; Illumination time目 录1.前言11.1蛹虫草概述11.2蛹虫草研究现状11.3蛹虫草研究目的意义12.材料与方法32.1病原菌分离鉴定32.2供试培养基配方32.3生物学特性研究32.4数据分析53.结果分析63.1病原菌形态特征观察63.2生物学特性64.讨论75.结论7参考文献7致谢7IIIXX学院本科毕业论文 (设计) 1.前言 蛹虫草（Cordycepsmiliars）,又名冬虫夏草、北虫草、用草等，属于子囊菌亚门（
9、Ascomycotina）核菌纲（Pyrenomycetes）球壳目（Sphaerinles）麦角菌科（claviticpitaceae）虫草属（Coedyceps）,是由子座和菌核组成的复合体。国外分布在北美、德国、加拿大、意大利、日本和俄罗斯等，我国各省区也均有分布，主要产于云南（昆明、安宁、江川）、吉林（安图、永吉）、辽宁（沈阳）、内蒙古（哲里木盟）、广西、山西、河北、湖南等，生于针、阔叶林或混交林地表土层中的鳞翅目昆虫的蛹上。蛹虫草还可以寄生在直翅目（如蟋蟀）、鞘翅目（金龟子虫草）、膜翅目（蜂虫草）、半翅目（椿象虫草）和双翅目（蝇虫草）等上【1】。 其主要形态特征为子座单生或数个一起从
10、寄生蛹体的头部或节部长出，颜色为橘红或橘黄色，全长2-8cm，蛹体颜色为紫色，长约1.5-2cm。蛹虫草的菌丝是一种子囊菌，其无性为蛹虫拟青霉，当菌体成熟后可形成子囊孢子，孢子散发后随风散播，落在适宜的重提上萌发形成菌丝体【2】，而菌丝体在不断的发育过程中也会向虫体内蔓延，结果导致蛹虫被真菌感染，蛹体内组织就会慢慢的分解，带蛹虫草的菌丝把蛹体内的各种组织器官完全分解完毕后，菌丝体的发育就进入了一个新的阶段，也就是菌丝体由营养生长转为生殖生长，最后扭结后从蛹体空壳的头部、胸部、仅为不等处伸出，形成顶部略膨大的呈棒状的子座（子实体）。 近几年来，研究表明，人工栽培的蛹虫草其药理作用和化学成分与冬虫
11、夏草基本一致，但是价格方面却是远远低于天然的冬虫夏草，由此，蛹虫草的开发有很大的潜在市场。但是由于影响蛹虫草人工栽培的因素很多，其生长发育不同阶段适时调整其所需环境条件，可提高蛹虫草的质量和品质。并且采用人工培育，就不用受自然环境影响，可周年生产。我国从20世纪70年代后期就开始蛹虫草菌人工栽培技术的研究，虽然已经掌握了一些基本技术，但至今离产业化的实际要求尚有很多关键的问题有待突破解决。许多实验室已经掌握蛹虫草菌的人工培养技术。这里的人工培养技术包括三个方面，以为半人工栽培，即在适宜的环境下利用人为的接种或喷洒孢子悬浮液来培养子实体的方法：二为人工固体栽培，已有的蛹虫草菌种制成斜面固体或液体
12、药瓶菌种，然后直接接种到固体培养基上培养蛹虫草的方法；三为液体深层发酵，通过此法获得的虫草菌丝体内的化学组成和天然的化学组成相近，而且条件易控制、生产周期短，产量稳-定。通过科研人员的不懈努力，在蛹虫草的人工培育中取得了骄傲的成绩，从而弥补了天然资料短缺的不足。因此立题开展蛹虫草培养技术研究，在于探索出其较佳的营养和环境条件，为蛹虫草的工厂化生产提供依据。2.材料与方法 2.1 母种扩繁阶段2.2.1 母种培养基的制作 将马铃薯去皮后，切成片状，称取200g片状马铃薯。将马铃薯切片和1000ml水倒入锅中，用文火煮沸，待马铃薯切片煮至酥而不烂。再用四层纱布过滤后取滤液，并将滤液定容到1000m
13、l，然后倒入锅中，并称取葡萄糖20g、琼脂粉20g一并倒入锅中煮，并用玻璃棒搅拌，直至融化后分装三角瓶中，培养液倒入量为三角瓶限定毫升量即可。将三角瓶用封口膜封好，后用废旧报纸包裹住三角瓶口并用橡皮筋固定好。将接种针用废旧报纸包好和装有培养液的三角瓶以及培养皿一并直立放进灭菌锅，在压力为1.21Mpa条件下，持续灭菌35分钟，待冷却后打开灭菌锅取出三角瓶、培养皿及接种针并放置于事先经过紫外灯灭菌40分钟左右的超菌工作台中冷却一段时间，待三角瓶中培养液冷却到一定程度在超菌工作台中点燃酒精灯并倒培养基至培养皿中。制成培养基。2.2.2 接种 接种需要在超净操作台里进行，使用前需用75酒精对操作台进
14、行消毒，消毒后关好操作台窗先用紫外线照射20分钟后再风吹XX分钟才可进行接种作业。接种时，将接种针在酒精灯火焰上烧红以达到灭菌效果。将装有供试菌种的试管口在火焰上微烧2周后将烧过的接种针伸入到菌种试管内，为达到接种针冷却以免损伤菌种可以触及没有长菌的培养基上面使其冷却。挑取菌种时，在长有菌种培养基上轻轻挑取，将粘有菌种的接种针抽出菌种试管迅速伸入已制备好培养基斜面的试管内，并将菌种轻轻按在斜面培养基中间位置后抽出接种针塞好试管口。接种完毕。2.2 平板菌丝培养配方研究 将活化好的菌种接于平板培养中央，在恒温培养箱中培养观察。接种后三天菌种适应生长环境开始生长此时测量菌丝生长速度，在其平板背面测
