1、第4章 发酵工业无菌技术本章内容本章内容一、概念一、概念 二、发酵工业污染的防治策略二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备灭菌四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌五、空气除菌一、概念：一、概念：灭菌、消毒、除菌、灭菌、消毒、除菌、防腐防腐v灭菌灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。有有生命物质的过程。 消毒消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。器和器具表面的微生物。 除菌除菌
2、(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。及其孢子。 防腐防腐( (antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖长和繁殖 。v消毒与灭菌的区别消毒与灭菌的区别v消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒与灭菌在发酵工业中的应用二、发酵工业污染的防治策略二、发酵工业污染的防治策略（一）污染的危害（一）污染的危害（二）污染的防治（二）污染的防治 1.1.染菌的不良后果染菌的不良后果 v消耗营养消耗营养v合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难困难
3、v改变改变pHv分解产物分解产物v噬菌体破坏极大噬菌体破坏极大2.染菌危害的具体分析染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响染菌对不同菌种发酵的影响A细菌细菌v谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。较少染杂菌，但噬菌体威胁大。v肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。长和合成代谢产物。B. 霉菌霉菌vPenG：青霉素水解酶上升，：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，迅速破坏，发酵一无所获。发酵一无所获。v
4、柠檬酸：柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染，不易染菌，主要防止前期染菌。菌。C. 酵母菌酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。都应全部废弃。（1）染菌对不同菌种发酵的影响染菌对不同菌种发酵的影响（2）染菌种类对发酵的影响染菌种类对发酵的影响v青霉素：青霉素：怕染细短产气杆菌怕染细短产气杆菌v链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌v四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌v柠檬酸：怕染
5、青霉菌柠檬酸：怕染青霉菌v肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌v谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响v种子扩大时期染菌种子扩大时期染菌: :v发酵前期染菌发酵前期染菌：v发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵抗生素发酵 柠檬酸发酵柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制抑制细菌细菌 b
6、. 污染酵母：加入污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；抑制酵母；通风加大，加速产酸。通风加大，加速产酸。 灭菌后弃去灭菌后弃去应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响柠檬酸发酵柠檬酸发酵c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下下降，黄曲霉自溶。降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。很低下能够生长。提前放罐。v发酵发酵后期污染后期污染染菌量不太多，可继续发酵染菌量不太多，可继续
7、发酵污染严重，则提前放罐污染严重，则提前放罐杀菌剂的添加：杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价发现后加入，效果要具体评价（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响v丝状菌发酵被产酸菌污染：丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。v杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采杂菌分泌较多蛋白
