1、 l药代动力学研究中的生物样品分析l临床前药代动力学研究l人体生物利用度和生物等效性l常用动力学软件介绍l1.概念的统一 l药代动力学、生物利用度、生物等效性为三个不同且有互相联系的概念，注意区别使用。l药代动力学内容包括药物在体内的吸收、分布、排泄、代谢过程和动态变化过程：体内过程和速率过程l生物利用度包括绝对生物利用度和相对生物利用度l生物等效性主要是相对生物利用度的内容l2.稳定性稳定性l了解待测药物和内标物在不同pH、光照、溶剂、温度条件下稳定性l对于中药或多组分制剂，应注意他们的相互作用l体液中药物的稳定性包括室温、冷藏（2-8）、冻融、冷冻（-20-70）3. 灵敏度：最低定量浓度
2、灵敏度：最低定量浓度注意与检测限相区别根据药物体内药物浓度确定一般为3-5个半衰期或峰浓度的1/10-1/20MS(pg) RF(ng)UV(g)v4.选择性选择性v待测药物及内标色谱峰均要与呈基线分离v内源性物质、药物的代谢物、可能的合并用药及中药中其他组分不干扰分析v提供对照品、空白生物样品、空白生物样品加对照品及用药后的生物样品色谱图l5.萃取回收率萃取回收率l一般要求大于50%l液-液萃取l固相萃取l蛋白沉淀、超滤6.工作曲线及线性关系工作曲线及线性关系做5个点以上，一般6-7个点最高浓度与最低浓度比值应在50-500之间浓度宽度应涵盖峰浓度和最低浓度相关系数应大于0.99。7.方法精
3、密度与准确度方法精密度与准确度精密度包括日内精密度和日间精密度一般要求应做5个点以上准确度一般用相对回收率表示，应作5个点以上RSD应小于10%，在LOQ附近应小于15%生物制品RSD应小于15%，在LOQ附近应小于20%l1实验药品实验药品l 应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。使用的受试药物应与药效学或毒理学研究使用的一致。l对照品应是标明含量的纯品 v2实验动物实验动物v 一般采用成年和健康的动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠和狗等。v首选动物：应与药效学或毒理学研究一致。v 尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。v 创新药应选用两种或两种以上
4、的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物。其他类型的药物，可选用一种动物（建议首选非啮齿类动物，如犬或兔等）。v口服用药不宜选用兔子等食草类动物。 l3给药途径给药途径 l 所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致。l4试验剂量试验剂量l 药代动力学研究至少应设三个剂量组，其中一个剂量应相当于药效学试验有效剂量，高剂量一般接近于最大耐受量(MTD)，以了解药物在体内的动力学过程是线性动力学还是非线性动力学。l5.灵敏度灵敏度(sensitivity)l用最低检测浓度或定量限（limit of quantitation , LOQ）,如 g/ml或ng/ml等表示。l它是标准曲线上
5、的最低浓度，要求能测至35个消除半衰期后或Cmax的1/101/20的血药浓度。 l6提取回收率（绝对回收率）提取回收率（绝对回收率）l应考察高、中、低三个浓度的提取回收率l一般应高于50。l7.特异性特异性(specificity )l必须能证明所测的物质为原形药物或活性代谢物，并能排除内源性物质、其它代谢物和杂质的干扰。l对于色谱法至少要提供标准品、空白样品、外加样品和用药后的样品色谱图。Fig 1 HPLC Chromatograms for plasma Danshensu concentrationA-Standard B-Blank plasma；C- Blank plasma w
6、ith Danshensu ;D-Plasma with oral of Salvia miltiorrhiza extract 1-Danshensuq8.标准曲线（标准曲线（standard curve）q应分别制备药物在不同生物样品（如血、尿、粪、胆汁和组织匀浆等）中的标准曲线。q每条标准曲线至少包括5个浓度，并应覆盖整个生物样品的浓度范围，不得外推。q应提供标准曲线的线性方程和相关系数（要求色谱法的r0.99，生物学方法r0.98）。 0510152025051015202530C（mg.L-1)R(标样/内标） 图图2. 对乙酰氨基酚血浆标准曲线对乙酰氨基酚血浆标准曲线 9.精密度精
7、密度(precision）用日内和日间相对标准误差（relative standard deivation, RSD%）表示方法精密度。要求在标准曲线范围内选用高（接近上限）、中、低（接近LOQ）三种浓度，每一浓度至少测定5个样品，求出各自的RSD（%）。对g/ml级水平的RSD应10% ，ng/ml级水平的RSD可15%。10.准确度准确度(accuracy）用相对回收率(recovery）表示。其测定与精密度类似应在标准曲线范围内选用高、中、低三种浓度，每一浓度至少测定5个样品。l11实验设计实验设计l 取样点的设计应兼顾到吸收相、分布相和消除相.根据研究样品的特性，取样点通常可安排913
