1、概概 述述v利用人体内的天然物质治疗人类的疾病或达到某利用人体内的天然物质治疗人类的疾病或达到某种医学效果一直是医学上的一个重要研究领域。种医学效果一直是医学上的一个重要研究领域。v20世纪世纪70年代以来产生了年代以来产生了DNADNA重组技术，这种新重组技术，这种新技术是现代生物技术的主体，近年来首先在医药技术是现代生物技术的主体，近年来首先在医药领域获得了飞速发展。生物技术的应用领域获得了飞速发展。生物技术的应用2/3用于医用于医药，生物技术新型药物和疫苗已有药，生物技术新型药物和疫苗已有50多种产品投多种产品投放市场，放市场，400多种正在进行临床试验，多种正在进行临床试验，2000多
2、种多种在临床前研究。在临床前研究。v据报道，国外据报道，国外65006500万人接受重组乙肝疫苗、万人接受重组乙肝疫苗、10000万人接受万人接受t-PAt-PA治疗，超过治疗，超过5050万人使用万人使用EPOEPO，每天，每天约有约有10001000万人接受重组人胰岛素的治疗。万人接受重组人胰岛素的治疗。v生物技术产品的生产和管理按生物制品生物技术产品的生产和管理按生物制品的要求进行，不仅对最终产品的质量实的要求进行，不仅对最终产品的质量实施有效控制，而且特别重视对生产工艺施有效控制，而且特别重视对生产工艺的全过程进行质量控制的全过程进行质量控制,其中包括对每个其中包括对每个生产步骤的验证
3、、质量检定（生产步骤的验证、质量检定（QC）、质）、质量保证部（量保证部（QA）对生产和质量检定的全）对生产和质量检定的全过程进行严格的管理。过程进行严格的管理。1 1、概念：、概念：2 2、分类、分类 生物技术药物生物技术药物重组重组DNADNA药物药物重组蛋白质药物重组蛋白质药物采用采用DNADNA重组技术或其他新生重组技术或其他新生物技术生产的治疗和预防药物技术生产的治疗和预防药物。物。 1 1、重组蛋白质或重组多肽药物包括：、重组蛋白质或重组多肽药物包括： 细胞因子类：细胞因子类：rIFNrIFN、IL-2IL-2、EPOEPO等；等； 抗细胞素治疗：抗细胞素治疗：CD4CD4可溶性受
4、体等；可溶性受体等； 重组溶血栓类：重组溶血栓类：rSKrSK、rSAKrSAK等；等； 人源化单克隆抗体制剂；人源化单克隆抗体制剂； 重组疫苗和菌苗制剂。重组疫苗和菌苗制剂。2、重组、重组DNA药物包括：药物包括：v寡核苷酸药物：反义核酸等；寡核苷酸药物：反义核酸等；v基因药物：腺病毒基因药物：腺病毒-IL-2-IL-2、腺相关病毒、腺相关病毒- -凝血凝血因子；腺病毒因子；腺病毒- P53- P53v细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞胞 vDNADNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等疫苗等。我国生物技术药物质量标准研
5、究现状我国生物技术药物质量标准研究现状v现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域产生了巨大影响。产生了巨大影响。v自自1982年第一个基因重组药物年第一个基因重组药物重组胰岛素上重组胰岛素上市以来，全世界约有市以来，全世界约有60余种重组产品开发成功，余种重组产品开发成功，包括基因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、包括基因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、反义核苷酸药物、基因治疗药物、反义核苷酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗。疫苗。v 我国在我国在“七五七五”、“八五八五”、
6、“九五九五”期间国期间国家家“863”高技术项目支持下，先后建立一系列高技术项目支持下，先后建立一系列基因重组制品质量标准和质控方法，共完成国基因重组制品质量标准和质控方法，共完成国家一类、二类新药家一类、二类新药20余种产品的质量标准研究。余种产品的质量标准研究。生物技术药物质量标准研究的依据生物技术药物质量标准研究的依据一、主要依照一、主要依照重组重组DNADNA产品质量控制要点产品质量控制要点、中国生物制品规程中国生物制品规程、中国药典中国药典等要等要求进行。求进行。二、参考世界卫生组织（二、参考世界卫生组织（WHOWHO）和美国）和美国FDAFDA颁颁布的指南、布的指南、ICHICH文