8、质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。极易发生乳化。1. 染菌的检查与判断染菌的检查与判断v显微镜检查法显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需要一定时间v平板划线培养或斜面培养检查法：菌落平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑v肉汤培养检查法肉汤培养检查法 v发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化水平异常变化pH异常变化异常变化尾气尾气CO2异常变化异常变化 12污染原因分析污染原因分析 v主要原因
9、：主要原因： 种子带菌种子带菌 无菌空气带菌无菌空气带菌 设备渗漏设备渗漏 灭菌不彻底灭菌不彻底 操作失误操作失误 技术管理不善技术管理不善 预防预防v种子带菌的防治种子带菌的防治 灭菌彻底灭菌彻底接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠靠保藏可靠保藏可靠v过滤空气带菌的防治过滤空气带菌的防治v设备的渗漏或设备的渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治 “死角死角” v发酵罐的发酵罐的“死角死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支
10、撑拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口料管口 发酵罐罐底发酵罐罐底脓疱状积垢脓疱状积垢造成造成“死角死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀放汽边阀v管道安装不当或配置不合理管道安装不当或配置不合理形成的形成的“死角死角” 污水脓疱罐底 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角” 法兰连接不当造成的法兰连接不当造成的“死角死角” 灭菌时蒸汽不易通达的灭菌时蒸汽不易通达的“死角死角”及其消除方及其消除方法法v
11、培养基与设备灭菌不彻底的防治培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去。原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶防止泡沫升顶连消不彻底连消不彻底 ：最好采用自动控制装置：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变灭菌后期罐压骤变 死角死角 v操作不当造成染菌操作不当造成染菌 v噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治 预防预防采取哪些措施能够保持无菌发酵？采取哪些措施能够保持无菌发酵？v物料、培养基、中间补料要灭菌；物料、培养基、中间补
12、料要灭菌；v发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；v好气发酵通入的空气要除菌；好气发酵通入的空气要除菌；v种子无污染；接种无菌操作过关种子无污染；接种无菌操作过关；v为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。有关细菌耐热性的特性有关细菌耐热性的特性（1）热力致死速率曲线或活菌）热力致死速率曲线或活菌残存数曲线残存数曲线微生物及其芽孢的热处理死微生物及其芽孢的热处理死亡数是按指数递减或按对数亡数是按指数递减或按对数循环下降的。循环下降的。若以纵坐标为
13、物料单位值内若以纵坐标为物料单位值内细胞数或芽孢数的对数值，细胞数或芽孢数的对数值，以横坐标为热处理时间，可以横坐标为热处理时间，可得到一直线得到一直线热力致死速热力致死速率曲线或活菌残存数曲线。率曲线或活菌残存数曲线。10100100010000012345加热时间（分）每毫升芽孢数图图1 热力致死速率曲线热力致死速率曲线DDDDDD（2）D值值v图图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟）表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟）就是就是D值（值（Decimal reduction time）。也就是直线斜率）。也就是直线斜率的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。的倒数
