1、学习要求学习要求掌握掌握：酶的来源和生产、酶纯化的主要方法、：酶的来源和生产、酶纯化的主要方法、固定化酶和固定化细胞的制备方法、酶反应固定化酶和固定化细胞的制备方法、酶反应器的基本类型器的基本类型熟悉熟悉：酶分离纯化的一般过程、固定化酶的：酶分离纯化的一般过程、固定化酶的性质和指标、酶反应器的性能评价及操作性质和指标、酶反应器的性能评价及操作了解了解：酶工程的研究现状、酶工程在制药中：酶工程的研究现状、酶工程在制药中的应用、治疗性的酶类药物的应用、治疗性的酶类药物本章主要内容本章主要内容概述概述1酶工程技术酶工程技术2酶工程研究新技术酶工程研究新技术3酶工程在制药工业中的应用酶工程在制药工业中
2、的应用4第一节第一节 概概 述述一、酶与酶工程一、酶与酶工程1. 酶（酶（Enzyme）u具有具有催化活性催化活性和和高度专一性高度专一性的生物催化剂的生物催化剂。u催化特点：催化特点： 高效性高效性 专一性专一性 可调控可调控 不稳定不稳定1. 酶（酶（Enzyme）u根据化学本质分为：根据化学本质分为： 蛋白酶（蛋白酶（P酶）酶） 核酸酶（核酸酶（R酶）酶）蛋白酶蛋白酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）（全酶）= 酶蛋白酶蛋白 + 辅因子辅因子辅酶辅酶辅基辅基u酶工程：酶工程：酶学酶学、微生物学微生物学与与工程学工程学相互渗透相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。结合、发展而形成的一门
3、新的技术学科。u化学酶工程（初级酶工程）：化学酶工程（初级酶工程）： 通过化学修饰、酶的固定化、化学合成等改通过化学修饰、酶的固定化、化学合成等改善酶的性质，提高催化效率善酶的性质，提高催化效率u生物酶工程（高级酶工程）：生物酶工程（高级酶工程）： 通过通过DNA重组技术生产目标酶，定向修饰与重组技术生产目标酶，定向修饰与改造获得突变酶、合成全新的酶等改造获得突变酶、合成全新的酶等2. 酶工程酶工程（enzyme engineering）二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展1894年，年，日本科学家首次从日本科学家首次从米曲霉米曲霉中提炼中提炼出出淀粉酶淀粉酶，并将淀粉酶用作治
4、疗消化不良并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物的药物，从而开创了人类有目的的生产和从而开创了人类有目的的生产和应用酶制剂的先例。应用酶制剂的先例。1908年，年，德国科学家从动物胰脏中提取出德国科学家从动物胰脏中提取出胰酶胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物混合物），），并将胰酶用于皮革的鞣制。并将胰酶用于皮革的鞣制。1911年，年，美国科学家从木瓜中提取出美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋木瓜蛋白酶白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物蛋白质浑浊物。酶工程的名称出现在酶工程的名称出现在20世纪世纪20年代，主要年代，主要指自
5、然酶制剂在工业上的规模应用。指自然酶制剂在工业上的规模应用。二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展u1953年，年，Grubhoger 和和 Schleith 提出了提出了酶固酶固定化技术定化技术 。u1969年，日本科学家在工业上利用年，日本科学家在工业上利用固定化氨固定化氨基酰化酶基酰化酶拆分了拆分了DL-氨基酸。氨基酸。u1971年，年，第一届国际酶工程会议第一届国际酶工程会议提出酶工程提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。的应用。二、酶工程研
6、究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展20世纪世纪90年代，借助基因工程技术，可经年代，借助基因工程技术，可经过酶基因重组，利用微生物表达生产酶制过酶基因重组，利用微生物表达生产酶制剂。剂。基因工程基因工程+发酵技术发酵技术+发酵设备发酵设备二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展三、现代酶工程的研究内容三、现代酶工程的研究内容1. 酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；用开发；2. 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究酶和细胞的固定化及酶反应器的研究3. 酶的分子改造和化学修饰；酶的分子改造和化学修饰；4. 有机相中酶反应的研究；有机相
