1、蛋白质结构测定蛋白质结构测定2019-3-30蛋白质三维结构测定方法及数量蛋白质三维结构测定年增长图第一节：第一节：X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定n原理n基本过程基本过程n优缺点优缺点n应用实例应用实例一、相关原理n光的衍射现象nX射线的发现及应用n本质的争论nX射线衍射的发现n晶体学基础知识nX射线晶体衍射?S光线光线拐弯了！拐弯了！1.1.光的衍射现象光的衍射现象ESES当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就发生明显的衍射现象如果缝很宽，其宽度远大于波长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象就很不明显了 惠更斯惠更斯菲涅耳原理菲涅耳原
2、理菲涅耳菲涅耳补充：从同补充：从同一波阵面上各点发一波阵面上各点发出的子波是相干波。出的子波是相干波。 1818年年惠更斯：惠更斯：光波阵面光波阵面上每一点都可以看上每一点都可以看作新的子波源，以作新的子波源，以后任意时刻，这些后任意时刻，这些子波的包迹就是该子波的包迹就是该时刻的波阵面。时刻的波阵面。 1690年年解释不了光强分布！解释不了光强分布！ 2. X射线的发现历程及应用n失之交臂q1836 法拉第 发现阴极射线q1861 克鲁克斯 阴极射线管在放电时会产生亮光 干版和光片有问题？q1890 古德斯柏德 洗出了一张X射线的透视底片 照片的冲洗药水或冲洗技术 n发现X射线n本质的争论n
3、X射线衍射2.X射线的发现及应用n1895年 伦琴（Roentgen）发现故称为伦琴射线。伦琴夫人的手的X射线照片X射线在医学上的应用n伦琴的新发现轰动了全世界, 不到三个月, 维也纳的一家医院便拍出了应用于医疗的X射线照片.从此, X射线拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。n为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也就是已被广泛应用的CT。X射线与诺贝尔奖物理学奖n伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。n1903 年诺贝尔物理学
4、奖。n1906 年的诺贝尔物理学奖。n劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。n英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。n英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。n瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物理学奖。n美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。n前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖;n美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖;n瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。化学奖n荷兰的物理化学家德拜1936 年诺贝尔化学奖。n美国著名化学家鲍林1954 年诺贝尔化学奖。n英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962 年诺贝尔化学奖。n英国女化学家霍奇金1964 年诺贝尔化学奖。n美
5、国化学家利普斯科姆1976 年诺贝尔化学奖。n英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980 年诺贝尔化学奖。n英国生物化学家克卢格因1982 年诺贝尔化学奖; n美国化学家豪普特曼和卡尔1985 年诺贝尔化学奖;n1988 年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。3.X射线本质的争论X射线本质的争论-波动说巴克拉： X射线波动性 标识谱线：不管元素已化合成什么化合物，它们总是发射一种硬度的X射线，当原子量增大时，标识X射线的穿透本领会随着增大。这说明X射线具有标识特定元素的特性。X射线本质的争论微粒说X射线微粒论者 粒子具有旋转性 布拉克父子4.X射线衍射X射线衍射的获得n波长范围：100.
6、1埃n欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常数恰是这样的线度n衍射波的两个基本特征衍射线（束）在空间分布的方位（衍射方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。nX射线晶体结构分析？射线晶体结构分析？ 使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。5.X射线的获得：X射线管激光等离子体同步辐射X射线激光6.晶体基础n什么是晶体n晶体的周期排布n晶体的对称性3.1什么是晶体n固体物质q晶体n相当罕见的东西？q非晶体n晶体晶体(Crystal )指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复排列形成的、能
7、够给出明锐衍射的固体结构。 晶体什么样（1）晶体什么样（2）晶体什么样（3）晶体什么样（4）2.晶体和点阵结构n晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成“点阵”来研究. q一维周期性结构与直线点阵一维周期性结构与直线点阵q二维周期性结构与平面点阵二维周期性结构与平面点阵q三维周期性结构与空间点阵三维周期性结构与空间点阵一维周期性结构与直线点阵一维周期性结构与直线点阵 二维周期性结构与平面点阵二维周期性结构与平面点阵三维周期性结构与空间点阵三维周期性结构与空间点阵 n晶胞晶胞(Unit cell)空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。同一个空间点阵，划分平行六面体
8、的方式是多种多样的。同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。n选择平行六面体的选择平行六面体的原则原则：q所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。q 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体q 所选平行六面体之体积应最小。所选平行六面体之体积应最小。 q 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六面体。面体