7、件和文件和欧洲药典欧洲药典。检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行；检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行；保证产品安全、有效。保证产品安全、有效。生物技术药物质量标准研究的内容生物技术药物质量标准研究的内容1、目标产品的均一性、目标产品的均一性2、建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法、建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法3、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质控标准控标准4、研究建立国家标准品或参考品、研究建立国家标准品或参考品5、建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标、建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标准准6、制定出
8、保证上述生物技术产品临床安全、有效、制定出保证上述生物技术产品临床安全、有效、与与WHO标准相一致的质量控制标准和规范化的检标准相一致的质量控制标准和规范化的检定方法定方法 研究建立灵敏、稳定的理化性质、纯研究建立灵敏、稳定的理化性质、纯度、含量的测定方法及质控标准。度、含量的测定方法及质控标准。 研究建立目标产品的生物学功效的测研究建立目标产品的生物学功效的测定方法及质控标准；建立用于药物生物学定方法及质控标准；建立用于药物生物学功效检定用的细胞系和动物模型。功效检定用的细胞系和动物模型。 运用生化标准化原则，以运用生化标准化原则，以WHO国际国际标准品为对照，研制出国家标准品或参标准品为对
9、照，研制出国家标准品或参考对照品。在效价定义上要求与国际单考对照品。在效价定义上要求与国际单位一致；没有国际标准品的新药，则根位一致；没有国际标准品的新药，则根据标准品要求自行研制国家参比品。据标准品要求自行研制国家参比品。 外源外源DNA、菌体蛋白质、细菌内毒、菌体蛋白质、细菌内毒素以及病毒、支原体、细菌等在工艺中素以及病毒、支原体、细菌等在工艺中加入有害物质的检测。加入有害物质的检测。重组产品质量控制上存在的难点重组产品质量控制上存在的难点v建立重组药物的生物学活性测定方法；建立重组药物的生物学活性测定方法；v理化测定标准品的稳定性；理化测定标准品的稳定性；v人源化单抗中的人源化程度检测方
10、法及标准研究；人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究；v重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；v反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评价反义核酸的体内及体外活力；价反义核酸的体内及体外活力；v基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物分布和效力测定；分布和效力测定；vDNA疫苗的安全性和效力检测方法研究；疫苗的安全性和效力检测方法研究；v干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及活力测定）活力测定）
11、。我国基因工程产品安全管理我国基因工程产品安全管理法规和技术指南法规和技术指南传代细胞系生产生物制品的规程传代细胞系生产生物制品的规程人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点预防用新生物制品临床研究的技术要求预防用新生物制品临床研究的技术要求人用重组人用重组DNADNA制品质量控制要点制品质量控制要点人的体细胞治疗申报临床试验指导原则人的体细胞治疗申报临床试验指导原则人基因治疗申报临床试验指导原则人基因治疗申报临床试验指导原则药理毒理检查指导原则药理毒理检查指导原则药品生产质量管理办法药品生产质量管理办法药品注册管理办法药品注册管理办法生物技术药物的质量控制生物技术药物
12、的质量控制生物技术药物的特点：生物技术药物的特点：1 1、来源：活的生物体（细菌或细胞）；、来源：活的生物体（细菌或细胞）；2 2、结构：复杂（包括组成、空间结构）、结构：复杂（包括组成、空间结构）；3 3、生产：涉及生物材料和生物学过程（、生产：涉及生物材料和生物学过程（发发 酵、细胞培养，分离纯化等）酵、细胞培养，分离纯化等）， 有其固有的易变性。有其固有的易变性。生物技术药物的质量控制生物技术药物的质量控制质量控制包括两个方面：质量控制包括两个方面：1 1、生产过程中质量控制、生产过程中质量控制GMPGMP（硬件、软件（硬件、软件）2 2、最终目标产品的质量控制（方法学研究、最终目标产品
