1、l 山东大学医学院免疫学研究所 l 张利宁l 核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记标记的、能与特定的靶分子发生的、能与特定的靶分子发生特异性特异性相互作相互作用的用的DNA或或RNA片段片段。l1 基因组基因组DNA探针：病毒探针：病毒DNA等等l2 cDNA探针；最常用探针；最常用l3 寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变，测序、点突变l4 RNA探针：稳定性高、特异性强，但探针：稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。极易降解，不宜操作。l理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方
2、法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。l一）放射性标记物l二）非放射性标记物l 利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。l产生射线的核素：32P、3H、35Sl产生射线的核素：125Il1） 32P：产生：产生 射线，灵敏度高，分辨率强，是最射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）：天）： 位和位和 位标记。位标记。l2）35S：分辨
3、率高、半衰期长（：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感度天）。敏感度底底l O(S) O(S) O(S)lOH- P-O-P-O-P-O-CH2 O 硷基硷基l O O O H H(OH)l优点：灵敏度高：0。01pgl 特异性强l缺点：放射性污染l 成本高、半衰期短，不能长期保存l1、优缺点l优点：无放射性污染l 成本低、操作简单l缺点：敏感性、特异性均低于放射性核 l 素l1）生物素：1-2pgl 生物素化核苷酸生物素化核苷酸：bio-16-dUTPl bio-11-dUTPl生物素化核苷酸-通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针-杂交-抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物加底物显色l光敏生物
4、素光敏生物素：生物素与光敏基团结合-光敏生物素-光敏生物素与核酸探针混合-在强光的作用下-光敏基团与核酸共价结合-生物素标记的 探针生物素光敏基团lDig-dUTP-通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针-杂交-加抗地高辛-酶的复合物加底物显色l灵敏度较高：0.1pgl特异性较生物素高l是较理想的非放射性标记物l（一）缺口翻译法或切口平移法l（二）随机引物法l (三）末端标记法l（四）cDNA探针的标记l（五）RNA探针的标记限量DNA酶IDNA聚合酶I+ 32P-dNTP变性32P部分标记的单连DNA片段53355-3外切酶和5-3 内切酶5353 5l限量DNase I在待标记的双连DNA的
5、每一条连上产生若干个单连缺口l利用E.coli DNA多聚酶I的5-3外切酶的活性和5-3多聚酶的活性，在缺口处5末端每切除一个核苷酸，则在3末端添加一个核苷酸，以修补缺口。l随着缺口在5末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连中l1）快速、简便、标记的探针均一、特异性高l2）仅适用于较长的双连DNAl3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚酶的全酶l4）DNA酶I的浓度一定要适宜l随机寡核苷酸引物（随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用lE。coli DNA聚合酶I的Kleno
6、w大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）l变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合l随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合lDNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3-OH端开始合成互补DNA连l反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针533双连DNA变性随机引物Klenow大片段32P-dNTP35变性随机引物标记法l1）不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记l2）操作简单l3）标记率高l末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotide transferase)l5DNA3OH+-32 p-dNTPl5
7、_DNA_3(pdN)n +nPPi (焦磷酸）lT4多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)末端转移酶lT多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)l35OH +32P-P-PA(ATP）l532P+PPAT4多核苷酸激酶l（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation）l（二）随机引物法（randompriming )l (三）末端标记法l（四）cDNA探针的标记（反转录制备单 l 连cDNA探针）l（五）RNA探针的标记（体外转录的方法）基本原理：具有一定同原性的两条核酸单连在一定条件
8、下（适当的温度、离子强度等），按硷基互补的原则，重新形成双连DNA的过程。杂交的类型：液相杂交：核酸电镜固相杂交：膜固相印记杂交、组织细胞原 位杂交、菌落原位杂交l（一）固相支持物的选择l、硝酸纤维素膜：l 在高离子强度下，具有较强的吸附单连DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2l 、尼龙膜：在低离子强度下，很强的吸附单连、双连的DNA或RNA；350-500ug/cm2l 变性 l l 杂交 l l l 洗膜l l 杂交信号的检测l热变性：95-100C , 5-10分钟l碱变性：0.5Mol/L NaOH ,30分钟l变性的单连DNA按碱基配对的原则，在适当l的条件下重新缔合形成双
9、连的过程。l）离子强度：）离子强度：x SSCl）杂交温度：杂交反应在低于）杂交温度：杂交反应在低于Tm值值15- 25 温度下进行温度下进行l一般，探针长一般，探针长500bp，G+C含量为，含量为， l 离子强度为离子强度为x SSC；杂交液中不含甲酰；杂交液中不含甲酰胺，胺，Tm 值为值为93。4 ，杂交温度，杂交温度68 ，含甲酰胺，含甲酰胺，Tm值为值为68。4 ，杂交温度，杂交温度42。4 l）减少非特异性杂交反应：预杂交）减少非特异性杂交反应：预杂交l离子强度：0.1x SCCl洗膜温度：低于 Tm值 5-12 C 。l探针长500bp， G+C含量 42%,离子强度0.1xSS
10、C, 不含甲跣胺， Tm值为67 ，则洗膜温度为55-62 .l）放射性核素探针的检测：放射自显影l）非放射性核素探针的检测l地高辛标记探针的检测l生物素标记探针的检测抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物底物（BCIP+NBT)紫色的不溶性化合物l 过氧化物酶 底物（）抗生物素蛋白生物素棕褐色不溶性的化合物l、斑点及夹缝印迹杂交（dot blot and slot blot)：检测DNA或RNA（定性或半定量）l 检测DNA大小、存在状态l DNA电泳l l 变性 转膜 杂交吸水纸玻璃板重物滤纸凝胶盐桥Southern转印l检测RNA的大小和状态lRNA电泳 转印 杂交 l 洗膜 显色l用标记的核酸探