8、个点不等，即吸收相应取23个点，达峰浓度处取23点，分布相取23点，消除相取34个点l整个采样时间应持续到35个半衰期或到Cmax的1/101/20。l 在非连续取样的动物试验中，每个时间点至少应有5只动物的数据;如经同一动物多次采样，每个时间点至少应有3只动物的数据。l 口服给药，一般在给药前应禁食12小时以上。v12组织分布试验组织分布试验v 一般选用小鼠或大鼠，选定一个有效剂量给药后，分别在吸收相、分布相和消除相各选一个时间点取样测定。v测定心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、脂肪和肌肉等重要组织中的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织，特别是效应靶器官和毒性靶器官的分布。v若某
9、组织的药物浓度较高，应进一步研究消除的情况。每个时间点至少应有5个动物的数椐。l人体生物利用度（bioavailability）是反映制剂中主药吸收进入人体体循环的相对量和速度的药代动力学参数。l生物等效性（bioequivalancy）指一种药物的不同制剂，在相同实验条件下以相同剂量用于人体，其吸收程度和速度无显著性差异。两者概念不尽相同，但试验方法基本一致。 l1特异性特异性l首选色谱法如HPLC、GC、GC-MS或LC-MS等方法 l2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围l必须用至少5个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同生物介质，线性范围要能覆盖全部待测浓度，不得用线性范围外推的方法
10、求算未知样品的浓度。标准曲线不包括零点。l3精密度与准确度精密度与准确度l精密度用质控样品的日内和日间相对精密度用质控样品的日内和日间相对标准差（标准差（RSD）表示，一般表示，一般RSD应小应小于于15在在LOQ附近附近RSD应小于应小于20。l准确度是指用特定方法测得的生物样准确度是指用特定方法测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度，可用品浓度与真实浓度的接近程度，可用相对回收率表示，一般应相对回收率表示，一般应85115范围内，在范围内，在LOQ附近应在附近应在80120范围内。范围内。 加样浓度加样浓度 (mgL)0.269.8419.680.269.8419.68 0.299.102
11、0.490.299.7221.54 0.2210.2219.030.259.3819.56 检出浓度检出浓度0.2410.2721.080.309.2118.26 (mgL)0.308.6617.510.299.3719.09 0.308.4716.960.309.6217.65 X0.279.3419.010.299.4619.22 SD0.040.851.800.020.211.50 RSD（%）13.79.19.57.22.27.8l l表表1-3 精密度试验精密度试验日日 内内 变变 异异 日日 间间 变变 异异 加 样 浓 度 (mgL)0.269.8419.68 109.392.5
12、104.1 84.5103.996.7 91.4104.4107.1 114.488.188.9 回 收 率114.086.286.2 （%）110.798.8109.4 105.995.399.4 95.793.692.8 113.695.297 110.497.889.7 X105.095.697.1 SD10.6 6.07.9 RSD（%） 10.1 6.2 8.1l表表1-2 相对回收率试验相对回收率试验(n=10)l4最低定量限最低定量限l最低定量限是标准曲线上的最低浓度最低定量限是标准曲线上的最低浓度点，又称灵敏度，表示测定样品中符点，又称灵敏度，表示测定样品中符合准确度和精密度要
13、求的最低药物浓合准确度和精密度要求的最低药物浓度。度。 l5样品稳定性样品稳定性l对含药生物样品在室温、冰冻和冻融对含药生物样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和考察，以确定生物样品的存放条件和时间。时间。l6提取回收率提取回收率l应考察高、中、低三个浓度的提取回收率，其限度一般应高于50。l7质控样品质控样品l质控样品系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。一般配制高、中、低三个浓度的质控样品。l8质量控制质量控制l应在生物样品分析方法确证完成之后开始测试未知样品。每个未知样品一般测定一次，
