1、第二章第二章 发酵工业微生物菌种发酵工业微生物菌种制备原理与技术制备原理与技术第第 二二 章章第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育第二节第二节 工业微生物种子的扩大培养工业微生物种子的扩大培养第三节第三节 种子培养基及其制备种子培养基及其制备第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏一、工业微生物的特点一、工业微生物的特点我们把用于
2、发酵工业的微生物也叫做工业微生物。我们把用于发酵工业的微生物也叫做工业微生物。工业微生物具备个体小、种类多、繁殖快、分布工业微生物具备个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢强和易变异等特点。广、代谢强和易变异等特点。发酵工程是以微生物的生命活动为中心的，各种发酵工程是以微生物的生命活动为中心的，各种发酵生产都必须有相应的微生物。发酵生产都必须有相应的微生物。 所以微生物对所以微生物对于发酵过程就十分重要。于发酵过程就十分重要。发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工
3、业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏二、发酵工业常用微生物菌种及要求二、发酵工业常用微生物菌种及要求l微生物菌种能否满足工业生产的实际需求，是否微生物菌种能否满足工业生产的实际需求，是否有工业生产价值是极为重要的。有工业生产价值是极为重要的。l发酵工业对菌种的要求：发酵工业对菌种的要求：l能在廉价原料制备的培养基上迅速的生长并生成能在廉价原料制备的培养基上迅速的生长并生成所需的代谢产物，而且产量高；所需的代谢产物，而且产量高；l培养条件易于控制；培养条件易于控制；l生长迅速，发酵周期短；生长迅速，发酵周期短；l满足代谢控制的要求；满足
4、代谢控制的要求；发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求抗噬菌体和杂菌的能力强；抗噬菌体和杂菌的能力强；遗传性状稳定，不易变异退化；遗传性状稳定，不易变异退化；在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单产量、降低成本有重要意义；数、提高单产量、降低成本有重要意义；对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源使用；这些前体作为一般碳源使用；不是病原菌，而且在系统发育上与病原菌无关，不是病原菌，而且在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质。不产生任何有害的生物活性物质。具备
5、以上条件的微生物才能保证发酵产品的质量具备以上条件的微生物才能保证发酵产品的质量和产量。和产量。二、发酵工业常用微生物菌种及要求二、发酵工业常用微生物菌种及要求l不是所有的微生物都能用于发酵工业，目前工业不是所有的微生物都能用于发酵工业，目前工业上能利用的微生物菌种只有区区数百种。上能利用的微生物菌种只有区区数百种。l工业上常用的微生物菌种：工业上常用的微生物菌种：l细菌：细菌： 工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产酶制剂、乳酸、醋酸等。酶制剂、乳酸、醋酸等。l酵母菌酵母菌 工业
6、上常用的酵母菌有啤酒酵母、假丝工业上常用的酵母菌有啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、酶制剂酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、酶制剂和生产菌体蛋白。和生产菌体蛋白。工业上常用的微生物菌种工业上常用的微生物菌种霉菌：霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸和甾体激素等。和甾体激素等。放线菌：放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。担子菌：担子菌： 即常说
7、的蕈菌，主要用于生产多糖、即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、药物开发。药物开发。藻类：藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等，工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等，主要用于生产食品，替代能源等。主要用于生产食品，替代能源等。发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏三、发酵工业微生物菌种的三、发酵工业微生物菌种的分离和选育分离和选育工业生产使用的菌种，有两种来源：根据资料
8、直工业生产使用的菌种，有两种来源：根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。菌种。 对于从自然界中分离筛选新的微生物菌种，必须对于从自然界中分离筛选新的微生物菌种，必须制定相应的策略，才能保证好的结果。制定相应的策略，才能保证好的结果。三、发酵工业微生物菌种的三、发酵工业微生物菌种的分离和选育分离和选育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的选育（二）微生物菌种的选育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离自然界获得的微生物样品
9、通常都是许多种微生物自然界获得的微生物样品通常都是许多种微生物共存，必须把目标菌种与杂菌分开，才能用于生共存，必须把目标菌种与杂菌分开，才能用于生产。目前进行微生物分离的方法主要包括两个：产。目前进行微生物分离的方法主要包括两个：施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法随机分离法随机分离法这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多步骤。步骤。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特
10、性。培养特性。采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。从
11、自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。步骤。到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。中所包含的所有微生物总数和种类。在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。因此，建立更为科学的和针对性不强的分离方法是必要因此，