14、。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。vD值的定义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致值的定义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致死温度条件下某细菌数群中每杀死死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数原有残存活菌数时所需要的时间。时所需要的时间。vD值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性越强。越强。v因此因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。值大小和细菌耐热性的强度成正比。v注意：注意：D值不受原始菌数影响值不受原始菌数影响vD值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境和其它因素而异。和其它因素
15、而异。 部分食品中常见腐败菌的 D 值 腐败菌腐败特征耐热性嗜热脂肪芽孢杆菌平盖酸败D121=4.0-5.0 min嗜热解糖梭状芽孢杆菌产酸产气D121=3.0-4.0 min嗜热菌致黑梭状芽孢杆菌致黑硫臭D121=2.0-3.0 min肉毒杆菌 A、B产酸产气产毒D121=6-12 sec生芽孢梭状芽孢杆菌(P.A3697)产酸产气D121=6-40 sec低酸性食品嗜温菌凝结芽孢杆菌平盖酸败D121=1-4 sec巴氏固氮梭状芽孢杆菌产酸产气D100=6-30 sec酪酸梭状芽孢杆菌产酸产气D100=6-30 sec酸性食品嗜温菌多粘芽孢杆菌产酸产气D100=6-30 sec表表1 瞬间加
16、热和冷却条件下单位时间为瞬间加热和冷却条件下单位时间为D时的细菌死亡速率时的细菌死亡速率单位时间为单位时间为D时的加热时间（分钟）时的加热时间（分钟）单位容积残存活菌数单位容积残存活菌数0D1041D1032D1023D1014D1005D10-16D10-27D10-38D10-4v从表从表1可以看出，从可以看出，从5D以后，为负指数，也就是说有以后，为负指数，也就是说有1/101/10000活菌残存下来的可能。活菌残存下来的可能。v细菌和芽孢按分数出现并不显示，这只是表明理论上细菌和芽孢按分数出现并不显示，这只是表明理论上很难将活菌完全消灭掉。很难将活菌完全消灭掉。v实际上，这应该从概率的
17、角度来考虑，如果实际上，这应该从概率的角度来考虑，如果100支试管支试管中各有中各有1ml悬浮液，每悬浮液，每ml悬浮液中仅含有悬浮液中仅含有1个芽孢，经个芽孢，经过过5D处理后，残存菌数为处理后，残存菌数为10-1，即，即1/10活活10/100，也就，也就是是100支试管中可能有支试管中可能有90支不再有活菌存在，而支不再有活菌存在，而10支尚支尚有活菌的可能。有活菌的可能。vD值可以根据图值可以根据图1中直线横过一个对数循环所需的热中直线横过一个对数循环所需的热处理时间求得。当然也可以根据直线方程式求得，处理时间求得。当然也可以根据直线方程式求得，因为它为直线斜率的倒数，即：因为它为直线
18、斜率的倒数，即： batDloglogv例例1： 100热处理时，原始菌数为热处理时，原始菌数为1104，热处理，热处理3分钟后分钟后残存的活菌数是残存的活菌数是1101，求该菌，求该菌D值。值。 即即D 100 或或D110=1.0000. 1100 . 1lg100 . 1lg34D110100100095100 105 110 115 120 125杀菌温度( )杀菌加热时间( 分钟)Z（3）热力致死时间曲线（）热力致死时间曲线（TDT曲线）曲线）vThermal Death Time：热：热力温度保持恒定不变，力温度保持恒定不变，将处于一定条件下的悬将处于一定条件下的悬浮液中某一菌种的
19、细胞浮液中某一菌种的细胞或芽孢全部杀死所必需或芽孢全部杀死所必需的最短热处理时间。的最短热处理时间。图图2热力致死时间曲线热力致死时间曲线v细菌的热力致死时间随致死温度而异。它表示细菌的热力致死时间随致死温度而异。它表示了不同热力致死温度时细菌芽孢的相对耐热性。了不同热力致死温度时细菌芽孢的相对耐热性。v与热力致死速率曲线一样，若以热处理温度为与热力致死速率曲线一样，若以热处理温度为横坐标，以热处理时间为纵坐标（对数值），横坐标，以热处理时间为纵坐标（对数值），就得到一条直线，即热力。就得到一条直线，即热力。v表明热力致死规律同样按指数递降进行。表明热力致死规律同样按指数递降进行。vZ值的概念
20、：值的概念：直线横过一个对数循环所需要改变直线横过一个对数循环所需要改变的温度数（的温度数（）。v换句话说：换句话说：Z值为热力致死时间按照值为热力致死时间按照1/10，或，或10倍倍变化时相应的加热温度变化（变化时相应的加热温度变化（ ）。）。vZ值越大，因温度上升而取得的杀菌效果就越小。值越大，因温度上升而取得的杀菌效果就越小。v通常用通常用121（国外用（国外用250F或或121.1）作为标准）作为标准温度，该温度下的热力致死时间用符号温度，该温度下的热力致死时间用符号F来表示，并来表示，并称为称为F值值。vF值的定义就是在值的定义就是在121.1温度条件下杀死温度条件下杀死一定浓度一定
