1、2013动物疫病检测新技术暑期培训国标ND抗体测定技术山东畜牧兽医职业学院山东畜牧兽医职业学院 朱明恩朱明恩2013动物疫病检测新技术暑期培训 国标：新城疫诊断技术（GB/T 16525-2008） 2009-05-01实施本技术依据中华人民共和国国家标准制定2013动物疫病检测新技术暑期培训 是开设畜牧兽医类专业学校学生的必会技能 是新城疫抗体监测和诊断的重要手段 是2011和2012年全国农业技能大赛的比赛项目，据 说还将是2014年全国农业技能大赛的比赛项目安排本内容的原因2013动物疫病检测新技术暑期培训新城疫抗体测定基本操作规程制备被检血清制备1%RBC悬液HA试验，测病毒的血凝价配
2、制4单位病毒HI试验，测血清的抗体滴度抗体滴度报告，以nlog2形式报告2013动物疫病检测新技术暑期培训仪器及材料 非免疫公鸡、 pH7.2生理盐水、 新城疫标准抗原、新城标准阳性血清、新城标准阴性血清、 3.8%的枸橼酸钠、96孔V型板、微量移液器、吸头、微型振荡器、温箱、离心机、天平、采血器等。2013动物疫病检测新技术暑期培训 心脏或静脉采血2-3mL（不加抗凝剂），采血后使血液在 采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3 小时或4冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血 清析出。 血清为淡黄色透明液体。 一、制备被检血清一、制备被检血清2013动物疫病检测新技术暑期培训翅
3、静脉采血翅静脉采血 针头在静脉血管一侧倾斜刺入皮肤，再与血管平行进针后刺入血管，见有少量回血即可采集血液，采血完成后马上用手压迫止血。 2013动物疫病检测新技术暑期培训心脏采血心脏采血 鸡右侧卧保定，上腿自然踡曲，在上腿膝关节稍前下方约1cm处（心脏搏动最明显的部位）垂直地面进针采血。 2013动物疫病检测新技术暑期培训二、制备二、制备1RBC悬液悬液 1. 1. 制备抗凝血制备抗凝血 在采血器（注射器）中吸入抗凝剂（3.8%的枸橼酸钠，抗凝比例为1：10），心脏或静脉采血3-4mL，颠倒采血器使血液与抗凝剂充分混匀，然后将血液注 入离心管中，用。2013动物疫病检测新技术暑期培训1离心管、
4、离心套管和管中液体作为一个整体进行配平2离心管中液体不能太满配平注意事项配平注意事项2013动物疫病检测新技术暑期培训 2. 2. 离心洗涤红细胞离心洗涤红细胞 （1）共洗涤3次，转速和时间均为：2000r/min、5min。 （2）第1次离心时间到，用移液器吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板，加生理盐水，吹打混匀红细胞，配平后进行第2次离心，依此进行第3次离心。 （3）第3次离心时间到，吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板后，读出离心管中红细胞的体积 。 注意：吹打混匀红细胞时不要太用力，以免破坏红细胞。注意：吹打混匀红细胞时不要太用力，以免破坏红细胞。2013动物疫病检测新技术暑期培训2013动
5、物疫病检测新技术暑期培训离心机的使用 离心机放置平稳 离心管对称放入离心机，使其处于平衡状态 按档位依次升高转速至所需速度。离心时间到，将转 速调为零，离心机停转后方可取出离心管。2013动物疫病检测新技术暑期培训 3. 配制配制1%RBC悬液悬液 根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。 注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。2013动物疫病检测新技术暑期培训红细胞凝集（红细胞凝集（HAHA现象）现象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒血凝性病毒 有相应
6、受体的红细胞有相应受体的红细胞RBC血凝素纤突受体v血凝素纤突三、血凝试验（三、血凝试验（HAHA）1基本原理2013动物疫病检测新技术暑期培训孔号孔号1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212病毒稀释倍数生理盐水标准抗原 生理盐水 1%RBC悬液 2 21 1 2 22 2 2 23 3 2 24 4 2 25 5 2 26 6 2 27 7 2 28 8 2 29 9 2 21010 2 211 11 对照25 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 252525 2525
7、 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 弃弃252525 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 2525 25 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 2525 振荡混匀，室温即2025下静置40 min后观察结果。若环境温度太高，放4静置60 min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。2操作术式（微量法，单位ul） 新的操作方法和旧版有哪
