1、第六讲第六讲 蛋白质研究的原理与技术蛋白质研究的原理与技术Principles and Techniques of Protein Analysis, 34204192生物药学楼2-203室一、蛋白质分离与纯化技术一、蛋白质分离与纯化技术二、蛋白质的性质与功能研究技术二、蛋白质的性质与功能研究技术三、蛋白质的相互作用研究技术三、蛋白质的相互作用研究技术蛋白质纯化与鉴定实验指南，朱厚础等译，2000，科学出版社The Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification, 18-1142-75Pro
2、tein Purification, Handbook, 18-1132-29 References一、蛋白质分离与纯化技术一、蛋白质分离与纯化技术Techniques in Protein Extraction and Purification蛋白分离纯化的目的与意义蛋白分离纯化的目的与意义获取纯蛋白，提高蛋白生化性能。蛋白质修饰与蛋白结晶的前提：获取高纯度蛋白。去除杂蛋白（抗原性），是蛋白药物使用的前提。蛋白纯化在蛋白制备中所占费用最大，常达到90。蛋白质纯化总原则蛋白质纯化总原则（General Principle）以合理的效率(Efficiency), 速度(Speed), 收率(Yi
3、eld)和纯度(Purity) ，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是杂蛋白中分离出来，并保留其生物学活性和化学完整性。细胞破碎细胞破碎蛋白溶解蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素粗粗 提提沉淀相分离分子筛精精 提提各种色谱电泳分离差速离心研磨超声渗透压酶鉴鉴 定定预处理原材料的获取浓度纯度活性蛋白质纯化通用步骤蛋白质纯化通用步骤（一）蛋白纯化方法（一）蛋白纯化方法 概述概述（二）常用层析技术（二）常用层析技术 介绍介绍（三）常用电泳技术（三）常用电泳技术 介绍介绍基础不同蛋白质理化性质的差异原因氨基酸的组成与数目不同与蛋白纯化相关的理化性质 分子大小 分子形状 带电特性 溶解特性 与配体特异性结合不同
4、 吸附性质 变性和复性（一）蛋白纯化方法（一）蛋白纯化方法 概述概述1. 1. 分子大小分子大小大小：主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。几百百万 Da常用方法 透析（Dialysis ） 超滤（Ultrafiltration ） 凝胶过滤（Gel filtration chromatography） 超速离心（Ultracentrifugation ）透透 析析超超 滤滤凝胶过滤凝胶过滤超速离心超速离心2.2.分子形状分子形状形状 形状的不同会影响蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动的速度。方法 密度梯度离心（Density gradie
5、nt centrifugation ） 蛋白电泳 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 密度梯度离心密度梯度离心SDS-PAGE3.3.电电 荷荷电荷 蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。 酸性蛋白质：天冬氨酸和谷氨酸占优势，pH7.0时带负电荷 碱性蛋白质：赖氨酸和精氨酸占优势，pH 7.0时带正电荷方法 等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing, IEF） 双向凝胶电泳（ Two-dimensional electrophoresis, Two-DE ） 离子交换层析（Ion Exchange Ch
6、romatography, IEC）等电聚焦双向凝胶电泳双向凝胶电泳离子交换层析离子交换层析4.4.溶解度溶解度原理 蛋白质分子表面的亲水性和疏水性带电基团差异导致其在溶剂中的溶解度不同。方法： 通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。沉淀法 盐析法（Salt precipitation ） 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法盐 析高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水，破坏蛋白质分子表面的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷，引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。硫酸铵分级沉淀有机溶剂分级沉淀等电点沉淀法5. 5. 配体特异性结合配体特异性结合原理原理 生物
7、大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。方法 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。分类：亲和层析（亲和层析（Affinity chromatography, AC ） 免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography, IAFC ） 生物亲和层析 金属螯合亲和层析免疫亲和层析免疫亲和层析6.6.吸附性质吸附性质方法 疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 基础：蛋白质
