1、色谱色谱分离法分离法n薄层薄层色谱色谱n柱柱色谱色谱n纸纸色谱色谱n实验内容：实验内容： 色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。等作用，从而将各组分分开。 流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相（可以是固体或液体）。根据组分在固定相中的作用原理不
2、（可以是固体或液体）。根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等；根据等；根据操作条件不同操作条件不同，可分为，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱气相色谱及高效液相色谱等类型。等类型。返回固定相（吸附剂）的要求：固定相（吸附剂）的要求：1. 具有较大的表面积和一定的吸附能力具有较大的表面积和一定的吸附能力2. 与流动相及试液中各组分不发生化学反应，并不溶于流动相与流动相及试液中各组分不发生化学反应，并不溶于流动相3. 应粒度均匀，颗粒细小应粒度均匀，颗粒细
3、小常见官能团的极性常见官能团的极性常用流动相的极性常用流动相的极性薄层色谱薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用常用TLC表示，表示，又称薄层层析，属于又称薄层层析，属于固液吸附色谱固液吸附色谱。是近年来发展起来的。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。的优点。它展开时间短（几十分钟就能达到分离目的），分离效率高它展开时间短（几十分钟就能达到分离目的），分离效率高（可达到（可达到300-400块理论塔板数）。块理论塔板数）。一方面一方面适用于小量样适用于小量样品（几到几十微克
4、，甚至品（几到几十微克，甚至0.01g）的分离的分离；另一方面若在；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分分离多达离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品的样品。因此又可用来精制样品。 薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（103cm左右）左右）上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后待干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于处的起点线上，凉干或吹干后
5、置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展待展开剂前沿离顶端约开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。记下原点至燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）：）：Rf =溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 溶剂前沿至原点中心的距离良好的分离，良好的分离，Rf 值应在值应在0.15-0.75之间之间1、定性分析物质。、定性分析物质。（通过与已知标准物对比的方（通过与已知标准物对比的方法进行法进行未知
6、物未知物 的鉴定的鉴定，检验物质是否纯净检验物质是否纯净）2、快速快速分离少量物质。分离少量物质。 （几到几十微克，甚至（几到几十微克，甚至0.01g） 3、跟踪反应进程。、跟踪反应进程。在进行化学反应时，常利用薄在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。完成。4、用薄层色谱法确定柱色谱的淋洗剂。、用薄层色谱法确定柱色谱的淋洗剂。 薄层色谱的用途：薄层色谱的用途： 此法特别适用于此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易挥发性较小或在较高温度易发生变化发生变化而不能用气相色谱分析的物质。而不能用气相色谱分析的物质。薄层色
7、谱薄层色谱n吸附剂的选择吸附剂的选择n薄层板的制作薄层板的制作n展开剂的选择展开剂的选择n点样与展开点样与展开n显色显色n实验关键步骤：实验关键步骤：n定性与定量定性与定量吸附剂的选择吸附剂的选择 薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层吸附色谱吸附色谱的吸附的吸附剂最常用的是剂最常用的是氧化铝和硅胶氧化铝和硅胶；分配色谱分配色谱的支持剂为的支持剂为硅藻土硅藻土和纤维素。和纤维素。 其颗粒大小一般为其颗粒大小一般为260260目以上目以上。颗粒太大，展开剂移。颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移
8、动太慢，斑点不集中，效果也不理想。太慢，斑点不集中，效果也不理想。吸附剂的活性与其含水量有关，吸附剂的活性与其含水量有关，含水量越低，活性越高。含水量越低，活性越高。 化合物的吸附能力与分子极性有关化合物的吸附能力与分子极性有关，分子极性越强，分子极性越强，吸附能力越大。吸附能力越大。化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，各子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：酸和碱酸和碱 醇、胺、硫醇醇、胺、硫醇 酯、醛、酮酯、醛、酮 芳香