11、针与组织切片或细胞涂片中的核酸进行杂交并对其进行检测和定位的方法平皿膜杂交培养lPCR：Polymerase chain reaction lMullis: 1983发明， 1993获诺贝尔奖lSarki:1985将PCR用于镰刀红细胞贫血的诊断。lErlich: 分离纯化了适用于PCR的Tag酶l（一）原理：lPCR是体外酶促合成特异片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的得以迅速扩增。l变性-退火-延伸-延伸30-35循环94 c 55 c 72c 5353变性退火退火延伸延伸第二循环l。操作简单l。省时：1-2 hrl。灵敏度高：pgl。特异
12、性强l。对原始材料质量要求低l。有一定程度的单核苷酸错误掺入l、模板：ng量的克隆DNA或g的染色l 体DNAl、引物：特异性应强l、Mg2+浓度: 1.5-2 mmol/L量l、dNTP 的浓 度: 单核苷酸浓度 200umol/Ll5、 Taq DNA聚合酶的用量:100l 反应液 l 中加入2。5U的酶l、循环参数：；25-35l、上游引物上游引物与目的DNA端序列完全相同； 下游引物下游引物与目的DNA端序列互补l、引物长度以15-30个碱基为益；l G+C含量为45-55l、避免引物内形成二级结构l、两引物间不应发生互补，特别是在端， l 避免形成引物二聚体l、合成的引物应进行纯化l
13、、引物的浓度不要太高: 0.1-0.5 mol/Ll目的：ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3上游序列： ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC G+C=11/21=52%下游序列：CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3 G+C=10/21=48%l反转录PCR： mRNA-cDNA-PCRl抽提RNA l反转录合成cDNAlPCR 扩增AAAAAAA-3AAAAAAA-3 TTTTTTT-5mRNAcDNATTTTTTT-5PCRRT-PCR反转录
14、酶+dNTPcDNAl实时荧光定量实时荧光定量PCR技术于技术于1996年由美国年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该公司推出，由于该技术不仅实现了技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞从定性到定量的飞跃，而且与常规跃，而且与常规PCR相比，它具有特异相比，它具有特异性更强、有效解决性更强、有效解决PCR污染问题、自动污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。化程度高等特点，目前已得到广泛应用。下面就其定量原理、方法作一介绍下面就其定量原理、方法作一介绍。 l 所谓实时荧光定量所谓实时荧光定量PCR技术，是技术，是指在指在PCR反应体系中加入荧光基团，反应体系中加入
15、荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。知模板进行定量分析的方法。l C代表Cycle（循环数） t代表threshold（荧光域值） CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到 达设定的域值时所经用的循环数横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强度黑线：荧光域值红线：无模板 -域值下一 直线绿线 ：样品 CT值=17 （第17个循环时， 荧光信号强度达到域值）l PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置为荧光本底信号，荧光域值的缺省
16、设置是是3-15个循环的荧光信号的标准差的个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 研究表明，每个模板的研究表明，每个模板的Ct值与该模值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，系，起始拷贝数越多，Ct值越小。值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线（如下图所示）出标准曲线（如下图所示）横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值. 获得未知样品的Ct值-标准曲线-该样品的起始拷贝数。 l 荧光定量荧光定量PCR所使用的荧光化学所使用的荧光化学可分为两
17、种：可分为两种：l 荧光探针荧光探针l 荧光染料荧光染料用荧光基团标记PCR特异性荧光探针。 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收-检测不到荧光信号； PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针 酶切降解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 荧光监测系统接收到荧光信号 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。l 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料；SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与
18、PCR产物的增加完全同步。l内参照法；竞争法 ； l原理：同一PCR管（荧光标记引物、待检模 板、已定量内标） -该PCR管（扩增的模板、扩增的内标）-电泳或高效液相分离-分别检测荧光强度-以内标为参照，定量检测模板 传统定量方法都是终点检测（PCR到达平台 期后进行检测），而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。 同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。l图4. 相同模板在同一台 PCR仪上进
19、行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性l利用梯度PCR仪对解链、退火及延伸设置温度梯度，适用于摸索试验条件时，多次试验可在一台仪器上完成，既节省试验时间，提高效率，又节省试验成本。巢式PCR（nested PCR）是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增。以上方法适用于多种DNA及RNA病毒的检测，如HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA、CMV DNA 、HTLV DNA、 HGV RNA等。27 kb fragments are possible from good quality genomic DNA, Taq DNA polymerase for high processivity (i.e. 5-3 polymerase activity) usually Pwo with 3-5 proofreading abilities This combination of features allows longer primer extension than can be achieved with Taq alone.