12、建立更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。的。 新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤 （一）采样（一）采样1、采样对象、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。水域等。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤（一）采样（一）采样2、采样季节：以温度适中，雨量
13、不多的秋初为好。、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面表土，取离地面5-15处的土约处的土约10g，盛入清洁的，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。分批寄回，以便及时分离。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤（二）增殖培养（二）增殖培养为了
14、容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。段的纯种分离就
15、会顺利得多。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤（三）培养分离（三）培养分离尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。离的方法有划线分离法、稀释分离法。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生施加选
16、择性压力分离法：利用不同种类微生物生长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而快速分离纯化的目的。快速分离纯化的目的。此方法一般用于富集培养，即采集样品后的第一此方法一般用于富集培养，即采集样品后的第一步，可以使样品中目标微生物能大量繁殖。步，可以使样品中目标微生物能大量繁殖。目前，分离培养基中也广泛加入选择性压力因素，目前，分离培养基中也广泛加入选择性压力因素，进一步获得目标微生物。进
17、一步获得目标微生物。（四）筛（四）筛 选选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。产用菌种。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤（五）毒性试验（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁应慎重。据有的国家规定，微生物中除
18、啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。性试验。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细菌的分离细菌的分离放线菌的分离放线菌的分离霉菌的分离霉菌的分离 ( (一一) )采样和采集方法采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群
19、时，必须十分重视样本的采集。必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。细菌的分离细菌的分离l采样的注意事项采样的注意事项l1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；l2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；l3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；地点以及采集地点的地理、生态参数等；l4、应充分
20、考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；原地菌群的出现可能是短暂的；l5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长细菌的分离细菌的分离土样采集方法土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向
21、上层顺序采集；森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面如果层次要求不严格，可取离地面515处的土。将采集处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约物根，在大量无菌水中浸渍约20，洗去粘附在根上的土壤，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分即为根际土然后再用无菌水漂洗下根部
22、残留的土，这部分即为根际土样。样。植物体采集方法植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与
23、根际土样一起保存。样一起保存。 水样采集方法水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于用于细菌检测的水样应收集于100干净、灭菌的广口塑料干净、灭菌的广口塑料瓶中。瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50处，然后瓶口朝下处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应
24、装满采样瓶。所有水样都应在的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内之内迅速进行检测，或者迅速进行检测，或者4下贮存。下贮存。玻璃水样采集器玻璃水样采集器不锈钢水样采集器不锈钢水样采集器卡盖式水样采集器卡盖式水样采集器培养基的组成原则培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有、就分离培养基的组成而言，部分培养
25、基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制如放线菌酮和制霉素霉素)，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50gm1， 以抑制真菌的生以抑制真菌的生长。长。4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育培养箱中孵育l、2天。天。5、培养基的生物物理学参数，如及盐分也应调节到与试、培养基的生物物理学参数，如及盐分也应调节到与
26、试样的生态系统参数值相近。样的生态系统参数值相近。培养基的组成原则培养基的组成原则土中细菌的富集培养与分离土中细菌的富集培养与分离分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。因组，可以建立起若干
27、富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。富集可以促进抗性的产生并维持下来。水中细菌富集技术水中细菌富集技术在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌另一富集方法是在培养烧瓶中添