8、的疏水性差异利用固定相上偶联的疏水性配基与流动相中的疏水分子发生可逆性结合而进行分离。 反相层析（Reversed phase chromatography）基础：蛋白质的极性差异流动相的极性大于固定相的层析技术。蛋白分子在该系统中的移动速度依其极性排列，极性大者移动快。 疏水层析疏水层析7.7.变性和复性变性和复性原理 蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。方法 包涵体蛋白的变性纯化与复性通用性？独特性！ 程序化！（二）常用层析技术（二）常用层析技术 介绍介绍凝胶过滤层析（ Gel filtr
9、ation ）分子筛层析离子交换层析（ Ion exchange ）疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ）亲和层析（ Affinity ）1. 1. 基本原理基本原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质大小、电荷及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。基本原理图基本原理图 2. 2. 装置装置蠕动泵层析柱检测器记录仪分部收集器紫外检测仪蛋白电泳系统超声波破碎仪层析柱分部收集器How to obtain the recombinant proteins?3. 3. 亲
10、和层析亲和层析原理 亲和层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。 将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。原理图原理图重组蛋白制备重组蛋白制备SDSPAGE图谱图谱亲和标签亲和标签His6：6个连续组氨酸 GST：谷胱甘肽转移酶 CBD：几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain)MBP：麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein)Biotinated peptide：生物素化
11、多肽链 FLAG（DYKDDDDK）：S tag：T7 tag：T7Step Tag II：生物素功能类似物亲和标签选择因素亲和标签选择因素亲和标签是否会影响目标蛋白的结构和功能（小）蛋白质的稳定性亲和标签所融合的位置（N端，C端）是否需在变性条件下进行亲和纯化（标签适合否）亲和标签对表达水平的影响（标签、蛋白、系统）是否需标签具有鉴定功能亲和洗脱的条件（不使蛋白变性）亲和介质和缓冲液的费用是否在亲和纯化后去除标签亲和标签亲和标签分子大小分子大小结合配体结合配体融合部位融合部位洗脱条件洗脱条件注释注释谷胱甘肽巯基转移酶谷胱甘肽巯基转移酶(GST)(GST)220aa谷胱甘肽N 端还原型谷胱甘肽
12、pGEX, pET41, pET42,可进行表达蛋白检测融合蛋白形成二聚体几丁质结合结构域几丁质结合结构域(CBD)(CBD)56aa几丁质N 端或C端诱导剪切pTYB,pTWIN麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白(MBP)(MBP)396aa直链淀粉N 端或C端麦芽糖pMAL可分泌表达,可改善溶解性PinPointPinPoint( (可生物素化蛋白可生物素化蛋白) )13 kDa单体抗生物素蛋白N 端生物素PinPoint可进行表达蛋白检测Strep tag Strep tag ( (非生物素化亲和非生物素化亲和) )8aa链霉抗生物素蛋白变体Strep-TactinN 端或C端脱硫生物素pPR
13、-IBA, pASK-IBA可进行分泌表达可进行表达蛋白检测, 可进行目标蛋白固定化,可在变性条件下纯化组氨酸标签组氨酸标签(Poly His)(Poly His)6,8,10,18aa螯和Ni2+N 端或C 端咪唑/低pHpET, pHAT, pQE可在变性条件下纯化FLAGFLAG标签标签8aa单抗M1/M2M1: N 端M2:N端/C 端M1: EDTA M2:低pH或合成的FLAG肽p-FLAG,p3FLAG已具有肠激酶酶切位点S S 标签标签15aaRNase A的S片段N 端或C 端低pHpET可进行表达水平的监测T7 T7 标签标签11aa单抗N 端低pHpET可增强表达水平可在
14、弱变性条件下纯化3.1 His3.1 His6 6-Ni-Ni亲合层析亲合层析（金属螯合层析）（金属螯合层析）NH2NH2NiHisHisHisHisprotein原理：基于蛋白质表面的一些特定的氨基酸残基侧链，尤其是组氨酸，在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，从而分离蛋白质。His标签是目前应用最为广泛的亲和标签！HisHis标签优缺点标签优缺点优点： 标签分子量小，一般不影响目标蛋白的功能； 可用于变性/非变性纯化； 可用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA互作研究； 免疫原性较低，可直接用于抗体制备； 可应用于多种表达系统，纯化条件温和； 可和
