1、连续培养操作技术连续培养操作技术专题：专题：第一节第一节 概概 述述一、基本概念一、基本概念 连续培养连续培养又称连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐又称连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的发酵液总量维持恒定，使培养物在近似恒定使发酵罐内的发酵液总量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长的状态下生长的微生物培养方式微生物培养方式。 分批培养分批培养：细胞是在细胞是在封闭的系统封闭的系统中进行生长的。细胞中进行生长的。细胞的生长周期并不是微生物内在特性的表现，而是培养液中的生长周期并不是微
2、生物内在特性的表现，而是培养液中营养物受到一定限制的结果；细胞生长的中断是必需营养营养物受到一定限制的结果；细胞生长的中断是必需营养物消耗或有毒物质积累的结果。物消耗或有毒物质积累的结果。 连续培养连续培养：细胞是在细胞是在开放系统开放系统中进行生长的。可在培养中进行生长的。可在培养过程中移去部分培养液，同时以同样的速度加入新的培养过程中移去部分培养液，同时以同样的速度加入新的培养基质，使整个系统中的微生物数量维持在连续的稳定生长基质，使整个系统中的微生物数量维持在连续的稳定生长状态。状态。与分批培养根本区别：与分批培养根本区别：二、连续培养的特点二、连续培养的特点 1、就实用性而言：、就实用
3、性而言：生产效率高、占地面积小、节省劳生产效率高、占地面积小、节省劳力、节约能量力、节约能量(如接种体的制备、反应器的清洗、灭菌如接种体的制备、反应器的清洗、灭菌)、产、产物质量一致、自动化程度高、可控性好，培养基制备技术和物质量一致、自动化程度高、可控性好，培养基制备技术和下游加工技术更为有效和经济。下游加工技术更为有效和经济。 2. 连续培养的最大特点是：连续培养的最大特点是： 微生物细胞的生长速度和产物的代谢均处于一个恒定微生物细胞的生长速度和产物的代谢均处于一个恒定的状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量的状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。代谢产
4、物的目的。 在连续培养过程中微生物细胞所处的环境条件，如营养在连续培养过程中微生物细胞所处的环境条件，如营养物质的浓度、产物浓度、物质的浓度、产物浓度、pH以及微生物细胞的浓度、比生以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节微生物细胞的生长速度。微生物细胞的生长速度。 3、作为一种研究工具：、作为一种研究工具：连续培养可以提供一种恒定的连续培养可以提供一种恒定的培养状态，在此状态下微生物的比生长速度恒定，细胞的培养状态，在此状态下微生物的比生长速度恒定，细胞的生理生化特性较为一致，是研究微生物生理学、遗传学及生
5、理生化特性较为一致，是研究微生物生理学、遗传学及生态学的理想材料。生态学的理想材料。 4、连续培养用于生产：、连续培养用于生产：有利于生产效率和控制技术自有利于生产效率和控制技术自动化程度的提高。动化程度的提高。 5、工业化应用的主要障碍：、工业化应用的主要障碍：（1）一些生产株系在连续培养过程中会由于筛选压力而产一些生产株系在连续培养过程中会由于筛选压力而产生一定的变异和变得不稳定。这是其工业化应用的主要障生一定的变异和变得不稳定。这是其工业化应用的主要障碍，对于碍，对于基因修饰细胞基因修饰细胞尤为如此。尤为如此。 （2）另外，在大规模生产过程中，要在长时间内保持同另外，在大规模生产过程中，
6、要在长时间内保持同样的培养环境是很难的。样的培养环境是很难的。 （3）有时，细胞在反应器壁和传感器上的有时，细胞在反应器壁和传感器上的黏附黏附会妨碍培会妨碍培养过程的长期运转。养过程的长期运转。三、连续培养的应用三、连续培养的应用 1、在连续培养过程中可以独立地改变某一个生长参数、在连续培养过程中可以独立地改变某一个生长参数，从而有利于在加工过程的优化中对细胞的，从而有利于在加工过程的优化中对细胞的生长和代谢动生长和代谢动力学力学进行研究。进行研究。 2、与分批培养方式相比，连续性混合培养方式更易于、与分批培养方式相比，连续性混合培养方式更易于进行进行多菌种间的竞争作用或相互作用多菌种间的竞争