7、中酶反应的研究；5. 酶抑制剂、激活剂的开发与应用研究；酶抑制剂、激活剂的开发与应用研究；6. 模拟酶、合成酶的研究；模拟酶、合成酶的研究；7. 抗体酶、核酸酶的研究；抗体酶、核酸酶的研究；8. 酶的定向进化技术。酶的定向进化技术。（一）疾病诊断（一）疾病诊断（二）疾病治疗（二）疾病治疗（三）药物生产（三）药物生产（四）分析检测（四）分析检测四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用1. 通过通过酶活力变化酶活力变化进行疾病诊断进行疾病诊断酶酶疾病与酶活力变化疾病与酶活力变化淀粉酶淀粉酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胆碱酯酶胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机
8、磷中毒、风湿等，活力下降肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降酸性磷酸酶酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高碱性磷酸酶碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降升高；软骨发育不全等，活力下降谷丙转氨酶谷丙转氨酶/谷谷草转氨酶草转氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高肝病、心肌梗塞等，活力升高-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶（-GT）原发性和继发性肝癌，活力增高至原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活
9、力升高黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高胃蛋白酶胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降磷酸葡糖变位酶磷酸葡糖变位酶肝炎、癌症，活力升高肝炎、癌症，活力升高端粒酶端粒酶癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性肌酸磷酸激酶肌酸磷酸激酶（CK）心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高2. 用酶测定用酶测定物质的量的变化物质的量的变化进行疾病诊断进行疾病诊断酶酶测定的物质测定的物质用途用途葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断
10、糖尿病测定血糖、尿糖，诊断糖尿病尿素酶尿素酶尿素尿素测定血液、尿液中尿素的量，测定血液、尿液中尿素的量，诊断肝脏、肾脏病变诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶谷氨酰胺谷氨酰胺测定脑脊液中谷氨酰胺的量，测定脑脊液中谷氨酰胺的量，诊断肝昏迷、肝硬化诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶胆固醇胆固醇测定胆固醇含量，诊断高血脂测定胆固醇含量，诊断高血脂等等DNA聚合酶聚合酶基因基因通过基因扩增，基因测序，诊通过基因扩增，基因测序，诊断基因变异、检测癌基因断基因变异、检测癌基因3. 酶在酶在疾病治疗疾病治疗方面的应用方面的应用酶酶 来来 源源用用 途途淀粉酶淀粉酶胰脏、麦芽、微生物胰脏、麦芽、微生
11、物 治疗消化不良，食欲不振治疗消化不良，食欲不振溶菌酶溶菌酶蛋清、细菌蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶尿激酶人尿人尿治疗心肌梗塞治疗心肌梗塞链激酶链激酶链球菌链球菌治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折下出血，骨折青霉素酶青霉素酶蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶大肠杆菌大肠杆菌治疗白血病治疗白血病超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶微生物，植物，动物微生物，植物，动物 预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎肌炎，结肠炎胶原酶胶原酶细菌细