15、其它亲和标签共同构建双亲和标签。缺点： 融合蛋白易形成包涵体； 包涵体蛋白难于溶解； 融合蛋白溶解后不能正确复性； 层析时螯和的金属离子容易泄漏； 非特异性结合会造成制品纯度不高。3.2 3.2 谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签(GST(GST)最早使用的亲和标签。目标蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽亲和介质进行纯化，或固定在亲和介质上进行蛋白质-蛋白质互作研究。因GST分子量较大，且以二聚体的形式存在，一般都需要去除融合标签。此系统必须依赖于GST的正确折叠。GST融合蛋白常用来免疫动物生产抗体，及作为载体蛋白进行蛋白结晶。3.3 3.3 几丁质结合肽几丁质结合肽NE
16、B IMPACT系统以几丁质结合肽为融合标签，融合蛋白可用几丁质亲和层析纯化，利用内含肽（intein）特异性原位剪切直接获得目标蛋白。最大优点：不需使用蛋白酶来去除融合标签！最大优点：不需使用蛋白酶来去除融合标签！包括以下几类： 巯基诱导的N端剪切系统； 巯基诱导的C端剪切系统； pH诱导的C端剪切系统； 可用于蛋白质环化的双内含肽系统。基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化3.4 3.4 麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBPMBP）此系统使用交联直链淀粉的亲和介质纯化，用麦芽糖进行竞争性洗脱。优点： MBP无半胱氨酸残基，不干扰目标蛋白形成正确二硫键
17、； 使用的介质价格低廉； 可在温和条件下洗脱融合蛋白； 加上其分泌信号，可以进行分泌表达在细胞周质； 这一系统最显著的特点是可改善目标蛋白的溶解性，促进正确折叠，提高活性蛋白的回收率。MBPMBP标签亲合纯化标签亲合纯化3.5 3.5 与抗生物素蛋白特异结合的亲和标签与抗生物素蛋白特异结合的亲和标签生物素-抗生物素蛋白（Avidin-Biotin）是目前最强的亲和作用之一。Strep Tag 系统是通过筛选噬菌体随机肽库得到的短肽（含9个氨基酸残基），将其进行目标蛋白的C端融合可模拟生物素和链霉抗生物素蛋白特异性相互作用，使用亚胺生物素洗脱。这一系统不能进行N端融合，而且变性剂会影响亲和相互作
18、用。后发展的八氨基酸Strep tag标签，本身并不能生物素化，却可模拟生物素的功能和链霉抗生物素蛋白变体Strep-Tactin特异性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脱硫生物素进行洗脱，且Strep tag和Strep-Tactin相互作用不受变性剂影响，可在变性条件下纯化。基于亲合素与生物素的亲合纯化基于亲合素与生物素的亲合纯化3.6 FLAG标签，标签，T7标签和标签和S标签标签FLAG肽序列（DYKDDDDK）：亲水性很强，片段小，且具有肠激酶的酶切位点，一般不会影响目标蛋白活性。昂贵。T7 标签：T7 基因10蛋白的最前面11个氨基酸，通过免疫亲和层析进行纯化。S标签：
19、15 个氨基酸的多肽标签，可以特异性的和S-蛋白介质结合。由于S标签和S-蛋白结合形成有活性的核糖核酸酶，可灵敏的定量检测融合蛋白。3.7 3.7 亲和标签的去除亲和标签的去除三种情况不必去除标签： 目标蛋白作为免疫原用来产生和纯化抗体； 目标蛋白的生物活性不受融合标签的影响； 目标蛋白用来直接固定化在介质上。去除法：化学法（廉价，缺乏选择，反应剧烈） 酶法（温和，特异性强，成本较高）剪切方法剪切方法剪切位点序列剪切位点序列注释注释 化学法化学法溴化氰溴化氰MetMet需需70%70%甲酸，室温甲酸，室温羟胺羟胺AsnGlyAsnGlypHpH9 9，需加热，需加热，甲酸甲酸AspProAsp
20、Pro70%70%甲酸，需加热甲酸，需加热酶法酶法肠激酶肠激酶Asp-Asp-Asp-Asp-LysAsp-Asp-Asp-Asp-Lys内切酶内切酶赖氨酸后为脯氨酸不能剪切赖氨酸后为脯氨酸不能剪切其它碱性氨基酸残基后有非特异性剪切其它碱性氨基酸残基后有非特异性剪切具有活性的具有活性的pHpH范围为范围为4.54.5到到9.59.5，温度范围，温度范围44到到4545凝血因子凝血因子a a蛋白酶蛋白酶Ile-Glu/Asp-Gly-ArgIle-Glu/Asp-Gly-Arg内切酶内切酶精氨酸后为脯氨酸和精氨酸不能剪切精氨酸后为脯氨酸和精氨酸不能剪切在在Gly-ArgGly-Arg后后为非特异
21、性剪切为非特异性剪切凝血酶凝血酶Leu-Val-Pro-ArgGly-SerLeu-Val-Pro-ArgGly-Ser牛来源内切酶牛来源内切酶存在非特异性剪切存在非特异性剪切生物素化后可用链霉抗生物素蛋白亲和层析清除生物素化后可用链霉抗生物素蛋白亲和层析清除PreScission PreScission 蛋白酶蛋白酶Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GlnGly-ProLeu-Glu-Val-Leu-Phe-GlnGly-ProGSTGST融合的鼻病毒蛋白酶，内切酶融合的鼻病毒蛋白酶，内切酶具有最优活性具有最优活性rTEVrTEV蛋白酶蛋白酶Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gl