7、作用或相互作用方面的研究。方面的研究。 3、在连续培养过程中可以、在连续培养过程中可以“捕捉捕捉”到一些在分批培养到一些在分批培养过程中很难观察到的现象，如：过程中很难观察到的现象，如：同步生长和振荡现象同步生长和振荡现象。 4、对连续培养在一个、对连续培养在一个变量上浮或下滑过程中的过渡性变量上浮或下滑过程中的过渡性质质进行观察，是研究细胞生长和代谢规律的一种有效手段进行观察，是研究细胞生长和代谢规律的一种有效手段。这种。这种过渡特性过渡特性也可用于培养方式的设计与优化。也可用于培养方式的设计与优化。 5、除此之外，连续培养还是、除此之外，连续培养还是筛选筛选那些具有优良生物学那些具有优良生
8、物学特性和繁殖力的特性和繁殖力的菌系菌系的有效手段。的有效手段。 在在20世纪世纪70年代，连续培养的应用使年代，连续培养的应用使生物学和细胞生理生物学和细胞生理学学方面的基础研究受益匪浅，并在方面的基础研究受益匪浅，并在80年代和年代和90年代初期重新年代初期重新得到使用。得到使用。 其主要原因是：连续培养在单细胞蛋白、乙醇、溶剂、其主要原因是：连续培养在单细胞蛋白、乙醇、溶剂、食品的工业化生产及废水处理中具有巨大的应用潜力。食品的工业化生产及废水处理中具有巨大的应用潜力。 目前，连续培养在生物技术中的应用多集中在目前，连续培养在生物技术中的应用多集中在废水处废水处理、初级代谢物理、初级代谢
9、物 (如乙醇、有机酸如乙醇、有机酸) 和发酵型食品的生产和发酵型食品的生产、酶的催化反应、酶的催化反应等方面。等方面。 另外，对另外，对动物细胞动物细胞进行连续培养，可以进行单克隆抗进行连续培养，可以进行单克隆抗体和重组蛋白质的生产。体和重组蛋白质的生产。 原因：原因：难以保证在长时间的连续培养过程中进行纯种难以保证在长时间的连续培养过程中进行纯种培养，而且菌种在此培养条件下发生变异的可能性较大，培养，而且菌种在此培养条件下发生变异的可能性较大，在工业规模的生产上很少采用连续发酵。在工业规模的生产上很少采用连续发酵。 目前，只有在目前，只有在丙酮丁醇厌氧发酵丙酮丁醇厌氧发酵、纸浆液生产饲料酵纸
10、浆液生产饲料酵母母以及以及活性污泥处理各种废水活性污泥处理各种废水等方面，才使用连续发酵工等方面，才使用连续发酵工艺。艺。 但是，但是，工业规模的生产上很少采用连续发酵工业规模的生产上很少采用连续发酵连续培养技术的主要用途依然局限于实验室规模的基础研连续培养技术的主要用途依然局限于实验室规模的基础研究和工艺优化。究和工艺优化。 例如：例如： 1、利用连续培养技术可以对一些新型生物技术，如、利用连续培养技术可以对一些新型生物技术，如通过基因修饰细胞对动物细胞和微生物培养进行定量研究通过基因修饰细胞对动物细胞和微生物培养进行定量研究。 2、连续培养技术还可用于生物反应器的定性、控制、连续培养技术还
11、可用于生物反应器的定性、控制及放大试验等方面的研究。及放大试验等方面的研究。 新型恒化器新型恒化器(如自动恒化器如自动恒化器)的开发与使用，不仅克服了的开发与使用，不仅克服了恒化器的一些不足之处，而且开辟了连续培养的新途径。恒化器的一些不足之处，而且开辟了连续培养的新途径。 随着高稳定性重组菌株和细胞系的出现以及高稳定性和随着高稳定性重组菌株和细胞系的出现以及高稳定性和准确性在线检测及控制技术的发展，作为研究工具，连续培准确性在线检测及控制技术的发展，作为研究工具，连续培养技术在基础研究和工业化生产中的应用将更为广泛。养技术在基础研究和工业化生产中的应用将更为广泛。发展潜力发展潜力四、连续培养
12、的操作简介四、连续培养的操作简介 根据控制模式，可分为两种类型。根据控制模式，可分为两种类型。 、恒化器、恒化器(Chemostat)系统：系统：以恒定不变的速度加入以恒定不变的速度加入某一必需的限制性营养物，从而使系统中的细胞密度与生某一必需的限制性营养物，从而使系统中的细胞密度与生长速度发生相应变化。长速度发生相应变化。 、恒浊器系统：、恒浊器系统：在此系统的控制过程中加入新鲜培在此系统的控制过程中加入新鲜培养基养基,从而使系统中的细胞密度维持不变。从而使系统中的细胞密度维持不变。 虽然控制菌体生长速度的方法并不一样，但他们是互虽然控制菌体生长速度的方法并不一样，但他们是互相补充的，可用相
