1、实验七实验七污水中噬菌体的分离、纯化与效污水中噬菌体的分离、纯化与效价测定价测定实验目的实验目的掌握噬菌体分离的基本原理和方法学会观察噬菌斑了解噬菌体纯化、效价测定方法基本原理噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性温和噬菌体和烈性噬菌体烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定噬菌斑的形成 在固体琼脂培养基上，噬菌体感染细菌后，在宿主细胞内进行核酸和蛋白质的生物合成，最后装配成噬
2、菌体完整的颗粒，通过裂解宿主细胞释放出来，使感染的细菌不能生长，从而形成肉眼可以观察到的透明或浑浊的空斑，称为噬菌斑。噬菌体的初次分离将可能含有宿主菌的材料在液体培养基中过夜培养，然后将液体培养液过滤除菌，滤液备用。将宿主菌涂布在平板表面，自然干燥。取滤液10l滴在平板上，过夜培养，如果有针对该宿主菌的噬菌体，则可以看到透亮的抑菌圈。问题如果采用这种方法，看不到抑菌圈，可以如果采用这种方法，看不到抑菌圈，可以说明的是哪些情况？说明的是哪些情况？如何进行噬菌体的纯化挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液体培养基，并加入相同指示菌，重复上述从加入氯仿开始的各个试验步骤，得到噬菌斑重复多次，可以得到由
3、一个噬菌体的后代形成的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。观测噬菌斑的特征如何测定噬菌体的效价效价指1ml培养液中所含有活的噬菌体的数量采用双层琼脂平板法，进行噬菌斑的计数，计量单位为pfu，即，即plaque forming unit(噬菌斑形成单位）。获得的噬菌体滤液作10倍的倍比递减稀释取每个稀释度噬菌体0.1ml加入0.9ml的指示菌，混匀后，加入到上层琼脂，倾注平皿，选择30300个pfu的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体原液的效价。噬菌体的分离操作程序于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本污水样本200ml和大肠杆菌指示菌2ml 37C培养8小时取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液
4、体培养基，并加入125ul丝裂霉素丝裂霉素，37 C培养18小时。无菌取上述培养液无菌取上述培养液1ml于于1.5ml Eppendrof管中，加管中，加入入200ul氯仿后振荡氯仿后振荡15min，4 C 4000g离心离心20min，上清过滤，取滤液。上清过滤，取滤液。培养指示菌大肠杆菌培养指示菌大肠杆菌MC1061 18小时小时将细菌涂布在平板培养基表面，然后将滤液滴加到平将细菌涂布在平板培养基表面，然后将滤液滴加到平板表面，过夜培养，观察结果。板表面，过夜培养，观察结果。肉眼如何判定噬菌体是否已经纯化？每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌体，要获得单
5、一的噬菌体，必需进行噬菌体，要获得单一的噬菌体，必需进行噬菌体的纯化。体的纯化。噬菌体效价的测定（以下开始自己做）噬菌体效价的测定（以下开始自己做）仔细观察提供的平皿，选取边缘清晰的单个噬菌斑仔细观察提供的平皿，选取边缘清晰的单个噬菌斑用灭菌移液器枪头轻轻挑取噬菌体斑到装有用灭菌移液器枪头轻轻挑取噬菌体斑到装有1ml培养培养液的液的1.5ml Eppendrof管中，管中，震荡震荡2-3分钟分钟。采用采用1ml 针筒吸取针筒吸取1ml 混合液，于混合液，于0.22um滤膜过滤。滤膜过滤。滤液收集在一个新的无菌滤液收集在一个新的无菌1.5ml Eppendrof管中，管中，获获得噬菌体滤液的原液
6、。得噬菌体滤液的原液。每组取7个个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 10-1-1、10-2-2、 至至 10-7-7。每个每个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体滤液中取100ul 于10-1-1离心管中，混匀后混匀后，取100ul 于10-2-2离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至-7。（一个移液枪头用到底）操作程序另取4支支无菌的Eppendrof离心管，分别标记10-6 -6 、 10- -5 5、10-4-4、 10-3-3（注意次序）（注意次序），从上述相对应的各稀释管中分别取300ul 噬菌体液，然后各管加300ul 指示菌，37 C温箱15
7、min。（每组可以使用4个个移液枪头，注意次序，不能混淆 ）取上层琼脂，融化并孵育在取上层琼脂，融化并孵育在48C（已经融化），每人（已经融化），每人1支，加入上述支，加入上述10-6 -6 、 10-5-5、10-4-4、 10-3-3其中一个稀释其中一个稀释度的度的噬菌体与细菌的混悬液噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀，轻轻混匀5min。（。（特别特别注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂会凝固，但注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂会凝固，但琼脂不能太烫，不能剧烈振荡琼脂不能太烫，不能剧烈振荡）立即倒入底层琼脂平板立即倒入底层琼脂平板，室温，室温510分钟，待上层凝固分钟，待上层凝固后，将
8、平板倒置，作好标记。后，将平板倒置，作好标记。37 C 18小时观察结果小时观察结果记录噬菌斑的数量记录噬菌斑的数量选择选择30300个个pfu的平皿计算每毫升未稀的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体原液的效价。释的噬菌体原液的效价。与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应，与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应，计算噬菌体的含量计算噬菌体的含量要要 求求星期三星期三(四）四） 12：00观察结果观察结果描述噬菌斑特征，并计数描述噬菌斑特征，并计数（包括噬菌斑的分布数量、形态特征）（包括噬菌斑的分布数量、形态特征）实验报告实验目的实验目的实验原理实验原理实验步骤实验步骤结果与分析结果与分析思考题思考题lp39 (1) 、 (2)、 (4) 、 (5)下次实验下次实验l实验实验 动物病毒的培养动物病毒的培养