13、的质量控制（方法学研究）质量控制方法学研究具体内容质量控制方法学研究具体内容一、生物学活性测定和比活性一、生物学活性测定和比活性二、蛋白质纯度检查二、蛋白质纯度检查三、蛋白质含量测定三、蛋白质含量测定四、蛋白质药物理化性质的鉴定四、蛋白质药物理化性质的鉴定五、蛋白质的二硫键分析五、蛋白质的二硫键分析六、对糖蛋白的特殊要求六、对糖蛋白的特殊要求七、残余杂质检查七、残余杂质检查八、安全性及其他检测项目八、安全性及其他检测项目九、生物技术药物待测样品保存九、生物技术药物待测样品保存一、生物学活性测定和比活性一、生物学活性测定和比活性1 1、意义：、意义：1 1）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽，
14、）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽，其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成 的活性中心所决定的，与其绝对的活性中心所决定的，与其绝对质量质量不一致。不一致。2 2）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相一致。一致。3 3）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。效价测定一般原则效价测定一般原则1 1、国际通用方法；、国际通用方法；2 2、测定结果须用国际或国家标准品、测定结果须用国际或国家
15、标准品校校 正，以国际单位表示。正，以国际单位表示。生物学活性测定方法分类生物学活性测定方法分类1 1）体外细胞培养测定法）体外细胞培养测定法 a a、促进细胞生长作用（、促进细胞生长作用（G-CSF:NFS-60G-CSF:NFS-60） b b、抑制细胞生长作用、抑制细胞生长作用 (TNF:L929)(TNF:L929) c c、间接保护细胞作用、间接保护细胞作用 (IFN:VISH;VSV)(IFN:VISH;VSV)2 2）离体动物器官测定法）离体动物器官测定法 采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性。物活性。3 3）体内测定法）体内测定法4 4）生
16、化酶促反应测定法）生化酶促反应测定法5 5）免疫学活性测定法）免疫学活性测定法v取兔离体动脉条剪成约取兔离体动脉条剪成约1.5cm 1.5cm 长、长、2 23 mm 3 mm 宽的螺旋环，悬挂于含宽的螺旋环，悬挂于含10mL10mL通氧的通氧的3737台氏台氏液液( (取取NaC1 8.0 gNaC1 8.0 g、KC1 0.2 gKC1 0.2 g、CaCl 20.2gCaCl 20.2g、NaHNaH2 2POPO4 40.05g0.05g、MgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.1gO 0.1g、NaHCONaHCO3 3 1.0 g1.0 g、Glucose 1.0gGlucos
17、e 1.0g用蒸馏水配成用蒸馏水配成1 000 mL1 000 mL的溶液，的溶液， 置于玻璃或塑料瓶中，用置于玻璃或塑料瓶中，用1 molL1 molL- -1 1 NaOH NaOH 溶液调溶液调pH pH 至至7.4)7.4)的麦氏浴槽中，加负的麦氏浴槽中，加负荷荷1g1g，稳定，稳定1h1h，期间每，期间每20min20min换换1 1次台氏液：次台氏液： 连接多导记录仪，调节灵敏度，记录血管的连接多导记录仪，调节灵敏度，记录血管的张力变化。张力变化。v待张力曲线基线稳定后，加入待张力曲线基线稳定后，加入1.25 mgmL1.25 mgmL-1-1盐盐酸去氧肾上腺素溶液酸去氧肾上腺素溶
18、液0.05 mL0.05 mL于麦氏浴槽中使其于麦氏浴槽中使其终浓度为终浓度为6.256.251010-5-5 mgmL mgmL-1-1 ，曲线升高至最，曲线升高至最高并稳定后，开始按累计浓度给药法高并稳定后，开始按累计浓度给药法( (曲线稳定曲线稳定后对倍增加样品浓度为：后对倍增加样品浓度为：6.256.251010-5-58.08.01010-2-2 RUmL )RUmL )加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定1 h1 h，期问每期问每20 min20 min换换1 1次台氏液。待
19、基线稳定后，次台氏液。待基线稳定后， 按按测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结果。测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下式计算样品效价：样品效价式计算样品效价：样品效价= =对照品效价对照品效价样品样品半效稀释倍数对照品半效稀释倍数半效稀释倍数对照品半效稀释倍数 利用动物体内某些指标变化，定出利用动物体内某些指标变化，定出产品的单位，如产品的单位，如EPOEPO活性测定，体内注射活性测定，体内注射EPOEPO后，计算小鼠网织红细胞增加的数量后，计算小鼠网织红细胞增加的数量与标准品比较，确定其活性单位。