15、量，以固定的接种块边缘为其菌丝生长基点，量取菌丝体长度，五个重复取平均值，每天同一时间测量，知道其长满平板。计算器日均生长速度，还有记录菌丝长势、色泽、形态。 平板菌丝日均长速（cm/d)=菌落半径（cm）/菌丝生长天数（d） 培养基配方为：培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。加富培养基：马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g,蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁2.5g，维生素B10.01g，琼脂20g，水1000ml。察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g,硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
16、沙氏培养基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。2.3 液体培养基优化2.3.1 液体培养基配方研究 培养条件 在无菌操作的基础上，挑选无沉淀的培养基接上蛹虫草菌，在转速为140rpm的摇床上连续培养7天，第三天起，每天下午18时测定细胞干重。其中马铃薯200g，和葡萄糖20g含量不变，蒸馏水1000ml,其余含量如下液体配方如下表1。 表1不同液体培养基配方培养基编号其含量所占比例（%）蛋白胨磷酸二氢钾七水硫酸镁酵母膏维生素B110.0300.0300.0XX0.0000.00520.0000.0100.0050.0000.00530.0500.0XX0.0100.0
17、000.00540.0500.0000.0100.0300.0002.3.2 液体培养摇床转速研究 蛹虫草液体培养为室温、装液量为50%，初始PH为6.5，接种后以120rpm，140rpm,160rpm，180rpm的摇床转速设置4水平3重复设计试验。培养基为上述试验中的优化培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏3g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁1g，维生素B1 10mg，蒸馏水1000ml。2.3.3 液体培养基碳源、氮源、维生素B的优化 确定最佳转速后，在上述实验基础上确定最佳谈氮源及维生素B的选择。进行单因素试验,设置三个重复.2.3.3.1 液体培养基碳源优化 碳源优
18、化培养基：马铃薯200g，蛋白胨3g，酵母膏3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1g，维生素B1 1片，蒸馏水1000ml,再分别加入不同碳源20g/L。其中碳源的种类为葡萄糖，蔗糖，乳糖。2.3.3.2 液体培养基氮源优化 氮源优化培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母膏3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1g，维生素B1 1片，蒸馏水1000ml，再分别加入不同氮源3g/L.其中氮源种类为：蛋白胨、氯化铵、硝酸钾。2.3.3.3 液体培养基维生素B优化 VB优化培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.5g，蒸馏水1000ml，在分别加入不同维
19、生素B。维生素B种类分别为：VB1、VB、VB2. 2.4 栽培培养基优化 以小面三个培养基为基础配方，分别加入40%的燕麦、大米和高粱，所给试验培养基配方，按照无菌操作要求，将液体菌种接种到已经冷却的栽培培养基中，恒温21摄氏度，在培养箱中进行暗培养，10d后，待菌瓶底部被菌丝完全追透，此时将菌瓶进行出草培养。培养条件为，温度为21摄氏度，湿度80%左右，每天早上8点起给予10h光照，早晚通风XXmin，3d后，每晚22时，给予8摄氏度温差刺激转色。5d后正常培养，连续培养55d.此期间观察其长势，色泽等。 培养基A：马铃薯20%，葡萄糖12%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%,磷酸二氢钾0.