13、同的动力学表达式来表示。相补充的，可用相同的动力学表达式来表示。 最简单的方法是在生化反应器内部的一定高度处安装最简单的方法是在生化反应器内部的一定高度处安装一个溢流管，从而当一定的新基质进入反应器时，就会有一个溢流管，从而当一定的新基质进入反应器时，就会有等量的培养液进入溢流管，并在重力作用下通过收集器；等量的培养液进入溢流管，并在重力作用下通过收集器；也可使泵体与培养液出口相连也可使泵体与培养液出口相连,但必须要保证新基质的压入但必须要保证新基质的压入速度与流出速度相等。速度与流出速度相等。 这两种系统的基本要求是使生化反应器中的培养液体积这两种系统的基本要求是使生化反应器中的培养液体积保
14、持不变。保持不变。控制培养液体积的方法控制培养液体积的方法:(一一) 典型恒化装置：典型恒化装置： 包括：包括：灭菌的培养基贮存器、加料和出料泵、附搅拌器的培养罐灭菌的培养基贮存器、加料和出料泵、附搅拌器的培养罐、流出液面指示器、流出液面指示器(以保持培养罐恒定的容积以保持培养罐恒定的容积)、pH控制器及取样装置控制器及取样装置，对需氧微生物还有通入无菌空气的装置。系统的，对需氧微生物还有通入无菌空气的装置。系统的pH、温度、溶解氧温度、溶解氧等控制恒定。等控制恒定。 比较复杂的系统是把整个反应器放在一个天平或负荷单元上，通比较复杂的系统是把整个反应器放在一个天平或负荷单元上，通过控制培养液的
15、出口速度来保证反应器的重量保持不变。过控制培养液的出口速度来保证反应器的重量保持不变。 在实际操作过程中，除了对基质进入反应器的量进行在实际操作过程中，除了对基质进入反应器的量进行控制以外，还需要考虑一些其他的控制以外，还需要考虑一些其他的环境参数环境参数，如温度、，如温度、pH、溶解氧。溶解氧。 除恒化器之外，能够进行连续培养的设备还有：除恒化器之外，能够进行连续培养的设备还有：1、维持细胞密度恒定不变的、维持细胞密度恒定不变的恒浊器恒浊器2、不改变剩余底物浓度的、不改变剩余底物浓度的营养恒定反应器营养恒定反应器(nutri-stat)3、维持、维持pH不变的不变的pH自动恒化器自动恒化器(
16、pH-auxostat)4、控制、控制CO2排出速率排出速率(CER)为恒值的为恒值的CER-恒化器恒化器(CER-stat)5、维持氧量不变的、维持氧量不变的溶氧恒化器溶氧恒化器(DO2-stat)和和摄氧恒化器摄氧恒化器(OUR-stat)等。等。其他连续培养设备其他连续培养设备第二节第二节 连续培养的控制技术连续培养的控制技术一、连续培养的基本理论一、连续培养的基本理论 连续培养的方式有：连续培养的方式有：单级连续培养、细胞回流单级连单级连续培养、细胞回流单级连续培养和多级连续培养续培养和多级连续培养。根据控制参数和操作模式不同，可将连续培养分为根据控制参数和操作模式不同，可将连续培养分
17、为4种类型种类型：这些培养方式的共同点是：这些培养方式的共同点是： 在培养过程中，新鲜的灭菌培养基以恒定的流速在培养过程中，新鲜的灭菌培养基以恒定的流速(F，单位为单位为L/h)输入，与原有培养液瞬时混合后，以同等速输入，与原有培养液瞬时混合后，以同等速度从培养罐流出，因而培养罐内液体体积度从培养罐流出，因而培养罐内液体体积(V ，单位为，单位为L)保持不变。保持不变。 流速与液体体积之比定义为流速与液体体积之比定义为稀释速度稀释速度(D)，即：即： D =F/V。1、单级连续培养恒化器 整个培养过程是在一个培养罐中完成的连续装置称为整个培养过程是在一个培养罐中完成的连续装置称为单级连续培养装
18、置。单级连续培养装置。 细胞在细胞在恒化器恒化器中的生长速度是由必需营养物的供应速中的生长速度是由必需营养物的供应速度所决定的。这些营养物可以是碳、氮、磷或一些微量元度所决定的。这些营养物可以是碳、氮、磷或一些微量元素或维生素，而所有的其他必需营养物必须保持过量。素或维生素，而所有的其他必需营养物必须保持过量。 在此，以最常用的在此，以最常用的完全混合型单级连续培养恒化器完全混合型单级连续培养恒化器为为例介绍恒定状态理论及其特性。例介绍恒定状态理论及其特性。(1) (1) 菌体平衡菌体平衡 图图6-2(a)是一个典型的是一个典型的单级恒化器单级恒化器示意。示意。在恒化器连续培养的初始阶段，是一
19、种分批培养。在在恒化器连续培养的初始阶段，是一种分批培养。在一种营养物成为限制性因素之前，就要开始加入该营养物一种营养物成为限制性因素之前，就要开始加入该营养物。直至所选择的营养物成为限制性因素时细胞才停止生长。直至所选择的营养物成为限制性因素时细胞才停止生长。在此之后，细胞的生长受制于培养基的添加速率。为了。在此之后，细胞的生长受制于培养基的添加速率。为了描述恒定状态下恒化器的特性，必须求出细胞和限制性营描述恒定状态下恒化器的特性，必须求出细胞和限制性营养物浓度与培养基流速养物浓度与培养基流速(主要的独立操作变量主要的独立操作变量)之间关系的方之间关系的方程。程。利用物料平衡可以很容易地建立