12、菌分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡疗溃疡溶纤酶溶纤酶蚯蚓蚯蚓溶血栓溶血栓核糖核酸酶核糖核酸酶胰脏胰脏抗感染，祛痰，治肝癌抗感染，祛痰，治肝癌4. 酶在酶在药物制造药物制造方面的应用方面的应用 酶酶来源来源用途用途青霉素酰化酶青霉素酰化酶微生物微生物制造半合成青霉素和头孢制造半合成青霉素和头孢菌素菌素11-羟化酶羟化酶霉菌霉菌制造氢化可的松制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶酪氨酸转氨酶细菌细菌制造多巴（制造多巴（L-二羟苯丙氨二羟苯丙氨酸）酸）-甘露糖苷酶甘露糖苷酶链霉菌链霉菌制造高效链霉素制造高效链霉素酰基氨基酸水解酶酰基氨基酸水解酶微生物微生物生产生产L-氨基酸
13、氨基酸5-磷酸二酯酶磷酸二酯酶桔青霉等微生物桔青霉等微生物生产各种核苷酸生产各种核苷酸多核苷酸磷酸化酶多核苷酸磷酸化酶微生物微生物生产聚肌胞，聚肌苷酸生产聚肌胞，聚肌苷酸无色杆菌蛋白酶无色杆菌蛋白酶细菌细菌由猪胰岛素（由猪胰岛素（Ala-30）转）转变为人胰岛素（变为人胰岛素（Thr-30）核糖核酸酶核糖核酸酶微生物微生物生产核苷酸生产核苷酸蛋白酶蛋白酶动物、植物、微生物动物、植物、微生物生产生产L-氨基酸氨基酸-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物黑曲霉等微生物生产人参皂甙生产人参皂甙-Rh25. 酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用（1）酶试剂盒酶试剂盒过氧化氢酶检测试剂盒过氧化氢酶
14、检测试剂盒 (Catalase Assay Kit)通过显色反应来检测细胞、组织或其它样通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶活性品中过氧化氢酶活性 （2）酶联免疫酶联免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA)免疫检测：让免疫检测：让抗体抗体与与酶复合物酶复合物结合，然后结合，然后通过通过显色显色来检测。来检测。 间接法间接法ELISA检测检测 夹心法夹心法ELISA检测检测 竞争法竞争法ELISA检测检测 5. 酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用（3）酶标基因探针酶标基因探针将酶与将酶与DNA直接进行交联直接进行交联, 杂
15、交后只要与酶杂交后只要与酶的底物显色便能观察结果。的底物显色便能观察结果。检测乙肝病人血清中的检测乙肝病人血清中的HBV DNA检测转基因材料及其后代检测转基因材料及其后代5. 酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用（4）酶传感器酶传感器5. 酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用第二节第二节 酶工程技术酶工程技术1. 液体酶制剂：液体酶制剂：稀酶液稀酶液/浓缩酶液，纺织工业浓缩酶液，纺织工业2. 固体粗酶制剂：固体粗酶制剂：粗酶液处理获得，皮革处理粗酶液处理获得，皮革处理/纤维素水解等纤维素水解等3. 纯酶制剂纯酶制剂：结晶、分离纯化后获得，分析试剂结晶、分离纯化后获得，分析试剂
16、/药用酶药用酶酶制剂的类型酶制剂的类型学生授课学生授课结合课本和酶工程所学内容，请各位同学结合课本和酶工程所学内容，请各位同学按照以下分组情况准备按照以下分组情况准备20min左右的授课内左右的授课内容及容及ppt（下周一每组选（下周一每组选1位同学在课堂上进位同学在课堂上进行讲授），计入平时成绩。行讲授），计入平时成绩。酶制剂的来源及制备（酶制剂的来源及制备（1-10号）号）酶的分离纯化（酶的分离纯化（11-20号）号）酶与细胞的固定化（酶与细胞的固定化（21-30号）号）酶反应器（酶反应器（31-41号）号）本节内容本节内容核酶核酶/脱氧核酶脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相的酶反应有机相的酶反应
17、酶分子的定点改造酶分子的定点改造酶分子的定向进化酶分子的定向进化酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰一、核酶（一、核酶（ribozyme）(一一) 核酶的发现核酶的发现(一一) 核酶的发现核酶的发现上世纪上世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学的和美国耶鲁大学的Sidnery Altan各自独立地发现各自独立地发现RNA具有生具有生物催化功能物催化功能，从而改变了生物催比剂的传，从而改变了生物催比剂的传统概念。统概念。T.Cech和和S.Altman共同获得了共同获得了1989年度年度诺贝诺贝尔化学奖尔化学奖。T.C