8、些不同？生理盐水、剂量、 反应条件2013动物疫病检测新技术暑期培训HA试验结果及规律完全不凝集：红细胞呈明显钮扣状沉到孔底完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底不完全凝集：介于两者之间2013动物疫病检测新技术暑期培训2013动物疫病检测新技术暑期培训 病毒的HA价（血凝滴度）：能使红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数称为病毒的血凝价，常用nlog2或1：xxx表示。HA试验成功的关键环节（HI同） 正确使用微量移液器（吸头固定紧，每次都要排空）；吸头不能混用；悬滴加样；混匀要彻底；时间和温度合适。2013动物疫病检测新技术暑期培训HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀
9、释倍数 用生理盐水稀释HA试验的NDV液4单位病毒液HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数用生理盐水稀释HA试验的NDV液HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数4单位病毒液用生理盐水稀释HA试验的NDV液HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数 介绍：回归试验2013动物疫病检测新技术暑期培训回归试验 用4V进行的HA试验（用4个孔），用于检验4V配 制是否正确。 4V配制正确的判定标准： 前2个孔完全凝集，后2个孔不完全凝集，如下图：2013动物疫病检测新技术暑期培训 五、五、血凝抑制试验（血凝抑制试验（
10、HI） 当病毒与相应抗体结合后，病毒凝集红细胞的能力受到抑制，称为病毒的血凝抑制。Ag、Ab不对应不对应RBC抗体抗体红细胞凝集（红细胞凝集（HA现象）现象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCv血凝性病毒血凝性病毒血凝素纤突血凝素纤突RBC 有其受体的红细胞有其受体的红细胞血凝素纤突受体血凝素纤突受体RBCv血凝性病毒血凝性病毒血凝素纤突血凝素纤突vvvv Ag、Ab对应对应HAHIRBC红细胞不凝集（红细胞不凝集（HI现象）现象）RBCvvRBCRBC1反应原理孔孔 号号1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212生理盐水生理盐水被检
11、血清被检血清血清稀释倍数血清稀释倍数4V4V 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 5050 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃弃2525 2 21 1 2 2 2 2 2 23 3 2 24 4 2 25 5 2 26 6 2 27 7 2 28 8 2 29 9 2 21010 病毒病毒 盐水盐水 对照对照 对照对照 25 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2
12、5 25 25 25 25 25 轻叩反应板使反应物混合均匀，室温即轻叩反应板使反应物混合均匀，室温即20202525下静置不少于下静置不少于30min30min，44静置不少于静置不少于60min60min。1%RBC1%RBC悬液悬液252525252525252525252525 振荡混匀，室温即振荡混匀，室温即20202525下静置下静置40min40min后观察结果。若环境温度太高，放后观察结果。若环境温度太高，放44静置静置60min60min。生理盐水。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。HI试验操作术式（微量法，单位u
13、l） 注意：除被检血清外，标准阳性和标准阴性血清各做一排。HI试验结果及规律完全不凝集：红细胞呈明显钮扣状沉到孔底完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底不完全凝集：介于两者之间2013动物疫病检测新技术暑期培训血清的血凝抑制价：能使4V凝集红细胞的能力受到完全抑制的血清最大稀释倍数称该血清的血凝抑效价（HI价、抗体滴度、抗体效价）。请对左侧的结果进行抗体滴度报告2013动物疫病检测新技术暑期培训结果判定（新城疫抗体测定）结果判定（新城疫抗体测定） 在生理盐水对照孔出现正确结果（红细胞完全流下）的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，正确判读被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清的HI效价，以nLog2方式报告结果，并填写结果报告单。 只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。 HI滴度可以作为强毒感染和免疫监测验重要依据。当HI滴度9log2或HI滴度明显高低不齐，可怀疑为新城疫强毒感染。2013动物疫病检测新技术暑期培训细节决定成败2013动物疫病检测新技术暑期培训不当之处，敬请批评指正不当之处，敬请批评指正谢谢 谢谢
