1、第五单元微生物分离纯化及鉴定技术模块二模块二 微生物鉴定技术微生物鉴定技术模块一模块一 纯培养的分离方法纯培养的分离方法 平板划线法平板划线法 稀释平板法稀释平板法 单细胞挑取法单细胞挑取法 选择培养基分离法选择培养基分离法 小滴分离法小滴分离法 经典分类鉴定法经典分类鉴定法 现代分类鉴定法现代分类鉴定法 快速鉴定和自动化分析法快速鉴定和自动化分析法第五单元第五单元 微生物分离纯化及鉴定技术微生物分离纯化及鉴定技术平板划线法平板划线法一一稀释平板法稀释平板法二二单细胞挑取法单细胞挑取法三三选择性培养基分离法选择性培养基分离法四四获得纯培养的分离方法获得纯培养的分离方法小滴分离法小滴分离法五五
2、将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环挑取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。此法较为简便。平板划线法平板划线法一一 混菌法混菌法是最常用的一种，将待分离的材料作一系列稀释(如10-1、10-2、10-3)，取少许不同稀释液加入无菌培养皿中，再倒入熔化并冷却至45左右的琼脂培养基后，混匀，待培养基凝固后保温培养一定时间即有菌落
3、出现。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。挑取平板上分散的单菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。1. 混菌法（倾注法）混菌法（倾注法）2. 涂布法涂布法稀释平板法稀释平板法二二 这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。单细胞挑取法单细胞挑取法三三 不同微生物需要不同的营养物质，对不同的化学试剂如消毒
4、剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。选择性培养基分离法选择性培养基分离法四四 将长滴管的顶端经火焰熔化后拉成毛细管，然后包扎灭菌备用。将欲分离的样品制成均匀的悬浮液，并做适当稀释。用无菌毛细管吸取悬浮液，在无菌的盖玻片上以纵横成行的方式滴数个小滴。倒置盖玻片于凹载片上，用显微镜检查。当发现某一小滴内只有单个细胞或孢子时，用另一支无菌毛细管将此小滴移入新鲜培养基内，经培养后则得到由单个细胞发育的菌落。 小滴分离法小滴分离法五五模块二模块二 微生物鉴定技术微生物鉴
5、定技术模块一模块一 纯培养的分离方法纯培养的分离方法 平板划线法平板划线法 稀释平板法稀释平板法 单细胞挑取法单细胞挑取法 选择培养基分离法选择培养基分离法 小滴分离法小滴分离法 经典分类鉴定法经典分类鉴定法 现代分类鉴定法现代分类鉴定法 快速鉴定和自动化分析法快速鉴定和自动化分析法第五单元第五单元 微生物分离纯化及鉴定技术微生物分离纯化及鉴定技术p 菌种鉴定的工作步骤：菌种鉴定的工作步骤：获得该微生物的纯种培养物；获得该微生物的纯种培养物；测定一系列必要的鉴定指标；测定一系列必要的鉴定指标；查找权威性的鉴定手查找权威性的鉴定手册。册。p 不同的微生物往往有自己不同的重点鉴定指标。p 不同的微
6、生物使用不同的权威鉴定手册。 p 微生物鉴定技术分成四个不同水平：微生物鉴定技术分成四个不同水平：细胞的形态和习细胞的形态和习性水平；性水平；细胞组分水平；细胞组分水平；蛋白质水平；蛋白质水平；基因组水平。基因组水平。p 经典分类鉴定方法经典分类鉴定方法：以细胞的形态和习性为鉴定指标。p 现代分类鉴定方法现代分类鉴定方法：遗传学分类法、化学分类法、 数值分类鉴定法等。 经典分类鉴定方法经典分类鉴定方法一一鉴鉴 定定 指指 标标形态学特征形态学特征（细胞形态、群体形态）（细胞形态、群体形态）生理生化反应特征生理生化反应特征生活史、对噬菌体的敏感性等生活史、对噬菌体的敏感性等生态学特征生态学特征血
7、清学反应血清学反应l经典分类鉴定法的特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征，而科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。l其鉴定步骤鉴定步骤是：首先在微生物分离培养过程中，初步判定分离菌株大类的归属，然后根据上述经典分类鉴定指标进行鉴定，最后采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表。经典分类鉴定方法经典分类鉴定方法一一鉴鉴 定定 方方 法法现代分类鉴定方法现代分类鉴定方法1.化学分类法2.遗传学分类法3.选择较多的特征进行分类选择较多的特征进行分类应用电泳、色谱、质谱等手段，应用电泳、色谱、质谱等手段