22、nGlyGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-GlnGly重组的烟草蚀纹病毒蛋白酶，重组的烟草蚀纹病毒蛋白酶，内切酶内切酶具有具有8 8个氨基酸识别位点个氨基酸识别位点高特异性高特异性宽温度范围里具有活性宽温度范围里具有活性与与His-tagHis-tag融合后，酶切后使用金属螯合亲和层析清除融合后，酶切后使用金属螯合亲和层析清除二肽基氨基肽酶二肽基氨基肽酶(Xaa)(Xaa)2n2nXaa-Pro,Xaa-Pro, (Xaa) (Xaa)2n2nXaa- Xaa Pro, Xaa- Xaa Pro, (Xaa)(Xaa)2n2nLys/Arg/GlnLys/Arg/Gln外切酶外切酶终止氨
23、基酸为终止氨基酸为GlnGln时，可在谷氨酰胺环转移酶和焦谷氨酰胺肽时，可在谷氨酰胺环转移酶和焦谷氨酰胺肽酶作用下去掉酶作用下去掉GlnGln，可产生天然目标蛋白质，可产生天然目标蛋白质特异性强特异性强4. 4. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析原理： 凝胶过滤层析, 也称为分子筛、分子排阻层析。是以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。凝胶介质 葡聚糖 （glucose） 琼脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（acrylamide） 纤维素（cellulose）Pharmacia (GE)BioGelA ag
24、aroseBioGel P acrylamideBio-RadSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose原原 理理HydrophilicNo spontaneous binding Chemically and physically stableRigid to allow a high linear flow-rate应用范围应用范围蛋白质分离基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小分离； 如：凝胶过滤层析纯化细胞色素C 分子量测定蛋白质分子量（球形）的对数与
25、其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系； 如：高效凝胶过滤色谱法测定沙漠嘎多糖的重均相对分子质量样品脱盐或溶剂置换。 如：凝胶过滤溶液中蛋白质与硫酸铵的分离 5.5.离子交换层析离子交换层析原理 蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质所带电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶的作用力差异实现蛋白质的分离。种类 阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷 阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷介质 惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖 带电基团：羧甲基(带负电) 二乙基氨基(带正电) 平衡离子：负电基团的平衡离子氢或钠离子 正电基团
26、的平衡离子氢氧根离子或氯离子选择标准阳离子交换阴离子交换应用范围应用范围分离纯化生物大分子物质：分离纯化生物大分子物质：蛋白质，多糖，核酸 DEAE 离子交换层析分离血清蛋白质 离子交换层析技术在多糖分离纯化中的应用分离纯化小分子物质：氨基酸，有机酸，抗生素，核苷酸等分离纯化小分子物质：氨基酸，有机酸，抗生素，核苷酸等 氨基酸分析仪 炭样小单孢菌JXNU-1 广谱抗生素产物的分离及其理化性质 水处理水处理 简单而有效去除水中的杂质及各种离子，聚苯乙烯树脂广泛应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。 Millipore 有机还原剂离子交换树脂废水处理中的应用技术6. 6. 疏水作用层析疏
27、水作用层析原理蛋白质表面的疏水基团与介质的疏水配体的可逆相互作用，高浓度盐增强相互作用，低浓度盐减弱相互作用。方法 高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。层析方法层析方法亲和层析亲和层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析疏水层析疏水层析分离机制分离机制特异性亲和大小电荷疏水性选择性选择性非常高中等高高中等载量载量高低高高纯化速度纯化速度中等中等低高高生物相容性生物相容性好非常好好中等好目标蛋白得率目标蛋白得率高高高中等高捕获浓缩阶段捕获浓缩阶段+中间纯化阶段中间纯化阶段+精制纯化阶段精制纯化阶段+（三）
28、常用电泳技术（三）常用电泳技术 介绍介绍蛋白质常用电泳技术蛋白质常用电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）机制：1、因SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原有的电荷差异。2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质与SDS复合物的短轴长度相同，长轴长度随其分子量的大小呈正比变化。1. SDS-PAGESDS-PAGE不连续PAGE分离蛋白质的原理电荷效应浓缩效应 快慢