28、加细菌“附着材料附着材料”，如，如无菌的植物组织或土壤浸出液。无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤次代培养及纯化步骤1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏
29、琼脂斜面上。量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。板上进行筛选。不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细菌的分离细菌的分离放线菌的分离放线菌的分离霉菌的分离霉菌的分离放线菌的分离放线菌的分离( (一一) )采样及采集方法采样及采集方法应尽可能实行无菌操作。应尽可能实行无菌操作。所采集的样本应具有一定的代表性。所采集的样本应具有一定的
30、代表性。样本采集完后，应及时处理或在样本采集完后，应及时处理或在44下贮存，贮存试样处应下贮存，贮存试样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。( (二二) )生态学参数生态学参数放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参数有温度、离子放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参数有温度、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。强度、氧化还原电势和底物浓度。（三）培养基的组成原则（三）培养基的组成原则大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养上进行的。除嗜温性放线菌
31、外，其他放线菌一般在培养4-204-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在分离琼脂平板制备好后，一般皆应在3737培养箱中存放培养箱中存放3 3天。天。放线菌的分离放线菌的分离放线菌的分离放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。海绵压印土样后压印平板后培养
32、。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量种为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行稀释和涂布。纸表面沉积进行稀释和涂布。次代培养及纯化次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，
33、作初步的鉴定和区分。步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时尤的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时尤为重要。为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以或无菌牙签挑
34、取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。进一步筛选和分离。不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细菌的分离细菌的分离放线菌的分离放线菌的分离霉菌的分离霉菌的分离真真 菌菌 分分 离离1 1、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2 2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有时，真菌子实体形成必须有
35、光线，这在分离培养时、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。 富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。的纤维素裂解微生物。5、
36、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。抑制细菌生长及菌落形成。真真 菌菌 分分 离离真菌的分离方法真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。浸泡法。水中
37、真菌的分离：水样稀释后涂布分离。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。上培养。随机分离法随机分离法有些微生物在分离和筛选的时候并不是采用传统有些微生物在分离和筛选的时候并不是采用传统的选择性压力分离法，只能采用随机法进行分离。的选择性压力分离法，只能采用随机法进行分离。抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂产生菌的分离抗病毒药物产生菌的分
38、离抗病毒药物产生菌的分离生长因子产生菌的分离生长因子产生菌的分离免疫激活剂产生菌的分离免疫激活剂产生菌的分离多糖产生菌的分离多糖产生菌的分离抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离抗生素产生菌筛选方法包括：抑菌圈法、稀释法、抗生素产生菌筛选方法包括：抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等等。扩散法、生物自显影法等等。如抑菌圈法，由于抗生素产生菌会产生抗生素，如抑菌圈法，由于抗生素产生菌会产生抗生素，因此事先在平板上涂抹适当的供试菌（对抗生素因此事先在平板上涂抹适当的供试菌（对抗生素敏感），如果待分离的微生物能够在菌落周围形敏感），如果待分离的微生物能够在菌落周围形成抑菌圈，即说明是具有抗生素产生
39、能力的菌种。成抑菌圈，即说明是具有抗生素产生能力的菌种。另外也可以采用专一性很强的筛选技术，如采用另外也可以采用专一性很强的筛选技术，如采用与抗生素作用机制相关的酶进行筛选。与抗生素作用机制相关的酶进行筛选。抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离大部分抗肿瘤药物也具有抗菌和抗真菌活性，目大部分抗肿瘤药物也具有抗菌和抗真菌活性，目前利用微生物筛选作用于的抗肿瘤药物的方法具前利用微生物筛选作用于的抗肿瘤药物的方法具有高灵敏度和简便快速的特点，如生化诱导分析有高灵敏度和简便快速的特点，如生化诱导分析法和生色检测法。法和生色检测法。生化诱导分析法也叫生化诱导分析法也叫诱导检测法，通过测定表诱导检