20、与标准品比较，确定其活性单位。 基于产品与某种物质的结合或产品基于产品与某种物质的结合或产品本身的化学反应为原理设计，具有简便、本身的化学反应为原理设计，具有简便、精确、稳定等特点，如重组链激酶、葡精确、稳定等特点，如重组链激酶、葡激酶生物活性测定，链激酶、葡激酶和激酶生物活性测定，链激酶、葡激酶和纤溶酶原（纤溶酶原（h-plgh-plg）结合形成复合物激活）结合形成复合物激活游离游离h-plgh-plg原为有活性的纤溶酶。原为有活性的纤溶酶。 利用制品免疫原性，制备相应单克隆抗利用制品免疫原性，制备相应单克隆抗体或多克隆抗体，采取体或多克隆抗体，采取 ELISA ELISA 法测定其含量。法
21、测定其含量。生物学活性测定方法选择生物学活性测定方法选择体内测定和体外测定方法体内测定和体外测定方法 a a、体内测定：即整体动物测定，能为较大、体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择体外测定方法。情况下倾向于选择体外测定方法。 b b、体外测定：可使用分离的器官或组织、体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法续
22、生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。易使用和便于统计分析。生物学活性测定方法选择生物学活性测定方法选择2 2、定量、半定量、定性方法、定量、半定量、定性方法 a a、通过研究首先选择能够定量评价的方、通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、可重复的剂量对相关产品有陡峭的、可重复的剂量- -反应反应曲线；其次考虑半定量方法（如曲线；其次考虑半定量方法（如NGFNGF），最），最后考虑定性（如后考虑定性（如BMP
23、BMP）方法。）方法。 b b、对生产工艺稳定，生物学活性测定方、对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用生长激素用HPLCHPLC定量方法代替复杂生物活定量方法代替复杂生物活性测定方法）。性测定方法）。细胞培养法中细胞染色标记方法细胞培养法中细胞染色标记方法 3 3H-thymidineH-thymidine、BrdU BrdU 是反映是反映DNADNA合成、增殖细胞合成、增殖细胞数的比例的。数的比例的。BrdUBrdU：首先用：首先用BrdUBrdU做标记，固定细做标记，固定细胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗胞
24、，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdUBrdU抗抗体发生反应。体发生反应。 MTTMTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物物MTT formazan,MTT formazan,二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO）和酸化的异丙）和酸化的异丙醇或酸化的醇或酸化的SDSSDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法测均能溶解紫色结晶物，通过比色法测定定MTT formazanMTT formazan的量可以反映线粒体电子传递系统的量可以反映线粒体电子传递系统机能，间接
25、表示细胞的生长状态。机能，间接表示细胞的生长状态。 Alamar BlueAlamar Blue：氧化型：氧化型Alamar BlueAlamar Blue（600nm600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。光检测仪检测。 Crystal violetCrystal violet：染活细胞后，在比色计：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（中测定光吸收值（A A），）