29、离子效应 凝胶浓度差效应分子筛效应电泳法测定未知蛋白的分子量2.2.等电聚焦电泳等电聚焦电泳3. 3. 双向电泳双向电泳第一向：根据蛋白质的等电点不同进行等电聚焦电泳；第二向：根据分子质量的不同进行SDS-PAGE。双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。Isoelectric focusingSDS gel electrophoresisTwo Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized蛋白纯化原则（Guidelines
30、 for Protein Purification）确定目标确定目标 purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性 to simplify technique selection and optimization确定活性测定方法确定活性测定方法 fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤 extra steps reduce yield and increase time, com
31、bine steps logically纯化目的确定纯化目标ASSAY: A method that measures the amount of a specific protein, in a mixture of others. If possible, the assay should give an estimate of the absolute concentration (e.g. mg/ml). Relative concentration is the next best.The method chosen will ultimately depend on the pro
32、perties of the target protein.Most common are: enzymatic assays. ligand-binding assays immunological assays活性测定方法的特点：快速、简便、特异和定量！活性测定方法的特点：快速、简便、特异和定量！确定活性检测方法确定活性检测方法尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤减少每步操作时间减少每步操作时间 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery减少添加物减少添加物 additives may nee
33、d to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays早期除去降解物早期除去降解物 for example, proteases每步使用不同的纯化方法每步使用不同的纯化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!二、蛋白质的性质与功能研究技术
34、二、蛋白质的性质与功能研究技术蛋白质鉴定蛋白质鉴定测定蛋白质的浓度 凯氏定氮法 紫外吸收法 分光光度法测定蛋白质的纯度鉴定目标蛋白质 蛋白质分子质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定1. 1. 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定凯氏定氮法 蛋白质平均含氮量为16；测定氮的含量来估算蛋白含量。紫外吸收法 芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收. 经验公式：蛋白质含量(mg/mL)=1.45 A280 0.74A260分光光度法 蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即
35、可查得样品的蛋白质含量 考马斯亮兰法等BradfordBradford法法2. 2. 纯度鉴定纯度鉴定鉴定方法 电泳纯：在电泳图谱中仅一条电泳条带 色谱纯：在层析图谱中仅一个洗脱峰 结晶纯：可获得蛋白质晶体相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要互相验证。3.3.蛋白质鉴定蛋白质鉴定分子质量及等电点测定（电泳）氨基酸组成与顺序分析蛋白质结晶与结构分析免疫印迹（western-blotting）鉴定3.1 3.1 氨基酸组成与序列分析氨基酸组成与序列分析氨基酸组成氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定顺序分析顺序分析
36、质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法（手工、自动）水解法Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法肼解法、羧肽酶法各类氨基酸序列分析仪器各类氨基酸序列分析仪器3.2 3.2 空间结构分析空间结构分析二级结构的比例 圆二色谱法三维结构 X射线晶体衍射法蛋白质晶体 核磁共振溶液中蛋白质的三维结构 电子显微镜3.3 3.3 免疫印迹鉴定免疫印迹鉴定原原 理理免疫印迹步骤免疫印迹步骤 凝胶电泳 转膜 抗原抗体显色反应STEP 1: SDS-PAGESTEP 2: WESTERN BLOTTINGSTEP 3: IMMUNE FLURESCENCE EMISSION装装 置置电泳槽
