1、第十三章 水卫生生物学13.1 水中的病原微生物 水中的微生物包括致病性微生物和非致病性微生物。水中的微生物包括致病性微生物和非致病性微生物。n水中的病原微生物一般是从外界环境污染而来的，水中的病原微生物一般是从外界环境污染而来的，特别是人和其他温血动物的粪便污染。特别是人和其他温血动物的粪便污染。细菌细菌 病毒病毒原生动物原生动物n致病性微生物致病性微生物与水有关的疾病与水有关的疾病n饮水传播性疾病饮水传播性疾病：通过摄入被污染的水而被传染：通过摄入被污染的水而被传染和传播的疾病。和传播的疾病。流行性霍乱、伤寒流行性霍乱、伤寒n洗水性疾病洗水性疾病：与恶劣卫生条件和不适当的环境卫：与恶劣卫生
2、条件和不适当的环境卫生相关的疾病。生相关的疾病。结膜炎、砂眼、腹泻结膜炎、砂眼、腹泻与水有关的疾病与水有关的疾病n水依赖性疾病水依赖性疾病：由生活在水中或依赖水生存的病原：由生活在水中或依赖水生存的病原体引起的疾病。体引起的疾病。血吸虫病、军团病血吸虫病、军团病n水相关性疾病水相关性疾病：通过在水中繁殖或靠近水边生活的：通过在水中繁殖或靠近水边生活的某些昆虫传播的疾病。某些昆虫传播的疾病。黄热病黄热病、登革热、丝虫病、疟疾、昏睡病、登革热、丝虫病、疟疾、昏睡病n致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌腹泻腹泻血性腹泻血性腹泻n伤寒杆菌（沙门氏菌）伤寒杆菌（沙门氏菌）发烧发烧脾脏肿大脾脏肿大红斑红斑腹泻腹泻
3、n痢疾杆菌（志贺氏菌）痢疾杆菌（志贺氏菌）发病急发病急腹痛腹痛腹泻腹泻呈现全身中毒呈现全身中毒症状症状感染剂量小感染剂量小n霍乱弧菌霍乱弧菌呕吐呕吐腹泻腹泻失水失水死亡率甚高死亡率甚高 n军团菌军团菌咳嗽咳嗽胸痛胸痛血痰血痰呼吸困难呼吸困难休克休克n粪链球菌（粪肠球菌）粪链球菌（粪肠球菌）尿路感染尿路感染化脓性腹部感染化脓性腹部感染败血症败血症心内膜炎心内膜炎腹泻发烧腹泻发烧 n肠道病毒肠道病毒 （脊髓灰质炎病毒）（脊髓灰质炎病毒） （柯萨奇病毒）（柯萨奇病毒） （埃可病毒）（埃可病毒）n肝炎病毒肝炎病毒n轮状病毒轮状病毒nSARS冠状病毒冠状病毒nMERS冠状病毒冠状病毒n隐孢子虫与贾第鞭毛
4、虫（两虫）隐孢子虫与贾第鞭毛虫（两虫） “ “两虫两虫”属水媒性寄生原生动物中最容易属水媒性寄生原生动物中最容易通过饮用通过饮用水传播水传播给人、动物和禽畜的。给人、动物和禽畜的。“两虫两虫”其孢囊和卵囊在人和动物其孢囊和卵囊在人和动物粪便中数量大粪便中数量大，在，在外界环境中外界环境中抵抗力强抵抗力强，感染途径和方式简单，感染途径和方式简单，流行流行分布广泛分布广泛。n症状：严重腹泻、恶心、呕吐或低度发烧症状：严重腹泻、恶心、呕吐或低度发烧n特点特点：发病率高（：发病率高（40%40%），治疗效果差。），治疗效果差。1993年年4月美国密尔沃基地区爆发涉及月美国密尔沃基地区爆发涉及40万人万
5、人的隐孢子虫病；的隐孢子虫病；1996年年6月日本琦玉县发生隐虫污染自来水，月日本琦玉县发生隐虫污染自来水，8800人受感染人受感染；1998年年7月澳大利亚悉尼发生月澳大利亚悉尼发生“两虫两虫”污染供污染供水事故，劝告市民饮用煮沸的自来水。水事故，劝告市民饮用煮沸的自来水。n蛔虫、血吸虫等蛔虫、血吸虫等粪便施肥：曝晒、堆肥粪便施肥：曝晒、堆肥城市污水：不能直接用于灌溉城市污水：不能直接用于灌溉饮用水：必须过滤、消毒饮用水：必须过滤、消毒 13.2 水质生物学指标n水的生物学指标水的生物学指标主要是用来评价水中的病原微生物，主要是用来评价水中的病原微生物，预防流行性传染病的大范围爆发。预防流行
6、性传染病的大范围爆发。n在当前技术水平下，如果要对水中每一种可能的病在当前技术水平下，如果要对水中每一种可能的病原微生物都进行监测不切实际。原微生物都进行监测不切实际。n评价水中的病原微生物的评价水中的病原微生物的合理办法合理办法是：检测人和其是：检测人和其他温血动物的粪便中通常存在的他温血动物的粪便中通常存在的非致病微生物非致病微生物，作，作为指示微生物。为指示微生物。一般来说，一般来说，指示微生物指示微生物除了本身不能是致病微生物外，除了本身不能是致病微生物外，还应具备以下特征：还应具备以下特征：n这类微生物仅存在于粪便等污染源中，且数量较多；这类微生物仅存在于粪便等污染源中，且数量较多；