20、出有关的方程。对发酵利用物料平衡可以很容易地建立出有关的方程。对发酵罐而言菌体平衡可表示为：罐而言菌体平衡可表示为：这些方程成立的前提条件是假设这些方程成立的前提条件是假设:、细胞在反应器中的分布是完全随机的，即细胞未产生相互粘连或、细胞在反应器中的分布是完全随机的，即细胞未产生相互粘连或黏附于反应器壁上，而且悬浮液混合充分黏附于反应器壁上，而且悬浮液混合充分;、细胞群体是不可分隔的，且其中细胞的生理学特性完全一致、细胞群体是不可分隔的，且其中细胞的生理学特性完全一致;、细胞群体浓度、细胞群体浓度X是一个持续性变量，即细胞的数目足够大，单个细是一个持续性变量，即细胞的数目足够大，单个细胞的尺寸
21、小得足以使生物基质的不连续性可以忽略不计胞的尺寸小得足以使生物基质的不连续性可以忽略不计;、与培、与培|养基的总体积相比，细胞所占据的体积可以忽略不计。养基的总体积相比，细胞所占据的体积可以忽略不计。(2)、限制营养物的物料平衡 在连续培养的恒化器中，进料速度是外定的，细胞生长在连续培养的恒化器中，进料速度是外定的，细胞生长受制于所选择的营养物。也就是说受制于所选择的营养物。也就是说,微生物的特定生长速率微生物的特定生长速率(,单位为单位为h-1)是限制营养物一次函数。当连续培养同时受制是限制营养物一次函数。当连续培养同时受制于一种以上的营养物时，该定义就会得到拓展。但是于一种以上的营养物时，
22、该定义就会得到拓展。但是,加人加人长抑制性营养物或者能够产生毒素的营养物就会在所有营长抑制性营养物或者能够产生毒素的营养物就会在所有营养物都保持充足的情况下抑制菌体的生长。严格来讲养物都保持充足的情况下抑制菌体的生长。严格来讲,这些这些都不能称为恒化器连续培养。都不能称为恒化器连续培养。 假设培养基一进入反应器中假设培养基一进入反应器中,就可以立即均匀地分布就可以立即均匀地分布在整个培养基中在整个培养基中,那么对于发酵罐那么对于发酵罐,而言而言,限制营养物的物料平限制营养物的物料平衡可表示为衡可表示为: 式式(6-7)表示了连续培养细胞浓度与限制底物浓度的关系表示了连续培养细胞浓度与限制底物浓
23、度的关系。这里有几个假设。这里有几个假设,即即:假设细胞产率与比生长速度或稀释速度假设细胞产率与比生长速度或稀释速度无关无关,细胞浓度除一种限制底物外与其他营养组分无关细胞浓度除一种限制底物外与其他营养组分无关(它们都它们都过量存在过量存在);其他环境因子都保持恒定。这些假设都近似或完全其他环境因子都保持恒定。这些假设都近似或完全切合实际。切合实际。(3)、细胞浓度与稀释速度的关系 方程方程(68)和方程和方程(69)分别表示了分别表示了S和和X对培养基流速对培养基流速(也也就是就是D)的依赖关系。当流速很低时的依赖关系。当流速很低时,即即D很小时很小时,营养物全部被细营养物全部被细胞利用胞利
24、用,S0,细胞浓度细胞浓度X=S0/YX/S。如果如果D增加增加,开始开始X呈线性慢慢呈线性慢慢下降下降,然后然后,当当D =Dc= max时时,X下降到下降到0。开始时开始时S随随D的增加而缓的增加而缓慢增加慢增加,当当D = max时时,S接近于接近于S0。在方程在方程(69)中中,当当X=0时时,达到达到清洗点清洗点。（4 4）实际操作与理想化单级恒化器）实际操作与理想化单级恒化器连续培养动力学的偏离连续培养动力学的偏离 上述简单的上述简单的单级恒化器连续培养动力学单级恒化器连续培养动力学在某些微生物在某些微生物中的适应性已得到证明，其中包括细菌、酵母菌以及植物中的适应性已得到证明，其中
25、包括细菌、酵母菌以及植物细胞和动物细胞的培养。细胞和动物细胞的培养。 大多数情况下，在这些培养过程中大多数情况下，在这些培养过程中营养物质的进料速营养物质的进料速度很低度很低、在、在小型生物反应器小型生物反应器中进行、而且中进行、而且/或者或者其稀释速度其稀释速度的范围相对较窄的范围相对较窄。在这些条件及倍增时间在这些条件及倍增时间(td)的关系曲线下的关系曲线下，在建立上述方程时所做的假设是成立的。，在建立上述方程时所做的假设是成立的。 然而，偏离这种理然而，偏离这种理论的现象也时常发生论的现象也时常发生。 如图如图64所示，在所示，在连续培养过程中，由连续培养过程中，由于稀释速度的变化而于