18、ech的研究工作的研究工作S.Altman的研究工作的研究工作启示：启示：T.Cech为什么能发现为什么能发现RNA的催化作用并获的催化作用并获得诺贝尔奖？得诺贝尔奖？如果你是一个如果你是一个不为常识所束缚不为常识所束缚的人，那么的人，那么，你有可能获诺贝尔奖，你有可能获诺贝尔奖 S.Altman为什么能发现为什么能发现RNA的催化作用并的催化作用并获得诺贝尔奖？获得诺贝尔奖？如果你能如果你能根据别人刚刚发表的成果马上修根据别人刚刚发表的成果马上修正自己的研究工作正自己的研究工作，那么，你有可能获诺，那么，你有可能获诺贝尔奖。贝尔奖。 认真做实验认真做实验认真看文献认真看文献1. 核酶：核酶：
19、具有生物催化功能的具有生物催化功能的RNA。 生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：其它： 模拟酶模拟酶 model enzyme 核酸类核酸类:核酶核酶 ribozyme脱氧核酶脱氧核酶 deoxyribozyme（二）核酶的概念和分类（二）核酶的概念和分类核酶与蛋白质酶的比较核酶与蛋白质酶的比较蛋白质酶的蛋白质酶的一级结构一级结构比核酶复杂比核酶复杂蛋白质酶具有一定蛋白质酶具有一定空间构象空间构象，酶的活性中，酶的活性中心具有刚性，核酶不具备心
20、具有刚性，核酶不具备蛋白质酶的蛋白质酶的活性中心活性中心由氨基酸组成，核酶由氨基酸组成，核酶的活性中心是金属离子的活性中心是金属离子核酶可以既是催化剂又是核酶可以既是催化剂又是底物底物，蛋白酶只，蛋白酶只是催化剂；是催化剂；核酶可以核酶可以传递遗传信息传递遗传信息，蛋白酶不可以，蛋白酶不可以 I型内含子型内含子剪接型核酶剪接型核酶 mRNA前体自我拼接前体自我拼接 II型内含子型内含子 内切核酸酶内切核酸酶+连接酶连接酶 锤头核酶锤头核酶剪切型核酶剪切型核酶 发夹核酶发夹核酶 丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDV)核酶核酶 RNA切割切割 蛋白质蛋白质-RNA复合酶复合酶 2. 核酶的分类核酶的
21、分类（三）核酶在医药领域的应用（三）核酶在医药领域的应用 核酶治疗疾病的原理核酶治疗疾病的原理 核酶的给药途径核酶的给药途径外源性给药外源性给药：直接将抗核酸酶降解的核酸：直接将抗核酸酶降解的核酸注射到组织或细胞内。注射到组织或细胞内。内源性给药内源性给药：利用基因疗法，借助逆转录：利用基因疗法，借助逆转录病毒载体和腺伴随病毒运送核酶病毒载体和腺伴随病毒运送核酶 核酶的给药途径核酶的给药途径 核酶在医学上的应用核酶在医学上的应用 展望展望二、脱氧核酶（deoxyribozyme ）利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的的单链单链DNA片段片段，具
22、有高效的催化活性和结构识，具有高效的催化活性和结构识别能力别能力 对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。 核酶核酶/脱氧核酶面临的问题脱氧核酶面临的问题三、抗体酶（三、抗体酶（abzyme）（一）抗体酶的概念与特点（一）抗体酶的概念与特点1. 抗体酶抗体酶/催化抗体（催化抗体（catalytic antibody）u利用酶反应中利用酶反应中底物过渡态类似物底物过渡态类似物作为半抗原作为半抗原刺激
23、免疫系统所产生的一类能够专一识别和刺激免疫系统所产生的一类能够专一识别和催化酶反应中的催化酶反应中的底物反应过渡态底物反应过渡态的一类的一类单克单克隆抗体隆抗体，本质上是一类，本质上是一类具有催化活性的免疫具有催化活性的免疫球蛋白球蛋白。2. 抗体酶的特点抗体酶的特点u 相同点：都是相同点：都是蛋白质蛋白质，都有，都有特异性特异性。u 不同点：不同点：1）抗体无）抗体无催化活力催化活力，酶有催化活力。，酶有催化活力。2）酶是能与反应）酶是能与反应过渡态过渡态选择结合的催化物质，选择结合的催化物质，抗体是和抗体是和基态基态紧密结合的物质。紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到）酶的活性和合成受到
24、代谢调节代谢调节，抗体只有在，抗体只有在抗原存在时才产生。抗原存在时才产生。抗体与酶的异同：抗体与酶的异同：u 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。低能障（反应的活化能）。u 以以过渡态类似物过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。察到抗体催化相应底物发生化学反应。u 直接免疫动物直接免疫动物/杂交瘤技术杂交瘤技术/基因工程技术基因工程技术3. 抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法（1） 诱导法诱导法动物免疫技术动物免