9、族芳香族化合物化合物 卤代物、醚卤代物、醚 烯烯 饱和烃饱和烃n硅胶：常用吸附剂。硅胶：常用吸附剂。n氧化铝：用于非极性化合物的分离，根据制备时的氧化铝：用于非极性化合物的分离，根据制备时的PH不同，又分为碱性、中性和酸性。不同，又分为碱性、中性和酸性。n聚酰胺；分离易生成氢键的极性化合物。聚酰胺；分离易生成氢键的极性化合物。n纤维素：极性有机化合物及金属阳离子、阴离子分离。纤维素：极性有机化合物及金属阳离子、阴离子分离。吸附剂的选择吸附剂的选择薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度（尽量均匀且厚度（0.251mm）要固定。否则，要固
10、定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。 （1）平铺法：平铺法：用薄层涂布器涂布，它适合于科研工作用薄层涂布器涂布，它适合于科研工作中数量较大要求较高的需要中数量较大要求较高的需要（2）浸渍法：浸渍法：把两块干净的玻片叠合，浸入调制好的把两块干净的玻片叠合，浸入调制好的吸附剂浆料中，取出后分开、凉干。吸附剂浆料中，取出后分开、凉干。 （3）简易平铺法（倾注法）简易平铺法（倾注法）：将配制好的浆料倾注：将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下凉干后进行活
11、化。其表面均匀平滑，在室温下凉干后进行活化。 本实验用此法制备薄层板本实验用此法制备薄层板6片：吸附剂为硅胶片：吸附剂为硅胶G（ 4g4g ），用用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液（的羧甲基纤维素钠水溶液（8-108-10mlml ）调成浆料。）调成浆料。薄层板的制作薄层板的制作 薄层板的活化薄层板的活化 将涂布好的薄层板置于将涂布好的薄层板置于室温凉干后室温凉干后，放在烘箱内，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中硅胶板一般在烘箱中渐渐升温渐渐升温，维持，维持105110活化活化30min。氧化铝板在氧化铝板在200烘烘4h可得到活性为可得
12、到活性为级的薄板，级的薄板，在在150160烘烘4h可得活性为可得活性为级的薄板。级的薄板。展开剂的选择展开剂的选择 薄层色谱展开剂的选择，主要根据薄层色谱展开剂的选择，主要根据样品的极性、溶解度样品的极性、溶解度和吸附剂的活性和吸附剂的活性等因素来考虑。凡溶剂的极性越大，则对一等因素来考虑。凡溶剂的极性越大，则对一化合物的洗脱能力也越大，即化合物的洗脱能力也越大，即Rf值也越大（如果样品在溶剂值也越大（如果样品在溶剂中有一定溶解度）。薄层色谱用的展开剂绝大多数是有机溶中有一定溶解度）。薄层色谱用的展开剂绝大多数是有机溶剂，剂， 常用展开剂的极性按如下次序递增：常用展开剂的极性按如下次序递增：
13、己烷和石油醚己烷和石油醚 环己烷环己烷 四氯化碳四氯化碳 三氯乙烯三氯乙烯 二硫化碳二硫化碳 甲苯甲苯 苯苯 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 丙酮丙酮 丙醇丙醇 乙醇乙醇 甲醇甲醇 水水 吡啶吡啶 乙酸乙酸所用展开剂必须所用展开剂必须纯粹和干燥纯粹和干燥，否则会影响吸附剂的活性和，否则会影响吸附剂的活性和分离效果。分离效果。 展开剂的选择展开剂的选择微量圆圈法点样与展开点样与展开n定性分析用玻璃毛细管点样，定量用微量注射器定性分析用玻璃毛细管点样，定量用微量注射器n样品溶液应为均一体系样品溶液应为均一体系通常将样品溶于通常将样品溶于低沸点溶剂低沸点溶剂（丙酮、甲醇、乙醇
14、、氯仿、苯、（丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳）配成乙醚和四氯化碳）配成1%的溶液，用内径小于的溶液，用内径小于1mm管口管口平整的毛细管点样：平整的毛细管点样：（1）先用铅笔在距薄层板一端）先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点斑点直径一般不超过直径一般不超过2mm。（2）若因样品溶液太稀，若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散，以防样点过大，造
15、成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。等现象，而影响分离效果。（3）若在同一板上点几个样，样点间距离应为）若在同一板上点几个样，样点间距离应为11.5cm。（4）点样要轻，不可刺破薄层点样要轻，不可刺破薄层。在薄层色谱中，在薄层色谱中，样品的用量样品的用量对物质的分离效果有很对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度显色剂的灵敏度、吸附剂吸附剂的种类、薄层的厚度的种类、薄层的厚度均有关系。样品太少，斑点不均有关系。样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。大或拖尾现象，以
16、至不易分开。 薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。常用的展开槽有：气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。常用的展开槽有：长方形盒式和广口瓶式长方形盒式和广口瓶式 展开方式有：展开方式有：（1）上升法上升法 将色谱板垂直于盛有展开剂的容器中，适合于含将色谱板垂直于盛有展开剂的容器中，适合于含粘合剂的色谱板。粘合剂的色谱板。（2）倾斜上行法倾斜上行法 色谱板倾斜色谱板倾斜1015角【适用于干板或无粘角【适用于干板或无粘合剂软板的展开】；合剂软板的展开】；色谱板倾斜色谱板倾斜4560角，适用于含有粘合角