26、稀释速度的变化而导致生物量的变化情导致生物量的变化情况偏离单级恒化器动况偏离单级恒化器动力学理论的典型曲线力学理论的典型曲线。 导致这种偏离的原导致这种偏离的原因：因：可能是细胞与设可能是细胞与设备和反应器的流体力备和反应器的流体力学作用，如细胞的学作用，如细胞的贴贴壁生长壁生长和和搅拌不充分搅拌不充分。 贴壁生长是由细胞贴壁生长是由细胞在玻璃或金属器皿的表在玻璃或金属器皿的表面产生黏附所造成的。面产生黏附所造成的。 如图如图6-4(a)所示，所示，贴壁生长会增大稳定状贴壁生长会增大稳定状态下的生物基质的浓度态下的生物基质的浓度，从而导致操作过程中，从而导致操作过程中的稀释速度大于最大特的稀释
27、速度大于最大特定生长率。定生长率。贴壁生长的影响贴壁生长的影响 Brown等人研究了不充等人研究了不充分的搅拌分的搅拌(滞流区滞流区)对连续操对连续操作培养的影响作培养的影响图图64(b)。 在一定的稀释速度范围在一定的稀释速度范围内细胞浓度会显著下降，其内细胞浓度会显著下降，其下降程度取决于滞流区的大下降程度取决于滞流区的大小以及滞流区和充分搅拌区小以及滞流区和充分搅拌区间的液体交换速度。间的液体交换速度。不充分的搅拌的影响不充分的搅拌的影响 在简单的恒化器动力学中，人们假设培养基是搅拌充在简单的恒化器动力学中，人们假设培养基是搅拌充分的，即一滴培养基在进入反应器后应该能够立刻、均分的，即一
28、滴培养基在进入反应器后应该能够立刻、均匀地分布在整个培养系统中。量化地讲，这就意味着搅匀地分布在整个培养系统中。量化地讲，这就意味着搅拌所需时间小于物质传递和生物反应需时间。拌所需时间小于物质传递和生物反应需时间。 在实验室规模的反应器中，所用的培养基只有几升，在实验室规模的反应器中，所用的培养基只有几升，这时通过维持适当的搅拌速率就可以获得近乎充分的搅这时通过维持适当的搅拌速率就可以获得近乎充分的搅拌效果，除非反应器具有搅拌不到的区域或者培养基质拌效果，除非反应器具有搅拌不到的区域或者培养基质变得很黏稠。变得很黏稠。 然而，在大型反应器中搅拌不完全的现象是不可避免然而，在大型反应器中搅拌不完
29、全的现象是不可避免的。的。 在实验室用反应器中连续培养动力学的偏离通常是由在实验室用反应器中连续培养动力学的偏离通常是由生物反应所致。生物反应所致。 其他因素包括：其他因素包括：由于溢出代谢现象和产物或底物对菌由于溢出代谢现象和产物或底物对菌体生长抑制作用的存在，维持需要量体生长抑制作用的存在，维持需要量(维持菌时所需要的营维持菌时所需要的营养物量养物量)和菌体生长量会产生变化；当菌体处于或低、或高和菌体生长量会产生变化；当菌体处于或低、或高的生长速率时都需要进行相应的调节和分离操作。的生长速率时都需要进行相应的调节和分离操作。 如图如图64c和图和图64d所示，维持代谢和生长受到抑制都会使稳
30、定培养状所示，维持代谢和生长受到抑制都会使稳定培养状态下的菌体浓度有所降低，当稀释速度较低时尤为如此。当菌体的生长受到态下的菌体浓度有所降低，当稀释速度较低时尤为如此。当菌体的生长受到强烈抑制时，只有当稀释速度明显低于强烈抑制时，只有当稀释速度明显低于max时，才能进行连续培养。时，才能进行连续培养。 上述操作因子可能会同时存在于一个培养系统。在这种情况下，菌体浓上述操作因子可能会同时存在于一个培养系统。在这种情况下，菌体浓度和稀释速度间的关系则变得更为复杂。度和稀释速度间的关系则变得更为复杂。维持代谢和生长受到抑制的影响维持代谢和生长受到抑制的影响（5 5）连续培养生产率与分批培养生产率的比
31、较）连续培养生产率与分批培养生产率的比较 目前在工业生产中连续培养主要用于生产目前在工业生产中连续培养主要用于生产微生物菌微生物菌体体。 以此为例，可比较一下连续培养的生产率与分批培以此为例，可比较一下连续培养的生产率与分批培养的生产率。养的生产率。 连续培养的生产率可表示如下连续培养的生产率可表示如下: 由式由式(6-16)可见，可见，max越大，连续培养生产率与分批培养越大，连续培养生产率与分批培养生产率之比越大，采用连续培养越有利，如生产率之比越大，采用连续培养越有利，如max过小，则不过小，则不宜采用连续培养。宜采用连续培养。2. 自动恒化器连续培养 在自动恒化器中可以通过调节培养基的