25、疫技术+杂交瘤技术杂交瘤技术利用利用底物过渡态类似物底物过渡态类似物制备抗体酶示意图制备抗体酶示意图u原理：掌握现有单克隆抗体的原理：掌握现有单克隆抗体的抗体结合部抗体结合部位的氨基酸顺序位的氨基酸顺序的基础上，对编码抗体酶的基础上，对编码抗体酶结合部位的结合部位的基因碱基序列基因碱基序列进行进行定点突变定点突变，在结合部位换上有在结合部位换上有催化作用催化作用的氨基酸残基，的氨基酸残基，进而改变抗体酶的催化效率。进而改变抗体酶的催化效率。u 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术/噬菌体展示技术噬菌体展示技术（2） 基因工程法基因工程法（1） 前药的设计和活化前药的设计和活化n 抗肿瘤药物：喜树碱
26、、阿霉素、依托泊苷抗肿瘤药物：喜树碱、阿霉素、依托泊苷4. 抗体酶的应用抗体酶的应用（2） 疾病治疗疾病治疗n 治疗可卡因上瘾治疗可卡因上瘾n 有机磷中毒有机磷中毒n 甲状腺疾病甲状腺疾病肿瘤治疗肿瘤治疗抗体介导前药治疗抗体介导前药治疗(ADEPT)：向体内注射能够与肿瘤组织特异性结合的向体内注射能够与肿瘤组织特异性结合的抗体酶，当其结合到靶部位后，再注入前抗体酶，当其结合到靶部位后，再注入前药，当药物扩散至肿瘤细胞表面或附近时，药，当药物扩散至肿瘤细胞表面或附近时，抗体酶可快速将其水解并释放出抗肿瘤药抗体酶可快速将其水解并释放出抗肿瘤药物，从而提高局部药物浓度，实现靶向治物，从而提高局部药物
27、浓度，实现靶向治疗。疗。催化抗体催化抗体38C2戒毒戒毒阻断可卡因、鸦片和受体的结合阻断可卡因、鸦片和受体的结合可卡因水解的过渡态类似物可卡因水解的过渡态类似物磷酸单酯磷酸单酯单克隆抗体酶单克隆抗体酶15A10：在可卡因到达作用位：在可卡因到达作用位点前将其降解，从而降低其毒性点前将其降解，从而降低其毒性（1） 应用应用u 有机合成中的应用有机合成中的应用u 基础理论研究基础理论研究u 在医疗上的应用在医疗上的应用5. 抗体酶的发展前景抗体酶的发展前景（2） 待解决问题待解决问题u 催化效率催化效率u 抗体酶筛选抗体酶筛选u 抗体酶专一性抗体酶专一性u 底物抑制底物抑制u 催化基团的最适装配催
28、化基团的最适装配四、有机相的酶反应四、有机相的酶反应（一）有机相酶反应的特点（一）有机相酶反应的特点q有利于疏水性底物的反应有利于疏水性底物的反应q可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应q可改变反应平衡移动方向可改变反应平衡移动方向q可改变底物专一性可改变底物专一性q可防止由水引起的副反应可防止由水引起的副反应q酶易于实现固定化酶易于实现固定化q酶和产物易于回收酶和产物易于回收q可避免微生物污染可避免微生物污染（二）有机相酶反应具备条件（二）有机相酶反应具备条件 保证必需水含量。保证必需水含量。选择合适的酶及酶形式。选择合适的酶及酶形式。选择合适的溶剂
29、及反应体系。选择合适的溶剂及反应体系。选择最佳选择最佳pH值。值。四、有机相的酶反应四、有机相的酶反应（三）有机相酶反应的溶剂体系（三）有机相酶反应的溶剂体系单相共溶剂体系（水单相共溶剂体系（水-水溶性溶剂均相体系）水溶性溶剂均相体系）两相体系（水两相体系（水-水不溶性溶剂两相体系）水不溶性溶剂两相体系）反相胶束体系反相胶束体系低水有机溶剂体系（单相有机溶剂体系）低水有机溶剂体系（单相有机溶剂体系）四、有机相的酶反应四、有机相的酶反应（四）有机相酶工程的应用（四）有机相酶工程的应用手性药物的拆分手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备手性高分子聚合物的制备多肽的合成多肽的合成甾体转化甾体转化五、突
30、变酶（五、突变酶（mutational enzyme）u在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的活性位点或基团，从而产生具有新改变酶的活性位点或基团，从而产生具有新性状的性状的突变酶突变酶。u理性分子设计理性分子设计u思路：利用思路：利用定点突变技术定点突变技术有目的地在已知有目的地在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸序列中取代、插入或删除特定的核苷酸方法方法1. 寡核苷酸介导的定点突变：寡核苷酸介导的定点突变：u用含有突变碱基的寡核苷酸片段做引物，用含有突变碱基的寡核苷酸片段做引物，在体外以原基因序列为模板进行复制，诱在体外以原基因序列为