20、08%，七水硫酸镁0.03%，料水比为1:1.5。 培养基B：马铃薯20%，葡萄糖12%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%,磷酸二氢钾0.08%，七水硫酸镁0.03%，维生素B1 0.005%，料水比为1:1.5。 培养基C：马铃薯20%，葡萄糖12%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.08%，七水硫酸镁0.03%，料水比为1:1.5。 3.结果分析3.1 平板菌丝菌落形态结果 优质的蛹虫草菌菌落形态具有以下特征：生长速度快、菌丝浓密、边缘整齐、有清香味。 表2不同培养基配方菌丝体生长特性描述配方菌落颜色菌丝形态日均生长速度PDA培养基洁白0.35cm/d加富PDA培养基先洁白，后期淡黄0.45cm
21、/d察氏培养基先洁白，后期深黄0.41cm/d沙氏培养基洁白0.39cm/d 由表2可以看出3.2 液体培养基优化3.2.1 液体培养基配方研究 由图3-1可以得知蛹虫草对配方的选择性大 图3-1 不同培养基对产孢量和菌丝干重的影响 由图可分析得知培养基A的配方为最优3.2.2 摇床转速对液体培养基的影响 3-2由图分析可知，在设计的转速梯度中以160rpm，最佳，其产孢量和菌丝体干重为最高，而其中120rpm，却是最为低的，故转速以160rpm最佳。 图3-2 不同转速对液体菌种的影响3.2.3 液体培养基碳源的优化 由图3-3可知蛹虫草基本可以利用三种碳源，对这三种碳源选择性不大。 图3-
22、3 不同碳源对蛹虫草产孢量及其菌丝体干重的影响3.2.4 不同氮源对 由图3-4可知，氮源在培养基中有一定的选择性，在所选择的三种氮源中，蛋白胨的利用效果较好，而硝酸钾和氯化铵则不能被较好的利用。 图3-4 不同氮源对蛹虫草产孢量及其菌丝体干重的影响3.2.5 不同维生素B对蛹虫草菌的影响 由图3-5可知，在蛹虫草液体培养基中，对维生素B具有一定的选择性，明显显示维生素B1能让蛹虫草菌较好的利用。 由图3-5 不同碳源对蛹虫草产孢量及其菌丝体干重的影响3.3 栽培培养基配方优化配方生长情况平均鲜重（g)平均干重（g）配方A菌丝浓密、整齐、生长旺盛，速度快，长势好14.2配方B菌丝浓密，较为粗壮
23、，生长速度快12.1配方C菌丝稀疏，长势8.9配方D菌丝浓密，生长较旺盛，较细10.5配方E菌丝浓密，长势不均，生长旺盛11.6配方F菌丝稀疏，不均匀，且长势不好8.2配方G菌丝较密，生长较慢，畸形配方H配方I 由上的分析可得到在所选的配方中，其以燕麦作为添加物时，子实体生长较好，且粗壮，大米次之，而高粱之所以难以利用在于其较其他两中添加无来说较硬，不易被蛹虫草菌所吸收利用，解决方法可在料水比上再添加一定量的水。11XX学院本科毕业论文 (设计) 4.讨论本试验蛹虫草人工培养技术包括三个方面，以为半人工栽培，即在适宜的环境下利用人为的接种或喷洒孢子悬浮液来培养子实体的方法：二为人工固体栽培，已
24、有的蛹虫草菌种制成斜面固体或液体药瓶菌种，然后直接接种到固体培养基上培养蛹虫草的方法；三为液体深层发酵，通过此法获得的虫草菌丝体内的化学组成和天然的化学组成相近，而且条件易控制、生产周期短，产量稳-定。通过科研人员的不懈努力，在蛹虫草的人工培育中取得了骄傲的成绩，从而弥补了天然资料短缺的不足。本试验中发现不同配方的铵态氮可显著抑制铁皮石斛链格孢菌的生长与何凯19等人的研究一致，而张子君20等的研究表明铵态氮在固体培养基上可促进番茄链格孢菌的生长，这与实际生产中铵态氮促进叶片衰老，而黑斑病主要发生在老叶上是呈负相关的，所以以后在实际生产中在叶面肥的施用中可以适当增加铵态氮。前人报道链格孢菌 35