32、输入速度来使在自动恒化器中可以通过调节培养基的输入速度来使菌体生长依赖性参数保持恒定，稀释速度和菌体的生长速菌体生长依赖性参数保持恒定，稀释速度和菌体的生长速度也得到相应调节。度也得到相应调节。 对于自动恒化器而言，可选择性控制的反馈参数是相对于自动恒化器而言，可选择性控制的反馈参数是相当广泛的，其中包括当广泛的，其中包括细胞浓度细胞浓度(浊度浊度)、pH、溶解氧的浓度溶解氧的浓度、气体流中的、气体流中的C02含量以及营养物和产物的浓度含量以及营养物和产物的浓度。 有些时候参照自动恒化器的控制方式，以营养物为反馈有些时候参照自动恒化器的控制方式，以营养物为反馈生长参数可以将生长参数可以将营养恒
33、定反应器营养恒定反应器改进为改进为营养自动恒化器营养自动恒化器。在不同种类的自动恒化器中应用最多的是在不同种类的自动恒化器中应用最多的是恒浊器和恒浊器和pH自动自动恒化器恒化器。 恒浊器中的控制参数是恒浊器中的控制参数是菌体浓度菌体浓度。 由菌体浓度传感器产生的信号传给泵体，当菌体浓度由菌体浓度传感器产生的信号传给泵体，当菌体浓度高于所规定的水平时泵体自动加入培养基。这样通过恒浊高于所规定的水平时泵体自动加入培养基。这样通过恒浊器控制的反应器中的菌体浓度是一定的，稀释速度则自行器控制的反应器中的菌体浓度是一定的，稀释速度则自行调节至稳态值。调节至稳态值。 （而在恒化器中稀释速度是一定的，菌体浓
34、度则自（而在恒化器中稀释速度是一定的，菌体浓度则自行调节至稳态值）。行调节至稳态值）。恒浊器恒浊器 从原则上来讲，恒浊器适用于菌体浓度随稀释速度改从原则上来讲，恒浊器适用于菌体浓度随稀释速度改变变(如接近于极限稀释速度如接近于极限稀释速度)而产生明显变化的培养过程。而产生明显变化的培养过程。 另外，恒浊器也可在有多余底物存在的一定情况下进行另外，恒浊器也可在有多余底物存在的一定情况下进行菌体培养。菌体培养。 既然菌体的生长速度并不是固定的，利用该培养系统既然菌体的生长速度并不是固定的，利用该培养系统就可以筛选出生长较快的微生物。就可以筛选出生长较快的微生物。 通过不同基因型微生物通过不同基因型
35、微生物(突变体突变体)的筛选和细胞代谢的的筛选和细胞代谢的调节可以增大菌体的最大生长速度。调节可以增大菌体的最大生长速度。 但是由于微生物在传感器表面的黏附，恒浊培养技但是由于微生物在传感器表面的黏附，恒浊培养技术的应用仅局限于术的应用仅局限于单细胞微生物单细胞微生物，而且也难于进行长期，而且也难于进行长期和大规模培养。和大规模培养。 随着以随着以激光或近红外透射激光或近红外透射/散射散射为基础的为基础的光学传感器光学传感器的发展，与菌体长期控制有关的问题可能会得到部分解的发展，与菌体长期控制有关的问题可能会得到部分解决。决。 在在pH自动恒化器中，结合使用了自动恒化器中，结合使用了新鲜培养基
36、的加入新鲜培养基的加入和和pH的控制技术的控制技术。 当当pH偏离设定的偏离设定的pH时，就通过加入新鲜培养基的方式时，就通过加入新鲜培养基的方式使使pH回到设定值。回到设定值。 培养基的加入速度取决于培养基中营养物的缓冲能力的培养基的加入速度取决于培养基中营养物的缓冲能力的浓度。浓度。 pH自动恒化器自动恒化器 在用新鲜培养基控制在用新鲜培养基控制pH的过程中，通过调整进料的缓的过程中，通过调整进料的缓冲能力和（或）其中的限制营养物浓度，可以控制反应器冲能力和（或）其中的限制营养物浓度，可以控制反应器中限制营养物的水平。中限制营养物的水平。 当培养系统的产酸量或产碱量比较高时，培养基的缓当培
37、养系统的产酸量或产碱量比较高时，培养基的缓冲能力可能达不到要求。在这种情况下可将营养物和培养冲能力可能达不到要求。在这种情况下可将营养物和培养基分别加入。基分别加入。 营养物的浓度决定了菌体在摄入营养物时产生和释放营养物的浓度决定了菌体在摄入营养物时产生和释放出的离子种类和数量。出的离子种类和数量。 菌体在菌体在pH自动恒化器中的自动恒化器中的特异性生长速率特异性生长速率与与培养基的培养基的缓冲力和培养基中营养物质的浓度缓冲力和培养基中营养物质的浓度呈反比。呈反比。 简而言之，菌体在低缓冲力培养基中的生长速率是其简而言之，菌体在低缓冲力培养基中的生长速率是其在缓冲良好的培养基中的在缓冲良好的培