14、必要时可进行复测。每批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低三个浓度的质控样品。质控样品测定结果的偏差一般应小于20。l9受试者入选条件：受试者入选条件：l一般情况应选择健康男性志愿者。特一般情况应选择健康男性志愿者。特殊作用的药品，则应根据具体情况选殊作用的药品，则应根据具体情况选择适当受试志愿者，如妇科用药，选择适当受试志愿者，如妇科用药，选择健康女性志愿者；试验药品可能引择健康女性志愿者；试验药品可能引起受试者精神或躯体依赖性反应时，起受试者精神或躯体依赖性反应时，则应选择需要该类药品治疗的患者。则应选择需要该类药品治疗的患者。l一般情况下，受试者应具备如下条件一般情况下
15、，受试者应具备如下条件l男性男性l1840周岁。同一批受试者年龄不宜相差周岁。同一批受试者年龄不宜相差10岁以岁以上。上。l体重：一般要求在标准体重体重：一般要求在标准体重10范围内；或体范围内；或体重指数重指数BMI在在2024范围内。范围内。l身体状况：无心、肝、肾、消化道、神经系统、身体状况：无心、肝、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史；体格检查示血压、精神异常及代谢异常等病史；体格检查示血压、心率、心电图、呼吸状况、肝、肾功能和血象无心率、心电图、呼吸状况、肝、肾功能和血象无异常。异常。l试验前两周内未服用任何其它药物。试验前两周内未服用任何其它药物。l签署知情同意书。签署
16、知情同意书。 l受试者例数为受试者例数为1824例例 l绝对生物利用度试验选用经批准上市的绝对生物利用度试验选用经批准上市的相同药物静脉注射剂作为参比制剂。相同药物静脉注射剂作为参比制剂。l相对生物利用度试验选用经批准上市的相对生物利用度试验选用经批准上市的相同药物相同剂型的主导产品作为参比相同药物相同剂型的主导产品作为参比制剂制剂 l对乙酰氨基酚咀嚼片生物利用度研究自愿受试者知情同意书对乙酰氨基酚咀嚼片生物利用度研究自愿受试者知情同意书l我自愿参加对乙酰氨基酚咀嚼片人体生物利用度和生物等效性研我自愿参加对乙酰氨基酚咀嚼片人体生物利用度和生物等效性研究。经过华中科技大学同济医学院临床药理研究所
17、医生对本项研究。经过华中科技大学同济医学院临床药理研究所医生对本项研究所作的充分说明，我已经了解到，本项研究是经国家药品监督究所作的充分说明，我已经了解到，本项研究是经国家药品监督管理局批准，为证实对乙酰氨基酚咀嚼片在人体吸收程度合格性管理局批准，为证实对乙酰氨基酚咀嚼片在人体吸收程度合格性而进行的工作；我已经认识到该研究的而进行的工作；我已经认识到该研究的意义、目的、药物作用、意义、目的、药物作用、可能出现的不良反应以及有效的预防办法。试验期间我将按医生可能出现的不良反应以及有效的预防办法。试验期间我将按医生要求用药，不用任何其它药物；按要求进餐，不吸烟、不饮酒，要求用药，不用任何其它药物；
18、按要求进餐，不吸烟、不饮酒，适度活动；按规定时间接受血样采集和必要的观察。临床适度活动；按规定时间接受血样采集和必要的观察。临床药理研药理研究所将进行必要的监护并提供自愿受试者营养费，以保证工作顺究所将进行必要的监护并提供自愿受试者营养费，以保证工作顺利进行。鉴于此，我自愿参加对乙酰氨基酚咀嚼片人体生物利用利进行。鉴于此，我自愿参加对乙酰氨基酚咀嚼片人体生物利用度和生物等效性研究，并按照试验要求与医务人员密切配合完成度和生物等效性研究，并按照试验要求与医务人员密切配合完成此项研究。此项研究。l 自愿受试者（签名）自愿受试者（签名）l年年 月月 日日l 华中科技大学同济医学院临床药理研究所华中科
19、技大学同济医学院临床药理研究所l临床药理所医生（签名）临床药理所医生（签名）_l年年 月月 日日l10 设计方法设计方法l一个受试制剂与一个参比制剂比较的情一个受试制剂与一个参比制剂比较的情况下，采用两制剂双周期交叉试验设计，况下，采用两制剂双周期交叉试验设计，以减少不同试验周期和个体差异对试验以减少不同试验周期和个体差异对试验结果的影响。结果的影响。l受试者按随机原则分成两组。一组受试受试者按随机原则分成两组。一组受试者先服用受试制剂，后服用参比制剂；者先服用受试制剂，后服用参比制剂；另一组受试者先服用参比制剂，后服用另一组受试者先服用参比制剂，后服用受试制剂。通常应间隔受试制剂。通常应间隔
20、1周或周或2周。半衰周。半衰期长的药物，需有更长的间隔时间。期长的药物，需有更长的间隔时间。l11.生物样品采集时间点的确定生物样品采集时间点的确定l通常应有预备试验，为合理设计采样点提通常应有预备试验，为合理设计采样点提供依据。供依据。l应用血药浓度测定法时，服药前应先取空应用血药浓度测定法时，服药前应先取空白血样。白血样。l一般在药时曲线峰前部分至少取一般在药时曲线峰前部分至少取4个点，峰个点，峰后部分取后部分取6个或个或6个以上点。总采样点不少个以上点。总采样点不少于于11个。采样持续到受试药原形或其活性个。采样持续到受试药原形或其活性物物35个半衰期时，或持续采样至血药浓个半衰期时，或