21、浓度的细菌所需要的时间的细菌所需要的时间F值与原始菌数是相关的。值与原始菌数是相关的。 若若T2=121.1，则，则t2=F ZTTtt1221lg（4）热力指数递减时间（）热力指数递减时间（TRT）v为了计算杀菌时间时将细菌指数递减因素考虑在内，为了计算杀菌时间时将细菌指数递减因素考虑在内，将将D值概念进一步扩大，提出了热力指数递减时间值概念进一步扩大，提出了热力指数递减时间（TRT）概念。）概念。vTRT定义就是在任何特定热力致死温度条件下将细定义就是在任何特定热力致死温度条件下将细菌或芽孢数减少到某一程度如菌或芽孢数减少到某一程度如 10-n（即原来活菌数的（即原来活菌数的1/10n）时
22、所需要的热处理时间（分钟）。）时所需要的热处理时间（分钟）。vTRTn=nD 即曲线横过即曲线横过n个对数循环时所需要的热处个对数循环时所需要的热处理时间。理时间。vTRTn值与值与D值一样不受原始菌数的影响。值一样不受原始菌数的影响。vTRT值的应用为运用概率说明细菌死亡情况建立了值的应用为运用概率说明细菌死亡情况建立了基础。基础。v如如121温度杀菌时温度杀菌时TRT12=12D，即经，即经12D分钟杀菌分钟杀菌后罐内致死率为后罐内致死率为D值的主要杀菌对象值的主要杀菌对象芽孢数将芽孢数将降低到降低到10-12。（5）仿热力致死时间曲线）仿热力致死时间曲线v纵坐标为纵坐标为D对数对数值，横
23、坐标为加值，横坐标为加热温度，加热温热温度，加热温度与其对应的度与其对应的D对数值呈直线关对数值呈直线关系。系。110100100095 100 105 110 115 120 125加热温度( )D值( 分 钟)Z图图 3仿热力致死时间曲线仿热力致死时间曲线v 若若T2=121.1，则，则t2=F v假定假定T1温度下的温度下的D值已知，则，值已知，则，t1= nD，则，则D、F、Z值之间的关系可以通过下式转换。值之间的关系可以通过下式转换。 或或ZTTtt1221lgZTFnD11 .121lgZTnFD/ )1 .121(110v这样，已知这样，已知T温度下的温度下的D值，值，Z值，再针
24、对罐头产品值，再针对罐头产品需要确定需要确定n值后，就可计算得到相应的值后，就可计算得到相应的F值。值。vn值并非固定不变，要根据工厂和食品的原始菌数值并非固定不变，要根据工厂和食品的原始菌数或着污染菌的重要程度而定。或着污染菌的重要程度而定。v比如在美国，对肉毒杆菌，要求比如在美国，对肉毒杆菌，要求n=12，对生芽梭状，对生芽梭状芽孢杆菌，芽孢杆菌，n=5。v例例2v在某杀菌条件下，在在某杀菌条件下，在121.1用用1 min恰好将菌全部杀灭；现恰好将菌全部杀灭；现改用改用110、10 min处理，问能否达到原定的杀菌目标？设处理，问能否达到原定的杀菌目标？设Z=10。例例3.2解解已知：已
25、知： T1=110，t1=10 min，T2=121.1，t2=1 min，Z=10。利用利用TDT曲线方程，将曲线方程，将110、10 min转化成转化成121.1下的时下的时间间t2 ，则，则t2 = 0.78 min t2说明未能全部杀灭细菌。那么在说明未能全部杀灭细菌。那么在110下需要多长时间才够下需要多长时间才够呢？仍利用上式，得呢？仍利用上式，得t1 = 12.88 min 例例3:某产品净重某产品净重454 g，含有，含有D121.1=0.6 min、 Z=10的芽孢的芽孢12个个/g；若杀菌温度为；若杀菌温度为110，要求效果为产品腐败率不，要求效果为产品腐败率不超过超过0.
26、1%。求：。求：（1）理论上需要多少杀菌时间？）理论上需要多少杀菌时间？（2）杀菌后若检验结果产品腐败率为）杀菌后若检验结果产品腐败率为1%，则实际原始，则实际原始菌数是多少？此时需要的杀菌时间为多少？菌数是多少？此时需要的杀菌时间为多少？例例3解解:（1）F0=D（lg a lg b） =0.6(lg 5448 lg 0.001)=4.042 min F110=F0 lg-1(121.1 110)/10=52.1 min（2）F0=0.6(lg a lg 0.01)=4.042 min lg a = lg 0.01 + 4.042/0.6 a = 54480，即芽孢含量为，即芽孢含量为120
27、个个/g。此时，此时，F0=D(lg a lg b) =0.6(lg 54480 lg 0.001)=4.642 min F110=4.642 lg-1(121.1 110)/10=59.8 min例：有一发酵罐，内装培养基例：有一发酵罐，内装培养基40m3，在，在121的温度下进的温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢行实罐灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢2107个，个，在在121 时的灭菌速率常数为时的灭菌速率常数为0.0287s-1。试求灭菌失败的。试求灭菌失败的机率为机率为0.001所需的时间。所需的时间。解：解：(min)9 .23ln1)(0287. 0(001.