38、养基中的10倍以上。菌体浓度也主要取决倍以上。菌体浓度也主要取决于培养基的缓冲力。于培养基的缓冲力。 培养系统中培养系统中pH的变化是细胞生长情况及其代谢活力的的变化是细胞生长情况及其代谢活力的良好指示。它是菌体在吸收营养物的过程中产生不同离子良好指示。它是菌体在吸收营养物的过程中产生不同离子种类和所释放出的离子数目的一个综合表现。种类和所释放出的离子数目的一个综合表现。 导致培养系统中导致培养系统中pH下降的原因：下降的原因：通常是有机酸的生成通常是有机酸的生成和铵的吸收。和铵的吸收。 然而对于在蛋白质或氨基酸富裕的培养基上生长的微生然而对于在蛋白质或氨基酸富裕的培养基上生长的微生物而言，物
39、而言，pH将会随着菌体的生长而增大，因为菌体在此过将会随着菌体的生长而增大，因为菌体在此过程中产生了多余的氨。程中产生了多余的氨。一般而言，自动恒化器优于传统的恒化器。一般而言，自动恒化器优于传统的恒化器。 首先，自动恒化器可以在接近最大生长速率的首先，自动恒化器可以在接近最大生长速率的“高获取量高获取量(high gain)”范围内进行操作。范围内进行操作。 其次，在高的稀释速度下，自动恒化器达到稳定态的速度比开放其次，在高的稀释速度下，自动恒化器达到稳定态的速度比开放循环式恒化器更快。循环式恒化器更快。 再次，在自动恒化器中菌群选择压力下可以加快培养的进程。再次，在自动恒化器中菌群选择压力
40、下可以加快培养的进程。 最后，自动恒化器可以设计成最后，自动恒化器可以设计成双点式双点式(dual set-point)自动恒化器自动恒化器，可以同时控制两种生长参数可以同时控制两种生长参数(如两种营养物的浓度如两种营养物的浓度)。这种双点式自动。这种双点式自动恒化器可以很容易地控制营养物的浓度比例。恒化器可以很容易地控制营养物的浓度比例。 但从另一方面来讲，自动恒化器的试验计划和操作过程是比较复但从另一方面来讲，自动恒化器的试验计划和操作过程是比较复杂的。杂的。3. 3. 细胞再循环单级恒化器细胞再循环单级恒化器 细胞循环是在连续培养过程中提高菌体和产物浓度的一细胞循环是在连续培养过程中提高
41、菌体和产物浓度的一种有效途径。在此系统的操作过程中稀释速度高于菌体的最种有效途径。在此系统的操作过程中稀释速度高于菌体的最大生长速度，从而导致较高的反应器产出量。这种反应器的大生长速度，从而导致较高的反应器产出量。这种反应器的另一特点是，稀释速率几乎与菌体的生长速率无关。由于菌另一特点是，稀释速率几乎与菌体的生长速率无关。由于菌体再循环操作增大了稀释速率的临界值，从而可以防止底物体再循环操作增大了稀释速率的临界值，从而可以防止底物抑制作用所带来的菌体生长休克现象。抑制作用所带来的菌体生长休克现象。 特别是它具有以下优点：、在流出物的处理过程中生特别是它具有以下优点：、在流出物的处理过程中生长限
42、制营养物不可避免地得到稀释；、当所用的底物为气长限制营养物不可避免地得到稀释；、当所用的底物为气体时，底物的溶解性低；、因为仰制性产物的形成，生长体时，底物的溶解性低；、因为仰制性产物的形成，生长限制底物的浓度必须处于有限水平；、产物的形成与菌体限制底物的浓度必须处于有限水平；、产物的形成与菌体的生长无关。的生长无关。 用于回收菌体的方法很多，如过滤、沉淀、离心和固定用于回收菌体的方法很多，如过滤、沉淀、离心和固定化。化。 根据反应器内部或外部的分离设施，可将这些方法进一根据反应器内部或外部的分离设施，可将这些方法进一步分为步分为内部系统内部系统和和外部系统外部系统。 除废水的生物处理以外，最
43、常用的一种方法是，在反应除废水的生物处理以外，最常用的一种方法是，在反应器外部用膜过滤的方法对培养物进行浓缩。器外部用膜过滤的方法对培养物进行浓缩。 废水的生物处理中长期使用的一种方法是，对污泥进行废水的生物处理中长期使用的一种方法是，对污泥进行沉淀后再进行循环处理。沉淀后再进行循环处理。 图图62(c)所示，单级恒化器的流出液经过滤、沉淀、所示，单级恒化器的流出液经过滤、沉淀、离心或固定化后，再将得到的微生物细胞部分地回加到发酵离心或固定化后，再将得到的微生物细胞部分地回加到发酵罐内，形成再循环系统。这样可以增加系统的稳定性，而且罐内，形成再循环系统。这样可以增加系统的稳定性，而且可以增加恒
44、化器内的细胞浓度。可以增加恒化器内的细胞浓度。 X1、 X2分别代表从发酵罐和离心机流出的细胞浓度，分别代表从发酵罐和离心机流出的细胞浓度，F和和F1分别代表流入发酵罐的培养基流速和流出离心机的培分别代表流入发酵罐的培养基流速和流出离心机的培养液流速。如果引入再循环比率养液流速。如果引入再循环比率和浓缩因子和浓缩因子C两个参数，两个参数，再采取与前述类似方法可推导出，在恒定状态下再采取与前述类似方法可推导出，在恒定状态下:动力学：动力学： 由此可见，当存在细胞再循环时由此可见，当存在细胞再循环时不再等于不再等于D0，因为，因为C 1，所以，所以1+一一C永远小于永远小于1，则，则永远小于永远小
