1、人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、分析和应用Fei Zhou肿瘤研究模型 多样化的肿瘤研究模型 病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞 永生化的肿瘤细胞系 2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活） 来源于肿瘤细胞系的移植模型 来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型 Patient Derived Tumor Xenograft1新传统模型：肿瘤细胞系 可以很方便的在体外进行培养和实验 缺点： 在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞逐渐适应体外培养环境而失去原有特性 缺乏肿瘤相关的生长环境 支持性的非肿瘤基质 血液细胞，免疫系统的交互 其他肿瘤微环境因子2肿瘤研究模型 使用传统的肿瘤研究模型没能取
2、得临床上的成功！ 肿瘤的多样化和异质性 研究模型与临床病人缺乏相关性34PDX模型技术流程图Modified Fig from Oncodesign Biotechnology为什么使用PDX模型？ 优势 没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选” 能搞保持肿瘤原有特性和异质性 在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定 保留了原有的非肿瘤基质和微环境 可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究5PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！使用PDX模型 劣势 仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互 可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统 在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐渐取代 使用较低代数的PDX模型
3、进行研究 需要相对便捷的临床肿瘤样本来源 技术水平上有挑战性 移植 + 分析（包括生物信息学平台） 建立和维持的成本较高 相对的建成之后的使用价值也非常高6 PDX模型的建立 PDX模型的分析 PDX模型的应用7PDX模型的建立 关键点 肿瘤宿主 肿瘤接种 肿瘤的冻存和复苏8宿主品系9小鼠品系免疫缺陷NudeT淋巴细胞严重缺失SCIDSevere Combined ImmunodeficiencyT淋巴细胞和B淋巴细胞缺失NOD-SCIDNon-obese Diabetic SCID与普通SCID相比NK细胞活性低，更低的免疫恢复几率NSGNOD-SCID-IL2R-/-缺失T淋巴细胞，B淋巴
4、细胞和NK细胞宿主品系 目前并没有针对不同品系宿主的完整比较 移植瘤生长时间 接种成功率 移植瘤遗传学特性 移植瘤组织学特性 移植瘤传代的稳定性 模型建立情况与肿瘤类型相关 荷瘤小鼠的饲养 设施要求（常规为SPF级IVC饲养） 完善的IACUC政策10肿瘤接种 皮下接种11Norman E. Sharpless and Ronald A. DePinho, et al. Nature Review Drug Discovery 2006肿瘤接种 使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种12Xiaomei Zhang, et al. Current Protocols in Mouse Bio
5、logy 2013肿瘤接种 原位接种 常用途径：肾包膜下接种(Sub-Renal Capsule, SRC)13Peter Eirew, et al. Nature Protocols 2010肿瘤组织的冻存和复苏 冻存液 胎牛血清 + 10% DMSO 保存条件 -80oC：6周 液氮：长期保存 从冻存条件下复苏 37oC水浴快速解冻14肿瘤组织的冻存和复苏 通过冻存和复苏可以： 在获得患者知情同意书之前保存样本 保有备份样本进行重复实验15 PDX模型的建立 PDX模型的分析 PDX模型的应用16PDX模型的分析 目的 说明移植瘤与原瘤的相似性 确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定 为PDX
6、模型的应用提供数据支撑17需要保存的材料 基因组DNA 使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取 如：排除坏死区域等 冷冻保存 总RNA 避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存 包含mRNA和miRNA 蛋白样本（组织裂解液） 处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂 冷冻保存18生物样本库分析内容 常规 临床背景 患者年龄/性别； 肿瘤类别，原位瘤/转移瘤； 治疗史 移植瘤分析 生长曲线； 药理学特性 针对特定药物处理的反应 组织学和分子生物学分析 原瘤 vs. 移植瘤19分析内容 组织学 病理学染色（HE染色） 确认肿瘤组织结构20头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性Peng et al.
7、 Journal of Translational Medicine 2013分析内容 组织学 免疫组织化学染色 （IHC） 常规标记（如细胞增殖、凋亡） 移植的生物标记物（Her2, EGFR, KRAS等蛋白） 研究者感兴趣的蛋白21Dong Lin, et al. Cancer Res 2013神经内分泌前列腺癌PDX模型维持了原瘤的蛋白标记分析内容 组织学 组织芯片(Tissue Micro-Array , TMA)22Guido Sauter, et al. Nature Review Drug Discovery 2003分析内容 分子水平 DNA 基因序列 第二代测序平台：Ill
8、umina HiSeq等 基因突变 Sequenom OncoCarta Panels V1-3 V1：涵盖19个常规癌基因的238个突变位点 V2：涵盖18个癌基因或癌抑制基因的152 个突变位点 V3:：涵盖22个癌基因的105个突变位点 整理过的基因突变数据23分析内容 分子水平 外显子组测序 外显子捕获 Roche SeqCap EZ Agilent SureSelect Illumina TruSeq 使用第二代测序平台进行外显子组测序 需要有整合的生物信息学分析平台 针对PDX模型对二代测序结果分析进行优化 对识别变体的方法进行优化和验证 根据需要开发个性化的数据分析方法24分析内
9、容 分子水平 外显子组测序25 右图为Oncotest公司使用外显子组测序结合生物信息学分析方法整理出的23个PDX模型中507个癌症相关基因的突变频率。 每一个扇区代表了一种肿瘤类型；热度图指示了该肿瘤类型中某个基因的突变频率。Krzywinsky, M. et al. Circos: an Information Aesthetic for Comparative Genomics, Genome Res (2009) 19:1639-1645分析内容 分子水平 RNA 基因表达谱 Affymetrix HG-U133 plus 2.0 Array 单核苷酸多态性(SNP)和拷贝数变异分析
10、 Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array V6.0 miRNA表达数据 miRNA array26分析内容 分子水平 蛋白表达（蛋白标记） 蛋白免疫印迹 Western Blot 免疫组织化学染色 IHC 荧光原位杂交 (FISH)27肝癌PDX模型的蛋白表达分析。 Hung Huynh, et al. Cancer Res 2006 PDX模型的建立 PDX模型的分析 PDX模型的应用28 新药开发和筛选 研究PDX模型对于药物处理的反应 分子标记物开发(Biomarker) 药物反应 分子生物学机制 个性化治疗 分子生物学机制 针对性的治疗方案29PDX模型的应用PDX模型的应用30建立PDX模型进行生物标记物的开发来实验个性化治疗 Tentler, J. J. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. (2012) PDX模型的应用 分子标记物(Biomarker)的开发流程31Training Set评估药物反应分析分子生物学特性生物信息学/统计学分型Development确认方法适用性校准标记物表达水平确认检测方法相关参数和阈值Preclinical根据生物标记物设计相关的临床实验使用非临床实验进行预试Validation在PDX模型上测试生物标记物在临床实验中确认药物作用