31、模板进行复制，诱变合成少量完整的突变基因，再体内扩增变合成少量完整的突变基因，再体内扩增2. 盒式突变：盒式突变：u利用一段人工合成的含基因突变序列的寡利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。列。应用应用1. 提高酶活性及稳定性提高酶活性及稳定性阐明酶分子中某一基团的功能阐明酶分子中某一基团的功能2. 研究酶的功能基团研究酶的功能基团 酶同源序列的比较酶同源序列的比较选择突变靶标选择突变靶标 化学修饰化学修饰 酶的二、三级结构酶的二、三级结构六、酶分子的定向进化六、酶分子的定向进化以已知的亲本野生酶为起点，经过随机的以已知
32、的亲本野生酶为起点，经过随机的基因突变或重组，构建一个包括多种突变基因突变或重组，构建一个包括多种突变酶基因的酶基因的蛋白酶文库蛋白酶文库，在此基础上进一步，在此基础上进一步通过定向的选择性筛选，从中获得具有某通过定向的选择性筛选，从中获得具有某些定向功能或性状的酶分子些定向功能或性状的酶分子非理性分子设计非理性分子设计原理：人为模拟自然进化机制，利用分子原理：人为模拟自然进化机制，利用分子生物学手段结合灵敏的筛选技术，获得具生物学手段结合灵敏的筛选技术，获得具有某些预期特征的进化酶。有某些预期特征的进化酶。方法方法1. 随机突变随机突变易错易错PCR：通过改变：通过改变PCR的反应条件使碱的
33、反应条件使碱基一定程度上基一定程度上随机错配随机错配，导致目的基因随，导致目的基因随机突变，构建突变库，筛选突变体。机突变，构建突变库，筛选突变体。2. 同源改组同源改组有性有性PCR：亲本基因群中的优化突变：亲本基因群中的优化突变3. 非同源改组非同源改组渐进切割杂合酶技术：用核酸外切酶对两渐进切割杂合酶技术：用核酸外切酶对两个亲本基因分别进行消化，再将两组片段个亲本基因分别进行消化，再将两组片段化基因互相连接化基因互相连接方法方法4. 结构域改组结构域改组利用内含子之间的重组使独立的外显子组利用内含子之间的重组使独立的外显子组装成编码新蛋白质的基因装成编码新蛋白质的基因5. 其他技术其他技
34、术酶法体外随机酶法体外随机-定位诱变技术定位诱变技术酵母细胞重组增强组合文库技术酵母细胞重组增强组合文库技术筛选策略筛选策略底物显色反应底物显色反应改变培养条件改变培养条件利用蛋白固有性质利用蛋白固有性质高通量筛选高通量筛选 固相筛选固相筛选 放射性染料筛选放射性染料筛选 荧光筛选荧光筛选 ELISA 七、酶分子的化学修饰七、酶分子的化学修饰限制药用酶临床应用的因素：限制药用酶临床应用的因素：对生产条件的要求高对生产条件的要求高具有一定免疫原性具有一定免疫原性受体内蛋白酶水解影响受体内蛋白酶水解影响理化和生物稳定性差理化和生物稳定性差酶分子修饰的种类酶分子修饰的种类1. 金属离子置换修饰金属离
35、子置换修饰2. 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰3. 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰1. 酶的表面化学修饰酶的表面化学修饰（1）大分子结合修饰大分子结合修饰（2）侧链基团修饰侧链基团修饰2. 酶分子内部修饰酶分子内部修饰（1）肽链有限水解修饰）肽链有限水解修饰（2）核苷酸链剪切修饰）核苷酸链剪切修饰（3）氨基酸置换修饰）氨基酸置换修饰（4）核苷酸置换修饰）核苷酸置换修饰酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰大分子修饰酶的应用大分子修饰酶的应用u PEG-超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）u PEG-溶血类蛋白质（链激酶溶血类蛋白质（链激酶Strep
36、tokinase, SK;尿激酶尿激酶urokinase, UK等）等）u PEG-天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（Asparaginase, ASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期u 用用Dextran修饰修饰 -淀粉酶，淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。酶工程制药优点酶工程制药优点 工艺简单、效率高、生产成本低。工艺简单、效率高、生产成本低。 环境污染小、产品收率高、纯度好。环境污染小、产品收率高、纯度好。一、在生物转化中的应用一、在生物转化中的应用二、在药用酶生产中的应