26、，A A值与着染色细胞数成值与着染色细胞数成正比。正比。 几种细胞培养测定方法比较几种细胞培养测定方法比较 3H-thymidine BrdU MTT Alamar Blue靶向物靶向物 DNA合成系统合成系统 线粒体电子传递系统线粒体电子传递系统检出细胞的状态检出细胞的状态 增殖增殖 增殖、生存增殖、生存检出法检出法 放射活性放射活性 色素、荧光色素、荧光 色素色素 色素、荧光色素、荧光抽出的必要性抽出的必要性 + + + -其他试剂的必要性其他试剂的必要性 + + + -成本（以成本（以MTT为为1时）时）60 80-100（试剂盒）（试剂盒） 1 2缺点缺点 使用同位素使用同位素 不适合
27、不适合 检出大量未增殖检出大量未增殖 检出未增检出未增 浮游细胞浮游细胞 细胞，处理时费力细胞，处理时费力 殖活细胞殖活细胞 生物学活性测定分析方法生物学活性测定分析方法 1 1、用能诱导、用能诱导50%50%最大反应的待测样品最高稀释度最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量为品的量为1 1单位，即以此稀释度的倒数为待测样品单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。所含的单位数。 2 2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。样品的实验结果。活性标准
28、活性标准品品待测样品待测样品稀释度稀释度a ba bA A值值生物学测定基本模式图生物学测定基本模式图蛋白质药物的比活性测定的意义蛋白质药物的比活性测定的意义1 1、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。2 2、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。3 3、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较
29、不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。量情况。4 4、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。生物活性测定标准范围确定生物活性测定标准范围确定1 1、使用验证过的测定和分析方法，并提供、使用验证过的测定和分析方法，并提供用此方法的效价测定平均值和单测定一批误用此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的可信限范围。差的可信限范围。2 2、对于成品的生物活性测定标准，要根据、对于成品的生物活性测定标准，要根据不同方法的
30、特点规定相当标示量的范围，目不同方法的特点规定相当标示量的范围，目前，生物活性的测定方法有四类：动物基础前，生物活性的测定方法有四类：动物基础、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受体）结合法。受体）结合法。 不同生物活性测定方法的规定标准表不同生物活性测定方法的规定标准表 测定方法测定方法 规定标准规定标准动物基础的生物活性测定动物基础的生物活性测定 70%70%130%130%标示量标示量细胞基础的生物活性测定细胞基础的生物活性测定 80%80%120%120%标示量标示量体外酶法的生物活性测定体外酶法的生物活性测定 85%85%115%115%标示量标
31、示量受体结合的生物活性测定受体结合的生物活性测定 85%85%115%115%标示量标示量生物学活性效价测定过程中生物学活性效价测定过程中标准品的作用标准品的作用1 1、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一的标准。的标准。2 2、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间和各种影响测定因素地干扰。和各种影响测定因素地干扰。二、蛋白质纯度检查二、蛋白质纯度检查1 1、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重要指、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重
32、要指标之一。标之一。2 2、按、按WHOWHO规定必须用规定必须用HPLCHPLC和非还原和非还原SDS-PAGESDS-PAGE两种两种方法测定，其纯度都应达到方法测定，其纯度都应达到95%95%以上，有的甚以上，有的甚至要求达到至要求达到99%99%以上。以上。3 3、纯度的检查通常是在、纯度的检查通常是在原液原液中进行。中进行。4 4、方法：非还原、方法：非还原SDS-PAGESDS-PAGE电泳法、电泳法、HPLCHPLC法、毛法、毛细管电泳。细管电泳。非还原非还原SDS-PAGESDS-PAGE电泳法：电泳法： 1 1、银染加样量、银染加样量5ug 5ug （1 110ng10ng）