9、。单位平行六面体，单位平行六面体，a、b、c 、 、 、 是表征它本身形状、是表征它本身形状、大小的一组参数，称为大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数格子参数或点阵参数。cab 单位平行六面体参数单位平行六面体参数单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角坐标轴之间坐标轴之间交角交角。 a、b、c 轴单位轴单位。a、b、c、 、 、 关系有关系有七种情况七种情况，与单位平行六面体，与单位平行六面体七种格七种格子相对应子相对应。 a=b=c = = =90o a=b=c = = 90o， 60， 109o2816 a=b c = = =90o a=bc = =90
10、o =120o a b c = = =90o a b c = =90o 90o a b c 90o按结点位置，可有按结点位置，可有四种四种不同的类型：不同的类型：P 原始格子原始格子（角顶角顶）C 底心格子底心格子（角顶、顶底面角顶、顶底面）I 体心格子体心格子（角顶、体心角顶、体心）F 面心格子面心格子（角顶、每个面角顶、每个面）P 原始格子原始格子（角顶角顶）C 底心格子底心格子（角顶、顶底面角顶、顶底面）I 体心格子体心格子（角顶、体心角顶、体心）F 面心格子面心格子（角顶、每个面角顶、每个面）结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说，结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说
11、，格子的种类有、且只有十四种。格子的种类有、且只有十四种。衍射方向二、X射线晶体结构测定基本过程蛋白质获取（提纯）晶体生长并经冷冻技术处理重原子衍生物制备衍射数据收集衍生数据分析和改进结构模型的获取（包括修正） （2）晶体生长过程及影响因素n晶核（尽量少）n微晶（可用作晶种）n晶体在数小时至数月后出现n2个问题：n是盐晶吗？能给出有用的衍射吗？（多晶/双晶）n影响因素影响因素v物理因素：温度、压力、震动、溶剂清洁度、试剂纯度、重力、外加物理场等v生物化学因素：pH、离子强度、沉淀剂/添加剂的类型和浓度等v其他：溶液过饱和度、纯度等“经验经验” “机器人机器人”（2）晶体生长过程及影响因素（3）
12、结晶方法）结晶方法n批量结晶法 batch crystallizationn透射法 crystallization by dialysisn液相扩散法 liquid diffusionn气相扩散法vapor diffusionn氢氘交换质谱技术Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMSn生物玻璃bioglass（4）晶体的初步鉴定小分子晶体小分子晶体蛋白质晶体蛋白质晶体边界边界完整，漂亮常不完整，易出现多晶硬度硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉脱水脱水不变化因脱水而变坏溶解性溶解性慢快偏光性偏光性强相
13、对弱染色性染色性弱强漂浮性漂浮性下沉漂浮（5）衍射数据收集）衍射数据收集n晶体的处理：低温液氮气冷流技术n数据收集仪：底片、面探测器衍射分析仪器的发展n射线种类：连续射线 特征射线 电子衍射 中子衍射 探测技术：胶片 闪烁体计数器（点） （IP）CCD探测器（面） 图图2-22 2-22 石英的衍射仪计数器记录图（部分）石英的衍射仪计数器记录图（部分）*右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（hkl）值，代表K衍射底片（外森堡相机、徘循相机）n优点：多点同时收集容易保存价格便宜q缺点o存在“化学雾”背景和X射线散射背景o费时、费力计数管（四圆衍射仪）n将X射线光子强度转换为电信号，信号放大后再转换
14、成数字存入计算机随时调用n逐点收集数据n优缺点与底片相反面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪衍射仪Smart CCD OverviewSMART APEX-CCD探测器探测器n金属丝构成的面板，可同时多点收集n将X射线光子强度转换为电信号n集计数管的精确和底片的多点收集效率面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪衍射仪图像板image platen面探测器的改进n由化学材料构成，整块板子密度一致n高分辨率n可见光下可测量n集底片和面探测器的优点于一身（6）数据分析n电子密度修饰n电子密度图诠释n结构模型精化n数据处理软件：Denzo, Scalepack三、X射线晶体结构测定优点n
15、分辨率高n不损伤样品n无污染n相对快捷n能得到晶体完整性的大量信息n晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；n很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）nX射线晶体衍射的工作流程较长。 四、X射线晶体结构测定存在问题Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDTn于1971年和1972年分别得到分辨率为2.5埃和1.8埃的猪胰岛素晶体测定，这是中国阐明的第一个蛋白质的三维结构。猪胰岛素(蛋白质编号4ins)的两条小链“中国蛋白质晶体学研究水平和世界发达国家一样高！胰岛素晶体最好的电子密度图在北京，不在牛津。” 多萝西
16、霍奇金 ，1972五、应用实例五、应用实例1.胰岛素2.菠菜捕光蛋白LHC II（膜、疏水，2.72）Nature, 2019, Mar.LHC-IILHC-II是绿色植物中含量最丰富的主要捕光复合物，这种复杂的分子体系镶嵌在生物膜中，具有很强的疏水性，难以分离和结晶。对其晶体结构的测定是国际公认的高难课题，也是一个国家结构生物学研究水平的重要标志。03年利用北京同步辐射实验室生物大分子晶体学线站获得了该晶体的高分辨率衍射数据，最终获得2.72分辨率的晶体结构。发表于发表于Nature2019年年3月月18日作为封面文章日作为封面文章Chang et al., Nature 428, 287 (2019)意义：发现了膜蛋白结晶的第三种类型，提供了近3万个独立、精确的原子坐标复习思考题n简述X射线晶体结构测定的基本过程。n了解晶体鉴定的基本要点。n熟悉X射线晶体结构测定的优缺点。