7、n与病原微生物的生理特性相似；与病原微生物的生理特性相似；n在洁净水体中不存在、与病原微生物相当在外界的在洁净水体中不存在、与病原微生物相当在外界的存活能力相似；存活能力相似；n在宿主外不繁殖；在宿主外不繁殖；n容易检测。容易检测。n水样在营养琼脂上有氧条件下水样在营养琼脂上有氧条件下培养培养后，所后，所得得1ml1ml水样所含菌落的总数。水样所含菌落的总数。n注意：上述定义与课本上定义不同。课本上指标名注意：上述定义与课本上定义不同。课本上指标名为为“细菌总数细菌总数”，培养时间为，培养时间为24h24h。n该检测作为指示致病菌存在的指标意义不大，该检测作为指示致病菌存在的指标意义不大，不能
8、不能说明污染来源说明污染来源，必须结合其他指标如总大肠菌群、，必须结合其他指标如总大肠菌群、耐热大肠菌群来判断水质污染的来源。耐热大肠菌群来判断水质污染的来源。n该指标可以作为判断被检水样该指标可以作为判断被检水样污染程度污染程度的标志。的标志。n评价水质评价水质清洁程度清洁程度和考核和考核水处理或消毒效果水处理或消毒效果的指标。的指标。菌落总数增多说明水被有机物污染程度大。菌落总数增多说明水被有机物污染程度大。n还可用于评价还可用于评价输配水系统清洁度输配水系统清洁度、完整性完整性以及以及是否是否存在生物膜存在生物膜。在输配水系统中，菌落总数的增加意。在输配水系统中，菌落总数的增加意味着水清
9、洁度恶化、水流可能停滞和有生物膜形成。味着水清洁度恶化、水流可能停滞和有生物膜形成。n总大肠菌群总大肠菌群又称大肠菌群，是指一群在又称大肠菌群，是指一群在培养培养能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。兰氏阴性无芽孢杆菌。n肠道正常细菌有肠道正常细菌有3 3类：类：大肠菌群、肠球菌、产气荚膜杆菌大肠菌群、肠球菌、产气荚膜杆菌n大肠菌群的生理习性与伤寒杆菌、副伤寒杆菌和痢大肠菌群的生理习性与伤寒杆菌、副伤寒杆菌和痢疾杆菌等病原菌的生理特性较为相似，在外界生存疾杆菌等病原菌的生理特性较为相似，在外界生存条件也与上述病原菌基本一致；条件也与
10、上述病原菌基本一致；n另外大肠菌群在人的粪便中数量很大，检验技术并另外大肠菌群在人的粪便中数量很大，检验技术并不复杂。不复杂。n而而肠球菌肠球菌抵抗力弱，生存时间比病原菌短，水中若抵抗力弱，生存时间比病原菌短，水中若未检出肠球菌，并不能说明未受粪便污染。未检出肠球菌，并不能说明未受粪便污染。n产气荚膜杆菌产气荚膜杆菌因为有芽孢，能在自然环境中长期生因为有芽孢，能在自然环境中长期生存，它的存在不能说明水是近期受粪便污染的。存，它的存在不能说明水是近期受粪便污染的。n一群在一群在37培养培养24 h能发酵乳糖、产酸产气、需氧能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。和兼性厌氧的革
11、兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括主要包括大肠埃希氏杆菌大肠埃希氏杆菌、柠檬酸杆菌和副大肠杆、柠檬酸杆菌和副大肠杆菌等。菌等。n分解葡萄糖、甘露醇及乳糖的能力有差别分解葡萄糖、甘露醇及乳糖的能力有差别n在在远藤氏远藤氏培养基上所形成的菌落不同培养基上所形成的菌落不同n在在EMB培养基上所形成的菌落不同培养基上所形成的菌落不同指指 标标 限限 值值总大肠菌群（总大肠菌群（MPN/100mL或或CFU/100mL）不得检出不得检出耐热大肠菌群（耐热大肠菌群（MPN/100mL或或CFU/100mL）不得检出不得检出大肠埃希氏菌（大肠埃希氏菌（MPN/100mL或或CFU/100mL）不得检出不得检出菌落