25、以上就难以生长，其分生孢子产量的最适宜温度是 2521，本试验分离到的铁皮石斛链格孢菌菌丝在研究结果一致，都是 35菌丝不能生长。铁皮石斛黑斑病主要发生于夏季6-8月份，屏边地区大棚温度大约在27-28，这与本实验结果链格孢菌最适温度27是相一致的，在今后的实际生产中在夏季应注意棚内温度的控制，以减少黑斑病的发生。本实验研究发现链格孢菌落生长最适pH值为6，孢子萌发率最适pH值为8，这要求在今后的肥料使用时对肥料酸碱性有一定要求。对于光照来说，前人的研究结果表明光照对银杏链格孢菌菌丝生长有显著影响22，而本试验结果表明光照对铁皮石斛链格孢菌菌丝生长没有明显影响，这与王仕玉23等人的研究结果一致
26、。本实验通过对铁皮石斛黑斑病病原链格孢的鉴定以及生物学特性研究，为XX州屏边地区链格孢菌浸染的铁皮石斛黑斑病防治提供了理论依据，但由于本实验是在人为创造的环境条件下进行的，存在一定的局限性和偏差性，铁皮石斛生存环境比较复杂多变，研究成果真正应用于实际生产，还需要作进一步的研究探索。5.结论通过蛹虫草生物学特性的研究，发现适合蛹虫草菌菌落生长的培养基是加富PDA培养基，即上述的培养基B：马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g,蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁2.5g，维生素B10.01g，琼脂20g，水1000ml。13XX学院本科毕业论文 (设计) 参考文献1邵力平，真菌分类学M.北京
27、：中国林业出版社，1984：109.2古恒生，梁漫逸.人工培育蛹虫草研究J.药学情报通讯，1987，5（3）：51.3蒋本律，徐银根.蓖麻蚕蛹虫草人工培养研究J.中国野生植物资源，1996，XX（2）：12.4朱宏图.人工培育蛹虫草的研究J.中药通报，1987，12（12）：21.5陈顺志，吴佩杰.瓶载蛹虫草子座的方法J.生物学通报，1992（1）：44.6郑晴霞，彭菲，王凤翱.蛹虫草的人工培育及组织学研究J.湖南农业大学学报，1995，21（6）：581.7姜明兰，钟文田.北冬虫夏草人工栽培技术研究J.辽宁农业科学，1995，1：54.8张显科，刘文霞.不同培养料栽培蛹虫草实验研究J.中国食
28、用菌，1997，16（2）：21.9刘守华，王栩.代料栽培试验研究J.辽宁师专学报，1999，1（1）：91.10冉翠香，王莉，许智宏.人工培育蛹虫草子实体原基的诱发形成J.食用菌，2001，23（4）：9.11邵爱娟，戴如琴，兰红丽.虫草菌丝的生理研究J.中国中医药科技，1994，1（5）：22.12李宗军，温琼英.蛹虫草无性型的研究.液体发酵培养菌丝体及胞外多糖的提制J.湖南农业大学学报，1998，24（5）：375.13李信，许雷.蛹虫草菌胞外多糖发酵工艺优化J.化工冶金，1998，19（3）：254.14赵明文，吴燕娜，李玉祥.蛹虫草产胞外多糖的液体优化培养条件研究J.中国食用菌，20
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