28、0)(10810210400114760SSNNktskNN个）个例：有培养基例：有培养基30m3，在，在125的温度下进行的温度下进行6m3/h连续连续灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢105个，在个，在125时的灭菌速率常数为时的灭菌速率常数为11min-1。试求灭菌维持时间。试求灭菌维持时间和维持罐体积。和维持罐体积。解：每分钟处理解：每分钟处理0.1m3有有 取停留取停留8min 301125608.081.0(min)24.3ln1)(min11(001.0)(103101030mVNNktkNNSS个）个除菌的方法除菌的方法 v培养基的加热灭菌
29、（包括常压或蒸汽高压加热法）培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）v空气的过滤除菌空气的过滤除菌v紫外线或电离辐射紫外线或电离辐射v化学药物灭菌化学药物灭菌 （一）高温杀菌作用的种类（一）高温杀菌作用的种类 v高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。脂质成分等。v湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由于湿湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由于湿热易于
30、传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。1干热灭菌法，干热灭菌法， 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在烘箱内，在150170下维持下维持12小时后，即可达到小时后，即可达到彻底灭菌的目的。彻底灭菌的目的。 在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能灼烧，是一种最彻底的
31、干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。 2湿热灭菌法湿热灭菌法v湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。v多数细菌和真菌的营养细胞在多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理左右处理510min后即可杀死；后即可杀死；v酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80以上的温以上的温度处理才能杀死；度处理才能杀死；v而细菌的芽孢最耐热，一般要在而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理下处理15min才能杀死。才能杀死。（1）常压法）常压法v巴氏消毒法（巴氏消毒法（pasteurization） 用于牛奶
32、、啤酒、果用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。风味。v巴氏消毒法是一种低温消毒法巴氏消毒法是一种低温消毒法v低温维持法：在低温维持法：在63下保持下保持30分钟可进行牛奶消毒；分钟可进行牛奶消毒；v高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72下保持下保持15秒钟即可。秒钟即可。v间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适
33、间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。用于不耐热培养基的灭菌。v方法是：将待灭菌的培养基在方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸煮下蒸煮1560分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。（2）加压法）加压法v常规加压灭菌法常规加压灭菌法v盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻
34、底驱尽盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至后将锅密闭，再继续加热至121（压力为（压力为1kgcm2或或15磅英寸磅英寸2），时间维持），时间维持1520分钟，也可分钟，也可采用在较低的温度（采用在较低的温度（115，即，即0.7kgcm2或或10磅磅英寸英寸2）下维持）下维持35分钟的方法。分钟的方法。v此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。 连续加压灭菌法连续加压灭菌法v在发酵行业里也称在发酵行业里也称“连消法连消法”。此法只
35、在大规模。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。的发酵工厂中作培养基灭菌用。v主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在一般在135140下处理下处理515秒钟。秒钟。 连续加压灭菌法优点连续加压灭菌法优点 因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比比“实罐灭菌实罐灭菌”（120，30分钟）提高产量分钟）提高产量5
36、10；由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；适宜于自动化操作；适宜于自动化操作；降低了操作人员的劳动强度。降低了操作人员的劳动强度。 （二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素 v（1）灭菌物体含菌量的影响。）灭菌物体含菌量的影响。v 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制养基，
37、一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。成的组合培养基，含菌量低。v（2）灭菌锅内空气排除程度的影响）灭菌锅内空气排除程度的影响v检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到“扑扑扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯蒸汽了。蒸汽了。v（3）灭菌对象）灭菌对象pH的影响的影响v（4）灭菌对象的体积。要防止用常
38、规的压力和时间）灭菌对象的体积。要防止用常规的压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。v（5）加热与散热速度。这两段时间也对灭菌效果和）加热与散热速度。这两段时间也对灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好培养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注的重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。意。 （三）高温对培养基成分的有害影响及其防止（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止 消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施v（1）采用特殊加热灭菌法）采用特殊加热灭菌法 v（2）对
39、易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；糖液与其他成分分别灭菌后再合并；v（3）对含）对含Ca2+或或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在培养基）可进行低压灭菌（在112即即0.57kgcm2或或8磅英寸磅英寸2下灭菌下灭菌15分钟）或间歇灭菌；分钟）或间歇灭菌；（5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法