33、 2 2、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝R-250R-250 加样量加样量10ug 10ug （100ng100ng） 结结 果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的白量应不低于总蛋白量的95%95%或或98%98%。蛋。蛋白质样品在荷质比均一。白质样品在荷质比均一。 HPLCHPLC法：分子筛、反相层析，离子交法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与换层析，尽量采用与SDS-PAGESDS-PAGE原理不同原理不同的反相或离子交换层析，不主张用分子的反相或离子交换层析，不主张用分子筛分析。筛分析。 毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和毛细管电泳：简便、快速
34、、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。分辨率高；价格高、重现性差。 几种检定重组蛋白纯度方法的比较几种检定重组蛋白纯度方法的比较特性特性 HPLC SDS-PAGEHPLC SDS-PAGE、IEF CEIEF CE分离机制分离机制 极性、非极性分配，极性、非极性分配， 电荷、等电点电荷、等电点 电荷等电荷等 分子大小、离子交换分子大小、离子交换 分析所需时间分析所需时间 1010120min 120min 几小时几小时 101030min30min 分辨力分辨力 好好 好好 好好样品体积样品体积 101050ul 150ul 150ul 150ul 150nl 50nl 灵敏度范围灵敏度范围
35、 ng ng ug ngug ngug ug pg pg 定量准确性定量准确性 + + + +分析方式分析方式 紫外、荧光、折射紫外、荧光、折射 紫外（可见、荧光）紫外（可见、荧光） 同同HPLCHPLC 电化学、放射性电化学、放射性 银染、放射自显影银染、放射自显影仪器价格仪器价格 中高中高 低低 中高中高日常消耗日常消耗 低低 高高 低低自动化自动化 中高中高 低低 中高中高人力操作人力操作 低低 高高 低低制备级制备级 中中 中中 微量级制备微量级制备收集样品收集样品 可以可以 可以可以 较困难较困难 用于研究蛋白质纯度的方法和机制用于研究蛋白质纯度的方法和机制 方法方法 分析机制分析机
36、制 反相反相HPLC HPLC 疏水性疏水性 疏水性相互作用疏水性相互作用HPLC HPLC 疏水性疏水性 毛细管电泳毛细管电泳 荷质比荷质比 离子交换离子交换HPLC HPLC 电荷电荷 等电聚焦等电聚焦 电荷电荷 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电荷比电荷比 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电荷，分子大小电荷，分子大小 分子排阻分子排阻HPLC HPLC 分子大小分子大小 质谱测量法质谱测量法 分子大小分子大小三、蛋白质含量测定三、蛋白质含量测定1 1、此项目主要用于原液比活性计算和成品规格、此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。的控制。2 2、可根据物理化
37、学性质采用、可根据物理化学性质采用Folin-Folin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法法）、）、染色法（染色法（BradfordBradford法法）、双缩脲法、双缩脲法、紫外吸收法、紫外吸收法、HPLCHPLC法和凯氏定氮等方法。法和凯氏定氮等方法。灵敏范围：灵敏范围：5 5100ug/ml100ug/ml；优优 点：简便、灵敏度较高；不同蛋白质点：简便、灵敏度较高；不同蛋白质间的变异少；间的变异少；缺缺 点：受多种物质干扰，反应速度慢，点：受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定。某些试剂不稳定。 BradfordBradford法是采用考马斯亮蓝法是采用考马斯亮蓝-G25
38、0-G250与蛋与蛋白质结合的原理，迅速、灵敏的定量测定白质结合的原理，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法；灵敏范围：蛋白质的方法；灵敏范围：2525200ug/ul200ug/ul，需要时间：需要时间：10min10min。灵敏范围：灵敏范围：0.20.22mg/ml2mg/ml简单、省时简单、省时受光吸收物质影响受光吸收物质影响蛋白浓度（蛋白浓度（mg/mlmg/ml）1.55A1.55A280280-0.76A-0.76A260260 蛋白质常用的定量方法的比较蛋白质常用的定量方法的比较方法方法 所需蛋白质所需蛋白质 破坏破坏 蛋白质蛋白质/ /蛋白蛋白 技术技术 方法的变异方法的变异 的