21、持续采样至血药浓度为度为Cmax的的110120以后。以后。l12.对受试者的要求对受试者的要求l受试者于试验前受试者于试验前1日和试验期内均勿日和试验期内均勿饮用酒类和咖啡类饮料；试验前禁饮用酒类和咖啡类饮料；试验前禁食过夜食过夜10小时。于次日早晨空腹服小时。于次日早晨空腹服用受试制剂或参比制剂，用用受试制剂或参比制剂，用150200ml温开水送服；服药温开水送服；服药2小时后方小时后方可再饮水，可再饮水，4小时后进统一餐。小时后进统一餐。l受试者服药后应避免剧烈运动，亦受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床不得长时间卧床 l13.生物等效性评价生物等效性评价l对受试制剂与参比制剂的
22、生物等效性评价，应从对受试制剂与参比制剂的生物等效性评价，应从药物吸收程度和吸收速度两方面进行。药代动力药物吸收程度和吸收速度两方面进行。药代动力学参数学参数AUC和和Cmax，经对数转换后进行交叉试经对数转换后进行交叉试验的方差分析与双单侧验的方差分析与双单侧t检验处理。检验处理。l若受试制剂若受试制剂AUC的的90可信限落在参比制剂可信限落在参比制剂80125范围内，范围内，Cmax的的90可信限落在可信限落在70143范围内，范围内，Tmax经非参数法检验无差异，可以认定经非参数法检验无差异，可以认定受试制剂与参比制剂生物等效。受试制剂与参比制剂生物等效。 l1.NONLIN软件软件国外
23、应用最广泛的软件国外应用最广泛的软件Win Nonlin是其是其Windows版本，为美国版本，为美国Pharsight公司的产品公司的产品可用于几乎所有的药代、药效及非房室可用于几乎所有的药代、药效及非房室模型的分析模型的分析l药代动力学和生物药剂学程序包药代动力学和生物药剂学程序包PKBP-N1q由南京军区总医院于由南京军区总医院于1985年编制年编制q主要功能包括：主要功能包括：非线性曲线拟合隔室模型并作参数估算非线性曲线拟合隔室模型并作参数估算非线性米曼型消除动力学参数估算非线性米曼型消除动力学参数估算非房室模型分析非房室模型分析给药方案设计和预测体内血浓变化给药方案设计和预测体内血浓
24、变化l国家药品评审中心组织国家药品评审中心组织l中国药理学会数学专业委员会编制中国药理学会数学专业委员会编制l国内应用最广国内应用最广l可处理各种途径的线性和非线性药动学可处理各种途径的线性和非线性药动学模型模型l主要功能：主要功能：v可处理不同房室数的各种线性和非线性药动学可处理不同房室数的各种线性和非线性药动学模型的时间血浓数据，并打印药动学参数及各模型的时间血浓数据，并打印药动学参数及各种图表种图表v计算机自动给出可能的房室数及权重系数的计计算机自动给出可能的房室数及权重系数的计算结果算结果v对多剂量组数据进行批处理及统计分析对多剂量组数据进行批处理及统计分析v用户可自定义房室模型、权重
25、系数、计算方法、用户可自定义房室模型、权重系数、计算方法、收敛精度、初始值等进行研究分析收敛精度、初始值等进行研究分析v提供提供12种模型，其中种模型，其中9种属于一级速率消除的种属于一级速率消除的线性房室模型，线性房室模型，3种属于种属于M ichaelis-Menten消消除的一房室非线性模型除的一房室非线性模型l l MAIN MENUl 1. 3p87 (New Edition)l 2. Bioequivalence evaluationl 3. Estimation of Absorption Ratel 4. Estimation of Pk parameters from uri
26、nary datal 5. Exit MAIN MENUl 1. Input or Modify Datal 2. Computation for Mean C-T Data or Selection of Modelsl 3. Computation for Batch or Groups of C-T Datal 4. Algorithms and Conditions Specified by Userl 5. Output of Computed Resultsl 6. Definition of Pharmacokinetic Modelsl 7. Simplified Parame
27、ters Estimation Systeml 8. ExitlMODEL: Two-compartment Model with i.v. InjectionlRecord No. 2 Mean of Group 1lAlgorithm = Marquardt Weight = 1lCompartment number = 2 Regression coefficient = .9987655lR square = .9975322 WSS = 4.953764E-02lGoodness of fit = 7.419017E-02 Maximum C(obs)-C(cal) = .15313
28、63lMax (C-C(cal)/C) % = 11.99278 Convergent precision = 7.894796E-30lAIC = -31.06529 Run test: 4lParameter Unit Values Standard ErrorlA ug/ml 6.668624 2.88E-01lalpha 1/h 3.888228 3.02E-01lB ug/ml 1.162247 1.62E-01lbeta 1/h 0.392228 6.58E-02lV (c) (mg)/(ug/ml) 1.276997lT 1/2 alpha h 0.178268lt 1/2 be