37、用二、在药用酶生产中的应用6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸 （6-APA）：青霉素青霉素G水解水解除去侧链后的产物，也称无侧链青霉素。除去侧链后的产物，也称无侧链青霉素。生产半合成青霉素的最基本原料。生产半合成青霉素的最基本原料。 （一）在抗生素工业中的应用一）在抗生素工业中的应用例：固定化细胞法生产例：固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸青霉素酰化酶：青霉素酰化酶：用同一种固定化青霉素酰用同一种固定化青霉素酰化酶化酶，只要改变，只要改变pH等条件，等条件，既可催化生成既可催化生成6-APA，也可催化，也可催化6-APA与其他的羧酸衍生与其他的羧酸衍生物进反应物进反应合成具有不同侧链基团的
38、青霉素合成具有不同侧链基团的青霉素固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸u 技术路线技术路线固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸E.coli 斜面斜面 细胞细胞 固定化细胞固定化细胞 青霉素青霉素G 转化液转化液 滤液滤液 6-APA 粗品粗品培养培养固定固定转化转化过滤过滤抽提抽提填充床反应器填充床反应器pH 7.5-7.8 40明胶包埋法明胶包埋法氨基酸：氨基酸：用于医药、食品以及农业。用于医药、食品以及农业。合适比例的混合液可直接注入体内合适比例的混合液可直接注入体内补充营养补充营养
39、，氨基酸作为氨基酸作为增味剂增味剂，可增加香味促进食欲，可增加香味促进食欲，还可作为还可作为饲料饲料，还可用于，还可用于制造人造纤维、塑制造人造纤维、塑料等。料等。（二）在氨基酸工业中的应用二）在氨基酸工业中的应用例：固定化酶法生产例：固定化酶法生产L-氨基酸氨基酸氨基酸类的分类氨基酸类的分类1蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸：编码氨基酸：编码氨基酸非蛋白氨基酸：非蛋白氨基酸：D型氨基酸、型氨基酸、-氨基氨基酸、酸、-氨基酸等氨基酸等2衍生氨基酸：衍生氨基酸：谷氨酰胺、硫酸甘谷氨酰胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等氨酸、磷葡精氨酸等 34必需氨基酸：必需氨基酸：赖氨酸、色氨酸、苯丙赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、
40、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等亮氨酸、缬氨酸等8种种 非必需氨基酸及半必需氨基酸非必需氨基酸及半必需氨基酸 5（二）固定化酶法生产二）固定化酶法生产L-氨基酸氨基酸氨基酰化酶氨基酰化酶：世界上第一种工业化生产的固：世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种定化酶，可以用于生产各种L-氨基酸药物。氨基酸药物。1969年，日本田边制药公司将从年，日本田边制药公司将从米曲霉米曲霉中提中提取分离得到的氨基酰化酶，用取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖葡聚糖凝胶凝胶为载体通过为载体通过离子键结合法离子键结合法制成固定化酶，制成固定化酶，将将L-乙
41、酰氨基酸水解生成乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸。用来拆氨基酸。用来拆分分DL-乙酰氨基酸，连续生产乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸，生产氨基酸，生产成本仅为用游离酶生产成本的成本仅为用游离酶生产成本的60左右。左右。固定化酶法生产固定化酶法生产L-氨基酸氨基酸固定化酶法生产固定化酶法生产L-氨基酸氨基酸 R-CH-COOH R-CH-COOH DL- NH-CO-R + H2O L- NH2 R-CH-COOH D- NH-CO-R氨基酰化酶氨基酰化酶u 两种产物的溶解度不同，很容易分离。两种产物的溶解度不同，很容易分离。u 未水解的未水解的N-酰化酰化-D-氨基酸经过外消旋作用氨基酸经过外消旋作
42、用后又成为后又成为DL型，可再次进行拆分。型，可再次进行拆分。泵泵储储罐罐反应产物反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器晶体晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala酶法生产酶法生产L-Ala结结 构构分子量分子量 等电点等电点性性 质质溶解性溶解性L-AspL-Ala HOOCCHNH2COOHCH2CHNH2COOHH3C133.1089.092.776.0酸性氨酸性氨基酸基酸中性氨中性氨基酸基酸溶于水和溶于水和盐酸，不盐酸，不溶于乙醇溶于乙醇和乙醚和乙醚在水中有一在水中有一定溶解性，定溶解性，不溶于丙酮不溶于丙酮及乙醚及乙醚例：例：L-天冬氨酸和天冬氨酸和