39、量（的量（mg/mlmg/ml） 与否与否 质变化情况质变化情况 复杂性复杂性 系数（系数（% %）双缩脲双缩脲 0.50.55 5 是是 少少 简单、快速简单、快速 5 5Lowry 0.05Lowry 0.055 5 是是 中等中等 显色慢、试剂多显色慢、试剂多 5 5凯氏定氮凯氏定氮 0.050.053 3 是是 少少 干扰、复杂、慢干扰、复杂、慢 0.1540.154紫外吸收法紫外吸收法 0.050.052 2 否否 大大 简单、快速、简单、快速、 0.4390.439（280nm280nm） 干扰物质多干扰物质多染料结合法染料结合法 0.010.010.05 0.05 是是 中等中等
40、 简单、快速简单、快速 3.753.75荧光法荧光法 0.0010.0010.01 0.01 否否 中等中等 较易较易 3.753.75四、蛋白质药物理化性质的鉴定四、蛋白质药物理化性质的鉴定v特异性鉴别试验特异性鉴别试验v相对分子质量测定相对分子质量测定v等电点测定等电点测定v肽图分析肽图分析v吸收光谱吸收光谱v氨基酸组成分析氨基酸组成分析vN N末端和末端和C C末端氨基酸测序末端氨基酸测序特异性鉴别试验特异性鉴别试验v主要确定蛋白质的抗原性主要确定蛋白质的抗原性v免疫学方法（免疫印迹、斑点免疫、免疫电泳、免免疫学方法（免疫印迹、斑点免疫、免疫电泳、免疫扩散）：根据抗原抗体特异性反应建立的
41、方法。疫扩散）：根据抗原抗体特异性反应建立的方法。v抗体中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鉴抗体中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鉴别试验，该方法简便易行、要求抗体必须为别试验，该方法简便易行、要求抗体必须为中和抗中和抗体体。相对分子质量测定相对分子质量测定v还原型还原型SDS-PAGESDS-PAGE：蛋白质在：蛋白质在SDSSDS和和-巯基乙醇存巯基乙醇存在下沸水浴在下沸水浴5min5min，形成表面带大量负电荷的杆状，形成表面带大量负电荷的杆状分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其相对分子质量相关。程中蛋白迁移
42、率基本只与其相对分子质量相关。v凝胶过滤（分子筛）法：根据蛋白分子大小和性凝胶过滤（分子筛）法：根据蛋白分子大小和性状进行测定。状进行测定。等电点测定等电点测定v重组蛋白质药物的等电点往往是不均一的，重组蛋白质药物的等电点往往是不均一的，但在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，但在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，以说明其生产工艺的稳定性。以说明其生产工艺的稳定性。v方法：等电聚焦电泳法方法：等电聚焦电泳法(IEF)(IEF) 毛细管电泳法。毛细管电泳法。肽图分析肽图分析v肽图肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构做精密比较的手段。质一级结构做
43、精密比较的手段。v蛋白质一般经化学裂解法及蛋白酶裂解后用蛋白质一般经化学裂解法及蛋白酶裂解后用HPLCHPLC、SDS-PAGESDS-PAGE电泳法、质谱法测定。电泳法、质谱法测定。v同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳定性的验证指标。定性的验证指标。吸收光谱吸收光谱v对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的。长是固定的。v在生产工程中每批产品的紫外吸收光谱在生产工程中每批产品的紫外吸收光谱应当一致。应当一致。v重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光谱测定。可不做紫外吸
44、收光谱测定。氨基酸组成分析氨基酸组成分析v采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括蛋采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括蛋白质水解，自动进样、氨基酸分析、定量白质水解，自动进样、氨基酸分析、定量分析报告等。分析报告等。v有柱前衍生法和柱后反应法，前者是氨基有柱前衍生法和柱后反应法，前者是氨基酸先和荧光试剂作用生成衍生物，然后用酸先和荧光试剂作用生成衍生物，然后用色谱柱进行分离，检测氨基酸衍生物的荧色谱柱进行分离，检测氨基酸衍生物的荧光；后者是氨基酸先用色谱柱分离，再与光；后者是氨基酸先用色谱柱分离，再与茚三酮、荧胺等试剂显色后进行分析检测。茚三酮、荧胺等试剂显色后进行分析检测。N-N-末端和末端和C-