29、ta h 1.767202lK21 1/h 0.911100lK10 1/h 1.673882lK12 1/h 1.695475lAUC (ug/ml)*h 4.678270lCL(s) mg/h/(ug/ml) 2.137542l BIOEQUIVALENCE EVALUATION PROGRAMl 1. Input PK parameters (AUC,Cmax,Tmax,. )l 2. Bioequivalence Analysis of PK parameters in 1.l 3. Input Concentration-Time data and create a data fil
30、el 4. Estimation of Concentration-Time data filel 5. Example From : Textbooks & Monographs: S-C Chow & J-P Liul 6. ExitlANALYSIS OF BIOEQUIVALENCEl 1. Input Concentration-Time data Estimation of Parametersl 2. Display F Test and Two two One-sided tests Procedurel 3. Display Individual subject Concen
31、tration-Time data and curvel 4. Printout C-T data and Estimated Parameters on Printerl 5. Return to Main menul PARAMETER:AUC(0-Tn) ANALYSIS OF VARIANCE Data without transformationl-lSource Sum of Squares DF Mean Squares F value P valuel-lInter-subjectsl Carry-over 554.0536 1 554.0536 7.1019 0.01578l
32、 Residuals 1404.2750 18 78.0153 5.5943 0.00032lIntra-subjectsl Formulation 0.0051 1 0.0051 0.0004 0.98493l Periods 5.7711 1 5.7711 0.4138 0.52814l Residuals 251.0191 18 13.9455lTotal 2215.1239 39l-lTwo one-side test andl (1-2*alpha) confidential intervall-lMean of Reference: 33.7026 Mean of Tested:
33、33.7266lt1: 5.728 = t(1-alpha): 1.7340 t2: 5.688 = t(1-alpha): 1.734l90% confidential interval: 94.0%-106.1%l-l CONCLUSION: Test and Reference formulation bioequivalencelPARAMETER:AUC(0-Tn) ANALYSIS OF VARIANCE After Logrithmic transformationl-lsource Sum of Squares DF Mean Squares F value P valuel-
34、lInter-subjectsl Carry-over 4.8996 1 4.8996 -29.1826 -8.61027l Residuals -3.0221 18 -0.1679 -9.1995 -0.00033lIntra-subjectsl Formulation 0.0032 1 0.0032 0.1765 0.67940l Periods 0.0023 1 0.0023 0.1281 0.72453l Residuals 0.3285 18 0.0183ltotal 2.2116 39l-l Two one-side test andl (1-2*alpha) confidential intervall-lMean of Reference: 3.5007 Mean of Tested: 3.4828lt1: 4.804 = t(1-alpha): 1.7340 t2: 5.643 = t(1-alpha): 1.734l90% confidential interval: 91.2%-105.8%l-lCONCLUSION: Test and Reference formulation bioequivalencel