45、于D。这就表明，这就表明，在带有细胞再循环的单级恒化器中，有可能达到很高的稀释在带有细胞再循环的单级恒化器中，有可能达到很高的稀释速度，而细胞没有被速度，而细胞没有被“清洗清洗”的危险。同样，恒定状态下的的危险。同样，恒定状态下的细胞浓度比不具有再循环功能的恒化器中的细胞浓度高出一细胞浓度比不具有再循环功能的恒化器中的细胞浓度高出一个因子个因子1/(1+一一C)。4. 多级连续培养图图6-2(d)为一种简单的多级连续培养：为一种简单的多级连续培养： 由表由表6-2可见，在第可见，在第2个发酵罐内个发酵罐内 2D2，如果不向第，如果不向第2个发酵罐补加新鲜培养基，则第个发酵罐补加新鲜培养基，则第
46、2个发酵罐内的净生长速度个发酵罐内的净生长速度就会很小；如果向第就会很小；如果向第2个发酵罐内补加新鲜培养基，不仅可个发酵罐内补加新鲜培养基，不仅可以促进细胞的生长，而且可以使以促进细胞的生长，而且可以使D处于比处于比 max更大的数值。更大的数值。二、实验设计与操作二、实验设计与操作1. 1. 实验的设计与操作原则实验的设计与操作原则 在设计一个长期运转的连续培养系统时，必须要注意在设计一个长期运转的连续培养系统时，必须要注意到，由于选择压力的存在有可能使菌体产生自发性突变。到，由于选择压力的存在有可能使菌体产生自发性突变。具有竞争优势的菌体迟早会战胜反应器中的原始菌株。因具有竞争优势的菌体
47、迟早会战胜反应器中的原始菌株。因此在研究均一细胞群体生理特性的过程中，为了研究细胞此在研究均一细胞群体生理特性的过程中，为了研究细胞对环境条件变化的反应和由于突变所导致的基因变化，对环境条件变化的反应和由于突变所导致的基因变化，一一次培养的时间不应过长。次培养的时间不应过长。 （1 1）实验的设计）实验的设计 在培养时间过长在培养时间过长( (例如：对于肠杆菌来讲，大约为例如：对于肠杆菌来讲，大约为2323周周) )时，一些培养物会在代谢压力时，一些培养物会在代谢压力( (例如：底物过量、生长例如：底物过量、生长因子的限制、产物抑制等因子的限制、产物抑制等) )下产生聚集或产生强烈的贴壁生下产
48、生聚集或产生强烈的贴壁生长。长。 当对在这种情况下获得的数据进行分析时应该加以注当对在这种情况下获得的数据进行分析时应该加以注意。对于这些类型的培养来讲，也应对操作时间进行限制意。对于这些类型的培养来讲，也应对操作时间进行限制。 如果计划进行长时期操作，应该考虑到，对管道如果计划进行长时期操作，应该考虑到，对管道( (由于由于泵送和酸、碱溶液的作用产生破坏泵送和酸、碱溶液的作用产生破坏) )和加工中所用到的气体和加工中所用到的气体输入和流出管道进行必要的替换。输入和流出管道进行必要的替换。对培养基进行设计的基础是，用于细胞生长和产物合成所对培养基进行设计的基础是，用于细胞生长和产物合成所需要的
49、营养物质，除了含有平衡生长所必需的所有组分或需要的营养物质，除了含有平衡生长所必需的所有组分或那些有可能对菌体的生长动力学和产物形成产生干扰的营那些有可能对菌体的生长动力学和产物形成产生干扰的营养物质以外，还应在连续培养中建立起营养物质的适当浓养物质以外，还应在连续培养中建立起营养物质的适当浓度。特别是，要对某种生长因子进行限制时更要如此。随度。特别是，要对某种生长因子进行限制时更要如此。随着新型生物技术着新型生物技术(如重组如重组DNA)在高价值产物的生产过程中在高价值产物的生产过程中变得越来越重要，化学合成培养和适应进料方式的应用也变得越来越重要，化学合成培养和适应进料方式的应用也越来越广
50、泛。对于这些目的来讲化学计量学和代谢调控的越来越广泛。对于这些目的来讲化学计量学和代谢调控的思路是特别重要的。思路是特别重要的。（2 2）培养基的配制）培养基的配制为了避免沉淀物的产生，应该考虑到培养基的稳定性和营为了避免沉淀物的产生，应该考虑到培养基的稳定性和营养物质间的相互作用。养物质间的相互作用。培养基中组分产生沉淀的原因可能是，高浓度的金属离子培养基中组分产生沉淀的原因可能是，高浓度的金属离子(如铁、钙、镁等离子如铁、钙、镁等离子)、高压灭菌过程中的高温以及高、高压灭菌过程中的高温以及高pH。这会导致金属离子和一些其他痕量元素的损失以及对细胞的这会导致金属离子和一些其他痕量元素的损失以