40、测法，通过测定表达的达的-半乳糖苷酶活性，来检测能损伤的抗肿瘤半乳糖苷酶活性，来检测能损伤的抗肿瘤药物的存在。药物的存在。此外也可利用修复能力突变株进行抗肿瘤药物的此外也可利用修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选。筛选。酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂产生菌的筛选，主要选择与生理和病理酶抑制剂产生菌的筛选，主要选择与生理和病理关系明确的酶为靶酶进行筛选。关系明确的酶为靶酶进行筛选。如可以用前列腺素合成酶、血管紧张素转移酶等如可以用前列腺素合成酶、血管紧张素转移酶等等作为靶酶，选择产生酶抑制剂的微生物。等作为靶酶，选择产生酶抑制剂的微生物。三、发酵工业微生物菌种的三、发酵工业微生物
41、菌种的分离和选育分离和选育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的选育（二）微生物菌种的选育（二）微生物菌种的选育（二）微生物菌种的选育工业菌种的育种：工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。质或增加新的性状。工业菌种的选育包括如下几个方法：自然选育、工业菌种的选育包括如下几个方法：自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种选育、杂交育种、原生诱变选
42、育、抗噬菌体菌种选育、杂交育种、原生质体融合技术和基因工程技术。质体融合技术和基因工程技术。1、自、自 然然 选选 育育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程叫自然选育。选育的过程叫自然选育。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降，另是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降，另一种是对生产有益的突变。一种是对生产有益的突变。自然选育的突变率虽然很低，但是却是工厂保证自然选育的突变率虽然很低，但是却是工厂保证稳产高产的重要措施。稳产高产的重要措施。自然选育还要
43、注意生产菌种的回复突变。自然选育还要注意生产菌种的回复突变。2、诱变选育、诱变选育利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种包括诱变和筛选两部分。诱变育种包括诱变和筛选两部分。诱变成功的关键，包括以下几个步骤：诱变成功的关键，包括以下几个步骤：出发菌株的选择，一定要考虑目标产物的生产能出发菌株的选择，一定要考虑目标产物的生产能力，其他因素尽量考虑利于诱变。力，其他因素尽量考虑
44、利于诱变。诱变剂使用方法，有单一诱变剂和两种以上的诱诱变剂使用方法，有单一诱变剂和两种以上的诱变剂联合使用两种方法。变剂联合使用两种方法。诱变剂的剂量选择：诱变剂剂量与致死率有关系，诱变剂的剂量选择：诱变剂剂量与致死率有关系，同时与突变率有关系，所以一定要选择合适的使同时与突变率有关系，所以一定要选择合适的使用剂量。用剂量。2、诱变选育、诱变选育2、诱变育种、诱变育种诱变处理结束之后，菌种有可能发生很多类型的诱变处理结束之后，菌种有可能发生很多类型的变异，正向突变的菌种往往占少数，必须通过初变异，正向突变的菌种往往占少数，必须通过初筛和复筛之后在经过发酵条件的优化研究，确定筛和复筛之后在经过发
45、酵条件的优化研究，确定最佳的条件，才能使高产菌株发挥生产能力，不最佳的条件，才能使高产菌株发挥生产能力，不同菌株可以根据特性不同采用不同的筛选方法，同菌株可以根据特性不同采用不同的筛选方法，如营养缺陷型、抗反馈阻遏和抗反馈抑制型、组如营养缺陷型、抗反馈阻遏和抗反馈抑制型、组成型突变株、抗性突变株等类型。成型突变株、抗性突变株等类型。营养缺陷型突变株筛选营养缺陷型突变株筛选营养缺陷型突变株由于生物合成途径中某一步发营养缺陷型突变株由于生物合成途径中某一步发生了酶缺陷，合成不能完成，末端产物不能积累，生了酶缺陷，合成不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。因此末端产物的反馈调
46、节作用被解除。在培养基内限量加入所要求的末端产物，克服生在培养基内限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能积累所需的中间产物。长障碍，就能积累所需的中间产物。筛选时则可以利用这个营养缺陷作为条件，筛选筛选时则可以利用这个营养缺陷作为条件，筛选出突变株。出突变株。诱变、淘汰野生型、检出缺陷型、确定生长谱即诱变、淘汰野生型、检出缺陷型、确定生长谱即为营养缺陷型菌株诱变育种的基本步骤。为营养缺陷型菌株诱变育种的基本步骤。营养缺陷型突变株育种过程营养缺陷型突变株育种过程淘汰野生型的方法：淘汰野生型的方法：抗生素法：野生型能在基本培养基中生长，而缺陷型不抗生素法：野生型能在基本培养基中生长，而缺陷型
47、不能，于是将诱变处理液在基本培养基中培养短时让野生能，于是将诱变处理液在基本培养基中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌
48、丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而能滤过。芽而能滤过。营养缺陷型突变株育种过程营养缺陷型突变株育种过程营养缺陷型的检出：营养缺陷型的检出：原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在上生长良好，而在上则情况完全不同，缺陷型在上生长良好，而在上则不生长，野生型都能生长。不生长，野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法营养缺陷型突变株育种过程营养缺陷型突变株育种过程生长谱确定生长谱确定验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子
49、，验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。即生长谱测定。利用固体培养基，点不同的生长因子，观察菌种利用固体培养基，点不同的生长因子，观察菌种的生长情况，来确定具体缺陷的因子。的生长情况，来确定具体缺陷的因子。抗反馈阻遏和抗反馈抑制型抗反馈阻遏和抗反馈抑制型抗反馈阻遏和抗反馈抑制是指能使积累了大量末抗反馈阻遏和抗反馈抑制是指能使积累了大量末端产物的时候仍能不断合成这一产物。端产物的时候仍能不断合成这一产物。筛选这类突变菌株是通过抗结构类似物突变的方筛选这类突变菌株是通过抗结构类似物突变的方法完成的。未突变的细胞会因为代谢受阻，不能法完成的。未突变的细胞会因为代谢受阻，不能合成某种
50、代谢产物而死亡，突变株仍能够合成相合成某种代谢产物而死亡，突变株仍能够合成相应的末端产物，形成菌落，便于区分。应的末端产物，形成菌落，便于区分。组成型突变株的筛选组成型突变株的筛选组成型突变株是为了解除菌株对诱导物的依赖而组成型突变株是为了解除菌株对诱导物的依赖而获得的，因此可以选择设计一种利于其生长并限获得的，因此可以选择设计一种利于其生长并限制诱导型菌株生长的培养条件，来达到筛选的效制诱导型菌株生长的培养条件，来达到筛选的效果。果。交替培养法就是筛选组成型突变株的有效方法。交替培养法就是筛选组成型突变株的有效方法。如如-半乳糖苷酶的组成型突变株和诱导性菌株就半乳糖苷酶的组成型突变株和诱导性