45、C-末端氨基酸测序末端氨基酸测序v作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要求至少测定一般要求至少测定N-N-末端末端1515个氨基酸、个氨基酸、C-C-末端末端1 13 3氨基酸。氨基酸。五、蛋白质的二硫键分析五、蛋白质的二硫键分析v二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，发生错误配对，不但活性降低而相关，发生错误配对，不但活性降低而且会引起抗原性增加。且会引起抗原性增加。六、对糖蛋白的特殊要求六、对糖蛋白的特殊要求v评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，应考虑糖基化位点的上调或下调及其对应考虑糖
46、基化位点的上调或下调及其对生物活性、代谢、稳定性、溶解性的影生物活性、代谢、稳定性、溶解性的影响。每一种真核细胞具有其独特的糖基响。每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称为它的糖类型，通过基因工程化能力称为它的糖类型，通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同等形成时由于一些寡糖的精细结构不同等而产生截然不同的糖蛋白。而产生截然不同的糖蛋白。七、残余杂质检测七、残余杂质检测 1 1、对残余杂
47、质进行限制的意义、对残余杂质进行限制的意义 a a、残余杂质可能具有毒性，引起安全、残余杂质可能具有毒性，引起安全性问题；性问题； b b、可能影响产品的生物学活性和药理、可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质；作用，或使产品变质； c c、反映产品生产工艺的稳定性。、反映产品生产工艺的稳定性。残余杂质检测残余杂质检测 2、残余杂质分类、残余杂质分类 a、外来污染物：微生物、热原、细胞、外来污染物：微生物、热原、细胞成分（蛋白质、成分（蛋白质、DNA等）、培养基成分、等）、培养基成分、纯化步骤引入的成分（亲和柱中的抗体、纯化步骤引入的成分（亲和柱中的抗体、增溶用的增溶用的SDS）等；
48、）等； b、与产品相关的杂质：突变物、错误、与产品相关的杂质：突变物、错误裂解物，二硫化物异构体、二聚体和多裂解物，二硫化物异构体、二聚体和多聚体；化学修饰形态（脱酰氨基或氧化聚体；化学修饰形态（脱酰氨基或氧化形式、其他降解产物）形式、其他降解产物）残余杂质检测内容残余杂质检测内容v宿主细胞蛋白含量宿主细胞蛋白含量v宿主细胞宿主细胞DNADNAv鼠源型鼠源型IgGIgG含量（含量（10ng/10ng/剂量）剂量）v蛋白蛋白A A含量含量v小牛血清残留量小牛血清残留量v残余抗生素（氨苄西林）残余抗生素（氨苄西林）v内毒素含量（内毒素含量（LALLAL）v产品相关物质产品相关物质v其他杂质（加入的
49、离子、其他杂质（加入的离子、SDSSDS、甲醛、甲醛等）等）宿主细胞蛋白含量宿主细胞蛋白含量v以双抗体夹心以双抗体夹心ELISAELISA为宜，尽量不用斑为宜，尽量不用斑点免疫。点免疫。v常采用常采用5 5种最常用的种最常用的E.coliE.coli菌株混和作菌株混和作为为ELISAELISA测菌体蛋白含量的通用标准。测菌体蛋白含量的通用标准。v不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。 来自来自E.coliE.coli菌株的产品为不大于菌株的产品为不大于0.1%0.1%；来自来自CHOCHO细胞的产品为细胞的产品为不大于不大于0.05%0.05%。宿主细胞宿主细
50、胞DNADNAv测定方法：采用测定方法：采用DNADNA杂交实验，用固相斑杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记者用同位素标记DNADNA探针进行测定，必须探针进行测定，必须提供相应宿主细胞提供相应宿主细胞DNADNA标准品。标准品。v现行生物制品规程对宿主细胞现行生物制品规程对宿主细胞DNADNA残留量残留量标准作了相应调整：标准作了相应调整： 由小于由小于100pg/100pg/剂量调整为剂量调整为小于小于10ng/10ng/剂量。剂量。v宿主细胞宿主细胞DNADNA只作为一种细胞污染因素不只作为一种细胞污染因素不作为一种作为一