12、总数（菌落总数（CFU/mL）100在常规项目中，在常规项目中，20062006标准标准增加了大肠埃希氏菌、耐热大肠增加了大肠埃希氏菌、耐热大肠菌群菌群；修订了总大肠菌群修订了总大肠菌群世界卫生组织世界卫生组织2005年年饮用水水质准则饮用水水质准则第第三版（第一次增补本）中则指出：三版（第一次增补本）中则指出：n总大肠菌群包括能够在水中存活和生长的微生物，总大肠菌群包括能够在水中存活和生长的微生物，因此，它们不能作为粪便致病菌的指标。因此，它们不能作为粪便致病菌的指标。n大肠菌群总数不适宜作为供水卫生质量的指标，特大肠菌群总数不适宜作为供水卫生质量的指标，特别是在热带地区，几乎所有未经处理的
13、供水中均存别是在热带地区，几乎所有未经处理的供水中均存在大量无卫生学意义的细菌。在大量无卫生学意义的细菌。n耐热大肠菌群耐热大肠菌群：耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部：耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部分，用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌分，用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。n它们由它们由埃希氏菌属埃希氏菌属以及以及克雷伯菌属克雷伯菌属、肠杆菌属肠杆菌属和和柠柠檬酸杆菌属檬酸杆菌属中的一些菌种组成。中的一些菌种组成。n耐热大肠杆菌中的主要优势菌
14、耐热大肠杆菌中的主要优势菌为为大肠大肠埃埃希希氏菌氏菌。n大肠埃希菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世大肠埃希菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世界上许多组织、国家和地区使用。界上许多组织、国家和地区使用。n若水样检出大肠埃希菌说明水质可能受到严重污染。若水样检出大肠埃希菌说明水质可能受到严重污染。n耐热大肠菌群比总大肠菌群能耐热大肠菌群比总大肠菌群能更确切地反映饮用更确切地反映饮用水受人和动物粪便的近期污染及污染的程度水受人和动物粪便的近期污染及污染的程度，也，也较为实用和可行。较为实用和可行。n当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐
15、热大肠菌群；氏菌或耐热大肠菌群；n水样未检出总大肠菌群，不必检验大肠埃希氏菌或水样未检出总大肠菌群，不必检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。耐热大肠菌群。n目前仅有美国、加拿大等极少数国家在饮用水标准目前仅有美国、加拿大等极少数国家在饮用水标准中明确规定了对病毒的处理要求。中明确规定了对病毒的处理要求。n我国最新的我国最新的生活饮用水卫生标准生活饮用水卫生标准(GB5749 - 2006)并未将其列入。并未将其列入。nWHO的的饮用水水质准则饮用水水质准则2008年的增补本中关于年的增补本中关于病毒类列举了腺病毒、肠道病毒等病毒类列举了腺病毒、肠道病毒等8种，然而许多种，然而许多指标并指标并未做出
16、明确的限值规定。未做出明确的限值规定。nWHO针对病毒提出针对病毒提出绩效目标绩效目标的概念，即测定微生物的概念，即测定微生物数量减少程度以确保水的安全性。数量减少程度以确保水的安全性。SC噬菌体可以反映水受粪便污染的程度噬菌体可以反映水受粪便污染的程度 F-噬菌体在性质和对消毒的抗性上最接近肠道病毒，噬菌体在性质和对消毒的抗性上最接近肠道病毒，适宜作为肠道病毒的指示物。适宜作为肠道病毒的指示物。脆弱拟杆菌脆弱拟杆菌噬菌体噬菌体仅在人类粪便中被分离仅在人类粪便中被分离出来，在出来，在其他动物粪便中未被分离其他动物粪便中未被分离出来，出来，因此因此可专门作为人可专门作为人类粪便污染的指标。类粪便