8、，对细菌细胞的化学组成、代谢产对细菌细胞的化学组成、代谢产物及相应的图谱等特征进行分析物及相应的图谱等特征进行分析DNA分析分析 核酸分子杂交同源性核酸分子杂交同源性 16SrRNA数值分类法二二法国生物法国生物-梅里埃集团的梅里埃集团的API20E系统系统 1 Enterotube系统系统 2微孔滤膜大肠菌测试卡微孔滤膜大肠菌测试卡 3微量多项试验鉴定系统微量多项试验鉴定系统 快速鉴定和自动化分析法快速鉴定和自动化分析法三三 API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不
9、同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反应，个别的分隔室可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌。法国生物法国生物-梅里埃集团的梅里埃集团的API20E系统系统 1法国生物法国生物-梅里埃集团的梅里埃集团的API20E系统系统 1法国生物法国生物-梅里埃集团的梅里埃集团的API20E系统系统 1未知细菌的主要过程：将菌液加入每一个分隔室；培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反应变色情况，根据反应判定表（P136），判定各项反应是阳性还是阴性反应；按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值
10、，依次是1、2、4，各组中试验结果判定的反应是阳性者记“”，则写下其所定的数值，反应阴性者记“”，则写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，则能将检验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。法国生物法国生物-梅里埃集团的梅里埃集团的API20E系统系统 1微生物自动化检测和鉴定系统微生物自动化检测和鉴定系统 快速鉴定和自动化分析法快速鉴定和自动化分析法三三通用仪器通用仪器专用仪器专用仪器 气相色谱仪气相色谱仪 高压液相色谱仪高压液相色谱仪 质谱仪等质谱仪等 药敏自动测定仪药敏自动测定仪 生物发光测量仪生物发光
11、测量仪 自动微生物检测仪自动微生物检测仪 微生物菌落自动识别计数仪微生物菌落自动识别计数仪 微生物传感器等微生物传感器等 鉴定系统的鉴定系统的工作原理因工作原理因不同的仪器不同的仪器和系统而异和系统而异 气相色谱仪及高压液相色谱仪、质谱仪这类仪器设备主要利用物理、化学、材料、电子信息等科学和领域中的技术手段对微生物的化学组成、结构和性能等进行精密测量，获得每种微生物的特征“指纹图指纹图”，将未知微生物的特征“指纹图”与已知微生物的“指纹图”比较分析，就能对未知微生物作出快速鉴定。 1. 通用仪器通用仪器 BIOLOG系统系统 BBL Crystal 半自动/自动细菌鉴定系统 VITEK AMS
12、 全自动微生物鉴定和药敏分析系统 PHOENIXTM 系统 MicroScan系统 2. 专业仪器专业仪器 该系统是美国BIOLOG公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统。Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可快速鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内的约2000种微生物。结合16SrRNA序列分析和G+C mol%，可以将未知菌鉴定到种的分类水平。BIOLOG系统系统 BIOLOG系统的鉴定原理是：利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微
13、生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。BIOLOG系统系统BIOLOG系统系统鉴定步骤 使用自动化鉴定仪的局限性使用自动化鉴定仪的局限性 快速鉴定和自动化分析法快速鉴定和自动化分析法三三自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。 通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其他已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其他的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。