43、L-丙氨酸的生产丙氨酸的生产（1） L-天冬氨酸和天冬氨酸和L-丙氨酸的性质丙氨酸的性质HOOCCHCOOHCHHOOCCHNH2COOHCH2CHNH2COOHH3C+CO2天冬氨酸酶天冬氨酸酶L-Asp脱羧酶脱羧酶（2）酶转化反应）酶转化反应（延胡索酸）（延胡索酸）+NH3（L-丙氨酸）丙氨酸）（L-天冬氨酸）天冬氨酸）（3）工艺路线）工艺路线固定化固定化L-Asp脱羧酶脱羧酶转化液转化液B延胡索酸延胡索酸+ NH3固定化天冬氨酸酶固定化天冬氨酸酶转化液转化液AL-Asp粗品粗品L-Asp精品精品L-Ala粗品粗品L-Ala精品精品泵泵储储罐罐反应产物反应产物离心机离心机母母液液回回收收固
44、定化酶固定化酶柱子柱子晶体晶体 L-AspL-Asp延胡索延胡索酸氨盐酸氨盐工艺路线示意图工艺路线示意图DEAE-葡聚糖葡聚糖氨基酰化酶氨基酰化酶 菌种的培养：菌种的培养：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）的培养）的培养含天冬氨酸酶含天冬氨酸酶假单胞菌（假单胞菌（Pseudomonas dacunhae) 变异株的变异株的培养培养含含L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶脱羧酶 细胞固定：细胞固定：u大肠杆菌（大肠杆菌（E.coil）的细胞：明胶包埋，加）的细胞：明胶包埋，加戊二醛交联戊二醛交联u假单胞菌体固定：角叉菜胶包埋，加戊二醛假单胞菌体固定：角叉菜胶包埋，加戊二醛交联交联（4）工艺控制要点）工艺
45、控制要点 生物反应堆的制备（分生物反应堆的制备（分和和） 转化反应（温度、转化反应（温度、pH值、催化剂）值、催化剂）u 两个反应堆的温度：两个反应堆的温度：37 u 两个反应堆的两个反应堆的pH值：反应堆值：反应堆：8.5；反应；反应堆堆：6.0 产品纯化与精制产品纯化与精制 （4）工艺控制要点）工艺控制要点（三）在核苷酸工业中的应用三）在核苷酸工业中的应用例：例：固定化酶法生产固定化酶法生产5-复合单核苷酸复合单核苷酸5-复合单核苷酸：复合单核苷酸：用于治疗白血球下降、用于治疗白血球下降、血小板减少以及肝功能失调等疾病。血小板减少以及肝功能失调等疾病。核糖核酸经核糖核酸经磷酸二脂酶磷酸二脂
46、酶作用，可分解为腺作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等磷酸化合物，该苷、胞苷、尿苷、鸟苷等磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根麦芽根为材料制备磷酸酶。为材料制备磷酸酶。工艺路线工艺路线磷酸二脂酶的制备磷酸二脂酶的制备固定化磷酸二脂酶的制备固定化磷酸二脂酶的制备转化反应转化反应5-复合单核苷酸的分离纯化复合单核苷酸的分离纯化精制及灌封精制及灌封麦芽根麦芽根ABXE-纤维素纤维素 PBR离子交换树脂离子交换树脂浓缩、除菌浓缩、除菌二、在药用酶生产中的应用二、在药用酶生产
47、中的应用（一）酶与心脑血管疾病治疗（一）酶与心脑血管疾病治疗u溶栓酶：尿激酶、链激酶、蚓激酶溶栓酶：尿激酶、链激酶、蚓激酶u作用机理：促进人体血液内纤维蛋白酶的作用机理：促进人体血液内纤维蛋白酶的形成形成ut-PA和前尿激酶：治疗急性脑卒中和前尿激酶：治疗急性脑卒中u口服纤溶酶类：纳豆激酶、天醅激酶口服纤溶酶类：纳豆激酶、天醅激酶二、在药用酶生产中的应用二、在药用酶生产中的应用（二）酶与癌症治疗（二）酶与癌症治疗癌症的发生与后天环境因素和生物因素有癌症的发生与后天环境因素和生物因素有关关治疗：大肠癌、肝癌、白血病等治疗：大肠癌、肝癌、白血病等例：天冬酰胺酶治疗白血病例：天冬酰胺酶治疗白血病天冬
48、酰胺具有促进白血病中癌细胞增长作天冬酰胺具有促进白血病中癌细胞增长作用，天冬氨酰酶可破坏天冬酰胺的作用，用，天冬氨酰酶可破坏天冬酰胺的作用，但细胞内无法合成。但细胞内无法合成。二、在药用酶生产中的应用二、在药用酶生产中的应用（三）其他（三）其他帕金森症帕金森症戈谢病戈谢病溶菌酶与抗生素联用溶菌酶与抗生素联用复习思考题复习思考题1. 突变酶、抗体酶的定义及制备方法。突变酶、抗体酶的定义及制备方法。2. 酶分子的定点改造的定义及制备方法。酶分子的定点改造的定义及制备方法。3. 酶分子定向进化的定义及制备方法。酶分子定向进化的定义及制备方法。4. 回顾酶工程相关内容，了解酶工程在药物回顾酶工程相关内容，了解酶工程在药物生产中的应用。生产中的应用。