17、污染的指标。 n目前采用的目前采用的US-EPA 1623方法是标准化的方法，可方法是标准化的方法，可同时检测同时检测“两虫两虫”。n该方法的主要步骤为过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、该方法的主要步骤为过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、荧光显色和镜检。荧光显色和镜检。n美国美国EPA研究表明，研究表明，降低出厂水浑浊度至降低出厂水浑浊度至0.5NTU 可大大降低原虫的传播危险可大大降低原虫的传播危险，浊度低于，浊度低于0.3NTU，原，原虫去除率达虫去除率达99%，浊度，浊度0.1NTU，去除率达，去除率达99.9%。指指 标标限限 值值贾第鞭毛虫（个贾第鞭毛虫（个/10L）1隐孢子虫（个隐孢子虫（个/
18、10L）1“水质非常规指标及限值水质非常规指标及限值”所规定指标的实施项目和日期由省所规定指标的实施项目和日期由省级人民政府根据当地实际情况确定，并报卫生部、建设部和级人民政府根据当地实际情况确定，并报卫生部、建设部和国家标准委备案，自国家标准委备案，自2008年起三个部门对各省非常规指标实年起三个部门对各省非常规指标实施情况进行通报，全部指标最迟于施情况进行通报，全部指标最迟于2012年年7月月1日实施。日实施。 13.3 水的卫生学检验方法 n水样在营养琼脂上有氧条件下水样在营养琼脂上有氧条件下3737培养培养48h48h后，所后，所得得1ml1ml水样所含菌落的总数。水样所含菌落的总数。
19、n测定生活饮用水的方法测定生活饮用水的方法无菌操作将无菌操作将1ml水样注入灭菌平皿，以水样注入灭菌平皿，以45营养琼脂营养琼脂培养基倒平板，并立即旋摇混均。培养基倒平板，并立即旋摇混均。37倒置培养倒置培养48h后，计菌落总数后，计菌落总数（一）发酵法（一）发酵法（1）初发酵试验）初发酵试验n本试验是将水样置于糖类液体培养基中，在一定温本试验是将水样置于糖类液体培养基中，在一定温度下，经一定时间培养后，观察有无酸和气体产生，度下，经一定时间培养后，观察有无酸和气体产生，即有无发酵，而初步确定有无大肠菌群存在。即有无发酵，而初步确定有无大肠菌群存在。n 取取10 mL水样接种到水样接种到10
20、mL双料乳糖蛋白胨培养液中，双料乳糖蛋白胨培养液中，取取1 mL水样接种到水样接种到10 mL单料乳糖蛋白胨培养液中，单料乳糖蛋白胨培养液中，另取另取l mL水样注入到水样注入到9 mL灭菌生理盐水中，混匀后灭菌生理盐水中，混匀后吸取吸取l mL（即（即0.1 mL水样）注入到水样）注入到10 mL单料乳糖蛋单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种白胨培养液中，每一稀释度接种5管。管。 产酸产气情况：产酸产气情况：如无气体和酸产生，则为阴性反应，即可报告如无气体和酸产生，则为阴性反应，即可报告为总大肠菌群阴性。为总大肠菌群阴性。如有气体和酸产生，或虽无气体但有酸产生，如有气体和酸产生，或虽无气体
21、但有酸产生，则初定为阳性反应，需作进一步检验。则初定为阳性反应，需作进一步检验。n对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种验一次的，可直接种5份份10 mL水样双料培养基，水样双料培养基，每份接种每份接种10 mL水样。水样。n将接种管置将接种管置361培养箱内，培养培养箱内，培养24 h2 h如有气体产生，但没有酸，溶液也不浑浊，则操如有气体产生，但没有酸，溶液也不浑浊，则操作技术上有问题，须重作检验。作技术上有问题，须重作检验。（2）平板分离）平板分离n这一阶段的检验主要是根据大肠菌群在固体培养基上这一阶段的检验主要是根据大肠菌
22、群在固体培养基上可以在空气中生长，在鉴别培养基上有典型菌落，革可以在空气中生长，在鉴别培养基上有典型菌落，革兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性来进行的。兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性来进行的。n将产酸产气的发酵管分别转移在伊红美蓝琼脂平板将产酸产气的发酵管分别转移在伊红美蓝琼脂平板上，于上，于371培养箱内培养培养箱内培养18h24h，观察菌落，观察菌落形态，挑取形态，挑取符合下列符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。检和证实试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫
23、红色、中心较深的菌落。淡紫红色、中心较深的菌落。 （3）复发酵试验）复发酵试验n本试验是将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，观察本试验是将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，观察其是否发酵，是否产酸产气而最后肯定有无大肠菌群其是否发酵，是否产酸产气而最后肯定有无大肠菌群存在。存在。n经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽饱杆菌，同时接种经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽饱杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液置乳糖蛋白胨培养液置361培养箱中培养培养箱中培养24h2h有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。革兰氏染色、镜检结果革兰氏染色、镜检结果革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌革
24、兰氏阳性菌u 阳性的最终确定阳性的最终确定初发酵初发酵EMB平板检验平板检验产酸产气或产酸不产气产酸产气或产酸不产气典型菌落革兰氏染色：典型菌落革兰氏染色：G、无芽孢、杆菌者、无芽孢、杆菌者阳性阳性深紫黑色，具有金属光泽的菌落；深紫黑色，具有金属光泽的菌落； 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。淡紫红色，中心色较深的菌落。复发酵复发酵：产酸产气产酸产气p根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（most- probable number，最可能数）检索表，报告每，最可能数）检索表，报告每100mL水样
25、中的总大肠菌群最可能数（水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。）值。p15管发酵法结果见管发酵法结果见P370。p5管发酵法结果见下表。管发酵法结果见下表。5个个10mL管中管中阳性管数阳性管数MPN5个个10mL管中管中阳性管数阳性管数MPN016（二）滤膜法（二）滤膜法n用孔径为用孔径为0.45m的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在选择性培养基上选择性培养基上37培养培养24h，能形成特征性菌落，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。水中总大肠菌群的方法。n有可能在有可能在30
26、h内完成内完成n受水中悬浮物的影响受水中悬浮物的影响n目前在一些大型水厂有应用目前在一些大型水厂有应用病毒：专性活细胞内寄生病毒：专性活细胞内寄生必须是相应的活敏感细胞必须是相应的活敏感细胞水质检测中使用猴子的肾脏水质检测中使用猴子的肾脏每升水中无每升水中无1 1个病毒蚀斑个病毒蚀斑（PFU）饮用才安全。饮用才安全。蚀斑蚀斑数试样中病毒数数试样中病毒数动物病毒动物病毒的检测方法的检测方法噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。噬菌斑数试样中噬菌体数噬菌斑数试样中噬菌体数双层平板法双层平板法n主要是指对隐孢子虫卵囊与贾第鞭毛虫孢囊主要是指对隐孢子虫卵囊与贾第鞭毛虫孢囊n目前国标中规定的是：目前国标中规定的是：US-EPA1623方法方法n两虫的检测对设备要求较高，检测费用也比较高两虫的检测对设备要求较高，检测费用也比较高