40、进行）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌培养基的灭菌(二二)灭菌设备灭菌设备 l、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多多 手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。 立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶养基的灭菌，一
41、次能装几百至几千瓶(袋袋)。但投资太大，。但投资太大，适合大型菌种场使用。适合大型菌种场使用。v2常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过也最好不超过500公斤。公斤。 3烘箱烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。也可用于其它物品烘干。 三、灭菌的实际操作三、灭菌的实际操作 v（一）空罐灭菌（一）空罐灭
42、菌 v空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。v为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。各死角残存的杂菌或芽孢。 v（二）实罐灭菌（二）实罐灭菌 v将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温将培养基置于发
43、酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。 v操作要点：操作要点： v三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的这就是所谓的“三路进气三路进气”。 培养基连消工艺流程图培养基连消工艺流程图 配料罐 连消泵 连消塔 维持罐 冷却罐 蒸汽 蒸汽 放汽 冷却水 无菌培养基 进发酵罐 喷淋冷却连续灭
44、菌流程喷淋冷却连续灭菌流程v（2）过滤除菌法）过滤除菌法 v是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。试剂或培养液。v目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。安装滤膜及无菌过滤过程。v滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器（Sei
45、tz滤器）、素烧瓷过滤器以及硅藻土过滤器等。滤器）、素烧瓷过滤器以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。v（3）其他方法）其他方法 v在配制培养基时，为避免发生沉淀，一般应按配方在配制培养基时，为避免发生沉淀，一般应按配方逐一加入各种成分。逐一加入各种成分。v另外，加入另外，加入0.01EDTA或或0.01NTA（氮川三乙酸）（氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。v最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯等对个别成最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯等对个别成分进行灭菌处
46、理。分进行灭菌处理。三、化学杀菌剂或制菌剂三、化学杀菌剂或制菌剂 （一）表面消毒剂（一）表面消毒剂v常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。续的作用谱。v表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学治
47、疗用的化学药剂。细胞内的化学治疗用的化学药剂。 v为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在临床上最早使用的消毒剂临床上最早使用的消毒剂石炭酸作为比较的标石炭酸作为比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。准，并提出了石炭酸系数这一指标。v所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能杀死所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而分钟，而供试菌定为供试菌定为Salmonellatyphi（
48、伤寒沙门氏菌）。（伤寒沙门氏菌）。 消消 毒毒 试试 验验 v 以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面污染大肠以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面污染大肠杆菌液。杆菌液。v 消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭于含消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿，在规格板空心处旋转自左至右涂抹稀释液试管中沾湿，在规格板空心处旋转自左至右涂抹整个区域。整个区域。v 消毒后采样：在前采样地点旁用消毒后采样：在前采样地点旁用0.05过氧乙酸溶液过氧乙酸溶液消毒物体表面，消毒物体表面，30分钟后将无菌棉拭于含分钟后将无菌棉拭于含5ml采样液试采样液试管中沾湿，作为消毒后样液。管中沾
49、湿，作为消毒后样液。v 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释。将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释。 v 培养待凝固后培养待凝固后37培养培养2448小时，作菌落计数。小时，作菌落计数。灭菌效果监测灭菌效果监测v、高压蒸气灭菌效果监测、高压蒸气灭菌效果监测v(1) 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器不同部高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器不同部位，观察灭菌后指示卡颜色变化。位，观察灭菌后指示卡颜色变化。v(2)芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽胞芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽胞105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌后作细的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌后作细菌计数测定。对照是不经灭
50、菌的菌片，芽胞完全被菌计数测定。对照是不经灭菌的菌片，芽胞完全被杀灭或杀来率达杀灭或杀来率达99.9999为合格。为合格。 、紫外线消毒效果监测、紫外线消毒效果监测 微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关，装入电池，微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关，装入电池，打开电源开关，接通电源，将测定电压转换开关拨至打开电源开关，接通电源，将测定电压转换开关拨至电压一方，此时指针应超过中线。电压一方，此时指针应超过中线。 测定时，将测定电压转换开关拨至测定一方，打测定时，将测定电压转换开关拨至测定一方，打开紫外线灯照射分钟后，将紫外线灯强度计置于紫开紫外线灯照射分钟后，将紫外线灯强度计置于紫外线灯下垂直