37、转印槽半干转印槽 浸渍转印槽 蛋白质蛋白质免疫印迹常见问题免疫印迹常见问题纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治”底部有气泡凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMED、 APS剂量不足或失效；凝胶太快：TEMED、 APS用量过多，胶太硬易裂SDS-PAGE SDS-PAGE 常见问题常见问题Western blot Western blot 常见问题常见问题1、技术问题（1）电泳（2）转膜2、抗体问题（特异性、浓度）3、蛋白质丰度4、荧光淬灭（蛋白量过大）1、背景过深2、抗体特异性3、
38、洗膜时间Western blot Western blot 常见问题常见问题1、加样量2、ECL试剂3、曝光时间Western blot Western blot 常见问题常见问题1、蛋白质降解2、蛋白质分子量内参Western blot Western blot 常见问题常见问题Western blotWestern blot常见问题常见问题4#：加样量过多 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间
39、结构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western；而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。Western blot常见问题常见问题在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？解答：1. 转移缓冲液中加入终浓度20%甲醇。因甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力，甲醇可防止凝
40、胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；2. 用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；3. 低浓度胶，如低至6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；4. 提高转移电压电流；增加转移时间。蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易过。怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直?解答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v效果好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混
41、匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶。三、蛋白质的相互作用研究技术三、蛋白质的相互作用研究技术蛋白质相互作用的网络图谱蛋白质相互作用的网络图谱蛋白质相互作用的重要意义蛋白质相互作用的重要意义200种蛋白质及2000种组合结构进行解析后，发现其中1/3的蛋白质相互组合会导致疾病，容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病情恶化。绝大多数疾病都是由10万种以上的特定蛋白质相互作用所致。蛋白质相互作用和识别在生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。 （一） 酵母双杂交技术（Yeast Two Hybr
42、id）（二）细胞内蛋白质共定位（Co-localization ）（三）谷胱苷肽-S-转移酶沉淀 (GST-pull down）（四）免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）（五）质谱（Mass spectrum ）（一）（一） 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain, BD)，C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain, AD)。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，U
43、AS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。 系统组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带一个或多个报告基因的宿主菌株。 1. 1. 原原 理理BDXCOOHAD cDNANH2 COOH共转化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNA libraryNH2Gal4Gal4优点：检测在活细胞内进行，体现真核细胞内真实情况可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用 可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库应用
