1、组织学与胚胎学http:/ Histology胚胎学 Embryologyn组织胚胎学的两端：n组织学之细胞学，cytology，现在发展成细胞生物学。n胚胎学，现在发展成发育生物学。n都是前沿学科。课程安排n细胞 cell -细胞学 cytologyn组织 tissue -基本组织学 n器官 organ -器官组织学n胚胎学 组织学histologyn主要方法n固定组织研究n活组织研究n观察手段n光学显微镜n电子显微镜光学显微镜石蜡切片法n石蜡切片：paraffin sectionn固定fixn切片sectionn染色dyen固定固定：将组织用化学试剂浸泡，使组织内蛋白质等成分凝固或沉淀。n
2、染色染色：组织中某些成分与染料化学结合或物理吸附而显色。固定到切片（常用）n固定固定n脱水脱水-梯度乙醇梯度乙醇n透明透明-二甲苯二甲苯n透蜡透蜡-石蜡石蜡n包埋（包埋（-蜡块）蜡块）n切片切片（5m）切片到观察（常用）n脱蜡-二甲苯n入水-梯度乙醇n苏木精染色n梯度乙醇到95%n伊红染色n脱水n透明n封片n观察HE染色n用苏木精与伊红染色，是最常用的组织学，病理学染色方法。nH：苏木精,Hematoxylin碱性，蓝色 nE：伊红eosin酸性，红色n嗜碱性:染成蓝色,如:细胞核（核酸，酸性）n嗜酸性:染成红色,如细胞质 （碱性蛋白），nHE染色的肾小管n红色为嗜酸性的胞浆，蓝色为嗜碱性的核
3、冰冻切片n1冰冻（常用液氮）n2切片n优点：n保存酶活性，n抗原保存好，免疫组化应用较多。n缺点：n形态不如石蜡切片。n要求有冰冻切片机。其他光镜可用制片方法：其他光镜可用制片方法：n简单，实用，不需要特殊设备，有时候必须用n涂片（血液，体液）n触片n撕片n装片、磨片。 光学显微镜的结构n机械系统n光学系统n目镜（10 x,5x,16x）n物镜 （4x,10 x,20 x,40 x,60 x,100 x)n聚光器n光源物镜n最重要，最贵的部位。n物镜上数字，以40倍为例：n40/0.65，n放大倍数，镜口率（数值孔径，N.A)n160/0.17n机械管长，允许盖玻片厚度。分辨率的问题n分辨率（
4、Resolving power）又称分辨本领，是用来表示人眼或仪器能够区分开的被观察物体上两点间的最小距离。所能分辨的两点间距离越小，见到的细节就越多，分辨率就越高。 n人眼在25cm明视距离分辨率为0.2mm，n光镜分辨率为0.2m，电镜的分辨率比光镜的分辨率大约提高1000X。D=0.61/(N*sin(/2)n：为入射孔径角，即光线从样品进入透镜的张角：450nm,nN：折光率，空气 N=1,香柏油（N=1.5),n光镜最大分辨率，D最小值0.2m光学显微镜种类n普通光镜（明视野）。n暗视野（dark field）显微镜。n相差显微镜。n荧光显微镜。n激光共焦扫描显微镜（Laser Sc
5、anning Confocal Microscopy）n微分干涉显微镜（differential-interference microscope）n明视野效果，无标本处最亮n暗视野效果，无标本处最暗，（花粉管）n相差效果，可以观察透明（不染色）标本。n用于观察活细胞n荧光效果，n用各种不同的荧光染料n万能显微镜，其实是将几种功能通过配件集中在一台显微镜上n倒置显微镜，其实是将标本置于物镜上方，细胞培养常用n显微摄影，现在更多利用了数码相机电子显微镜n透射电镜TEM(transmission electron microscope)n电子束代替光线，波长短，电磁透镜代替光学透镜。n超薄切片，重金
6、属染色（铅，铀盐），吸收电子。n光学显微镜下结构n电子显微镜下结构透射电子显微镜。透射电子显微镜。分辨率分辨率1.44埃，埃，放大倍率放大倍率80万倍万倍n超薄切片制作过程电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较 显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm0.1nm可见光（400-700） 电子束（0.01-0.9）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较n扫描电镜(scanning electron microscope)扫描电镜下的结构
7、切片上还可以做：切片上还可以做：n组织化学n免疫组织化学n原位杂交n放射自显影组织化学（切片上的化学反应）nPAS反应显示多糖perioldic acid shiff reactionn切片上多糖HIO4（氧化）多醛；多醛无色品红（shiff试剂）紫红色沉淀（显示多糖存在）PAS反应n紫红色沉淀（显示多糖存在）其他一些特殊染色：胭脂红染色,粘液染色,类淀粉染色,含铁血黄素银染，黑色为银颗粒位置免疫组织化学：immunohistochemistryn利用抗原抗体特异性结合而显示抗原存在。n利用标记技术，如将荧光素（酶）与抗体结合（钥匙），n如果切片上某个部位有抗原（锁），当抗原抗体结合后，洗去多
8、余抗体，荧光显示部位即是抗原（某种蛋白）部位。细胞浆弥漫性阳性反应（细胞角蛋白细胞浆弥漫性阳性反应（细胞角蛋白,CK）DAB显色，甲基蓝复染。显色，甲基蓝复染。原位杂交in situ hybridizationn利用核酸碱基互补的特性。n原理跟免疫组化类似。n实验要求更高。nCGnATn碱基互补原理Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养n细胞培养计量单位n组织学常用的计量单位：n10-3， m 毫n10-6， 微n10-9，n纳 (埃,10-10 mn10-12，p皮n如m(微米），11000mm。n光镜常用，如细胞大小nnm（纳米），1/1000 m。n电镜常用，如细胞膜厚度放大倍数问题n粗略的估算：n物镜放大*目镜放大。如40*10n问题n如洗出照片时，如上是否放大倍数就是400。n参照物的使用。切面方向与立体结构n横切、纵切。n考虑鸡蛋的几个切面n考虑其他可能的切面。掌握切面对于我们了解器官立体结构的重要性。n以管状结构为例，同一器官可能有哪些不同切面。n1n2
