1、 任务1-7 菌种的保藏菌种的保藏 一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的菌种存活，不丢失，不污染菌种存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种随时为生产、科研提供优良菌种二、菌种保藏的原理：二、菌种保藏的原理：n首先，首先，选用选用优良的纯种优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）胞等）n其次，其次，创造微生物代谢不活波，生长繁殖受抑制，难以发创造微生物代谢不活波，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件（其环境要素是生突变的环境条件（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺干燥、低温、缺氧、缺营养营养 以及添加保护剂等）以及
2、添加保护剂等）n再次，再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。伤。三、菌种保藏的方法三、菌种保藏的方法n斜面保藏法n穿刺保藏法n沙土管干燥保藏法n真空冷冻保藏法n液氮保藏法n低温保藏法斜面低温保藏法n方法：接种适宜斜面培养基 培养4保藏n原理：低温下，微生物代谢强度明显下降n适用：各大类n保藏期：3-6个月n缺点：保存期短，传代多，易退化 半固体穿刺保藏法n方法：适宜半固体培养4保藏n原理：缺氧、低温n适用：好气性细菌，酵母等n保藏期：6-12个月n步骤： 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/
3、2处，待微生物生长良好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物. 砂土管干燥保藏法n方法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土 管，然后接种保藏。n原理：无营养，缺氧，干燥n适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌n保藏期：2-10年或更长河沙河沙60目筛目筛弃去大颗粒及杂质弃去大颗粒及杂质80目筛目筛去掉细沙去掉细沙吸铁石吸铁石吸去铁质吸去铁质1020的的 盐酸浸泡盐酸浸泡24h去除有机物去除有机物水洗至中性水洗至中性烘干或晒干烘干或晒干土：土：取地面下取地面下4060cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，非耕作层贫瘠且粘性较
4、小的土，研碎，100目过筛，目过筛， 水洗至中性，烘干。水洗至中性，烘干。 将处理后的沙、土按质量比将处理后的沙、土按质量比2121混合。混匀的沙土分装入安瓿混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为管或小试管中，高度为1cm1cm左右，塞好棉塞，左右，塞好棉塞，121121高压间歇灭菌高压间歇灭菌2-32-3次，烘干备用。次，烘干备用。 孢子或芽孢悬液孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中加入无菌砂土管中 干燥干燥 封口封口 4-6 4-6保藏保藏步骤：沙：沙：无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。沙
5、土管恢复培养沙土管恢复培养真空冷冻干燥保藏法：方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25 -40）抽真空 真空封口 4-5保藏措施：低温、干燥，缺氧，保护剂适用：各大类保藏期：5-10年或更长步骤n1安瓿管的处理 直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭菌备用。n2 保护剂 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。n3 菌悬液制备 最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。n4 冷冻干燥n5 安瓿管的保藏 4-5保藏复苏方法： 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， 将安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦
6、一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端， 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。 液氮超低温保藏法方法：菌悬液 加入保护剂 分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）逐步降温至-25液氮罐（-196）保藏措施：低温、加保护剂（10%甘油）适用：范围广泛保藏期： 一般23年，长则9年。菌种的准备可采用下列几种方法：n刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；n接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；n将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真
7、菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；n在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。复苏方法：从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38-40水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。菌种冻存管四、菌种保藏的注意事项n菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢n菌种保藏所用的基质：碳源菌种保藏所用的基质：碳源 n操作过程对细胞结构的损害操作过程对细胞结构的损害7种常用菌种保藏方法的比较种常用菌种保藏方法的比
8、较方法方法主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评价评价斜面低温保藏法斜面低温保藏法低温（低温（4）各大类各大类约约16月月简便简便冰箱保藏法冰箱保藏法（半固体）（半固体）低温（低温（4），避氧），避氧细菌，酵母菌细菌，酵母菌约约612月月简便简便液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法低温（低温（4），阻氧），阻氧各大类各大类约约12年年简便简便砂土干燥保藏法砂土干燥保藏法干燥，无营养干燥，无营养产孢子的微生物产孢子的微生物约约110年年简便有效简便有效甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法低温（低温（70），保护剂），保护剂（1550甘油）甘油）细菌，酵母菌细菌，酵母菌约约10年年较简便较简便冷冻干燥保藏
9、法冷冻干燥保藏法干燥、低温、无氧，有保干燥、低温、无氧，有保护剂护剂各大类各大类515年年繁而高效繁而高效液氮保藏法液氮保藏法超低温（超低温（196），有保），有保护剂护剂各大类各大类15年年繁而高效繁而高效n菌种保藏机构Ex： 美国的标准菌种保藏所（ATCC） 美国农业部农业研究服务部（ARS） 英国国立标准菌种保藏所（NCTC）我国：1 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 2 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） 3 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 4 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 5 抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 6 兽医微生物菌种保藏管理中心 （CVCC）