44、：检测已知蛋白质之间的相互作用 确定蛋白质作用功能区域位点确定未知蛋白质之间的相互作用确定基因治疗中多肽类药物的作用机理局限性检测定位于细胞核内的蛋白质间相互作用“假阳性” ：某些蛋白本身具有激活转录功能融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能“假阴性”：不利于核外蛋白研究2. 酵母双杂交的实验步骤酵母双杂交的实验步骤 构建诱饵质粒（X-BD) 将质粒转化酵母菌 检测X-BD蛋白在酵母中的表达 通过酵母生长曲线检测X-BD是否有毒性 进行自激活测试 将文库质粒共转化入X-BD-酵母 筛选阳性克隆子（四缺，x-gal显色反应） 共转化再次确认相互作用 将阳性克隆子在二缺平板上划线3次 提取酵母质粒，转
45、化E. coli，提取质粒 PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子 DNA测序 NCBI数据库搜索 举 例酵母双杂交前准备工作21kb5kb3.5kb2kb1.5kb M 1 构建诱饵质粒构建诱饵质粒诱饵蛋白的表达诱饵蛋白的表达X-BDGal4-BD检测诱饵蛋白是否有毒性检测诱饵蛋白是否有毒性1 2 3Western blot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生长曲线酵母生长曲线1.1.未转化酵母未转化酵母2.BD-2.BD-酵母酵母3.X-BD-3.X-BD-酵母酵母酵母双杂交结果酵母双杂交结果X-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADGal4-BD
46、+MPDIPO13+Gal4-ADSD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）举 例SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）Gal4-BD+Gal4-ADGal4-BD+Y-ADX-BD+Gal4-AD X-X-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举 例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD酵母双杂交测序结果酵母双杂交测序结果酵母双杂交获得的阳性克隆质粒经过DNA测序，由NCBI数据库的BLAST检索cDNA编码的蛋白质举 例测序结果
47、查询过程测序结果查询过程cDNA序列NCBIBLASTNucleotide megablast searchformatresults实例1BlastResults3. 3. 酵母双杂交系统的类型酵母双杂交系统的类型研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系 单向酵母双杂交系统-His-Ura这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。 在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。 反向双杂交系统酵母三杂交系统第1、2个融合蛋白必须通过与成分3的结合，间接起到激活报道基因转录的作用，不能直接激活报告基因
48、的转录；成分3具有分别与第1、2个融合蛋白结合的区域。核外双杂交技术Sos Recruitment System，SRS 36 36 membrane哺乳动物双杂交系统X-半乳糖苷酶, 萤火虫和海肾荧光素酶（二）细胞内蛋白质共定位（二）细胞内蛋白质共定位绿色荧光绿色荧光罗丹明染色罗丹明染色重重 叠叠相相 差差（三）谷胱甘肽（三）谷胱甘肽-S-S-转移酶沉淀转移酶沉淀GSTXY谷胱甘肽谷胱甘肽- -琼脂糖球珠琼脂糖球珠细胞裂解物细胞裂解物 tube44下孵育下孵育2h2h GSTGST融合蛋白融合蛋白GSTXY+GST pull down验证两种已知蛋白质的相互作用举 例inputGSTY-GF
49、P + + +X-GSTY-GFPX-GFP + + +GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFP（四）免疫共沉淀（四）免疫共沉淀免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用Y-GFPY-GFPGFPY-GFP+X-HAIP: HA control IgGIP: HA GFPAnti-GFPAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAAnti-HAAnti-HAY-GFPX-HAinputinput举 例如何寻找如何寻找未知的未知的相互作用蛋白质？相互作用蛋白质？ （五）质谱分析相互作用蛋白质（五）质谱分析相互作用蛋白质生物质谱仪：主要进行生物大分子质量与结构分析。以八十年代后期出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪和电喷雾四极质谱仪为代表。可对生物大分子进行快速（样品/几分钟）、精确（0.01%）和高灵敏度（10-15mol）的测定。电喷雾电离质谱（ESI-MS）质谱分析流程质谱分析流程蛋白质信息数据库检索免疫沉淀与质谱仪分析蛋白质相互作用 质谱分析蛋白质相互作用网络质谱分析蛋白质相互作用网络常用仪器思考题思考题 已知某耐热微生物的基因a，其编码蛋白A的预测为磷酸化酶，请设计方案对该蛋白进行原核表达纯化及鉴定。写出具体步骤，理由及检测方法。Thank you !