17、，适用于含有粘合剂的色谱板。剂的色谱板。（3）下降法下降法 用滤纸或纱布等将展开剂吸到薄层板的上端，使展用滤纸或纱布等将展开剂吸到薄层板的上端，使展开剂沿板下行，这种连续展开的方法适用于开剂沿板下行，这种连续展开的方法适用于Rf值小的化合物。值小的化合物。（4）双向色谱法双向色谱法 将样品点在方形薄层板的角上，先向一个方将样品点在方形薄层板的角上，先向一个方向展开，然后转动向展开，然后转动90角的位置，再换另一种展开剂展开。适角的位置，再换另一种展开剂展开。适合于成分复杂的化合物分离。合于成分复杂的化合物分离。 显色凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱。显色凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层
18、色谱。薄层色谱薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等（等（化学化学法法） 对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸锌、荧光黄）的薄层板对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸锌、荧光黄）的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点（色斑点（紫外紫外-荧光法荧光法）。也可用卤素斑点试验法（）。也可用卤素斑点试验法（碘熏法碘熏法）来使薄层色谱斑点显色来使薄层色谱斑点显色 。呈现的斑点一般在。呈现的斑点一般在2-3s消失消失，因此，因此必须必须立即用铅笔标出化合物的位置立即用铅笔
19、标出化合物的位置。n显色方法：紫外显色方法：紫外-荧光法，碘熏法、化学法荧光法，碘熏法、化学法显色显色硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性适用于酸性物质的分离和分析物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为：薄层色谱用的硅胶分为：“硅胶硅胶H”不含粘合剂；不含粘合剂；“硅胶硅胶G”含煅石膏粘合剂；含煅石膏粘合剂；“硅胶硅胶HF254”含荧光物质，可用于波长为含荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；紫外光下观察荧光；“硅胶硅胶GF254”既含煅石膏又含荧光剂等类型。既含煅石膏又含荧光剂等类型。 与硅胶相似，氧化铝也因含粘合剂或含荧光剂而分与硅胶相
20、似，氧化铝也因含粘合剂或含荧光剂而分为氧化铝为氧化铝G、氧化铝氧化铝GF254及氧化铝及氧化铝HF254。 粘 合 剂 除 上 述 的粘 合 剂 除 上 述 的 煅 石 膏煅 石 膏 （ 半 水 合 硫 酸 钙 ：（ 半 水 合 硫 酸 钙 ：2CaSO4H2O）外，还可用外，还可用淀粉、羧甲基纤维素钠淀粉、羧甲基纤维素钠。通常将薄层板分为硬板（加粘合剂）和软板（不加通常将薄层板分为硬板（加粘合剂）和软板（不加粘合剂）粘合剂）实验关键步骤：实验关键步骤：1、薄层板的制备应注意两点：载玻片应干净且不被手、薄层板的制备应注意两点：载玻片应干净且不被手污染及吸附剂在玻片上应污染及吸附剂在玻片上应均匀
21、平整均匀平整。2、点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板面；、点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板面；展开时，展开时，不要让展开剂前沿上升至底线不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法。否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。产物中各组分在薄层板上的相对位置。 定性与定量分析定性与定量分析n定性：测定比移值定性：测定比移值R,洗脱后用其他方法定性洗脱后用其他方法定性n定量：溶剂洗脱定量：溶剂洗脱-分光光度测定，板上原位直接定量分光光度测定，板上原位直接定量（测定斑点面积法），薄层扫描。（测定
22、斑点面积法），薄层扫描。柱色谱柱色谱 将固定相均匀填在金属或玻璃制成的管中做成色谱柱，并将固定相均匀填在金属或玻璃制成的管中做成色谱柱，并以此进行分离的方法叫柱色谱。以此进行分离的方法叫柱色谱。 吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形
23、成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。来。 常见层析柱常见层析柱n硅胶填料柱硅胶填料柱n氧化铝填料柱氧化铝填料柱n聚酰胺填料柱聚酰胺填料柱n离子交换柱离子交换柱n凝胶色谱柱凝胶色谱柱纸层析纸层析 参考书目：参考书目：1、韩广甸、韩广甸 赵树纬赵
24、树纬 李述文李述文 等编译有机制备化学手册等编译有机制备化学手册上卷上卷2、曾昭琼、曾昭琼 主编有机化学实验（第二版）主编有机化学实验（第二版）3、黄涛、黄涛 主编有机化学实验（第一版）主编有机化学实验（第一版）4、周科衍、周科衍 吕俊民主编有机化学实验（第二版）吕俊民主编有机化学实验（第二版）5、谷亨杰（主编）有机化学实验、谷亨杰（主编）有机化学实验为柱为柱色谱选择合适的淋洗剂色谱选择合适的淋洗剂 如果某种溶剂如果某种溶剂对某一组分对某一组分Rf 值很大，而对另一组值很大，而对另一组分分Rf 值值较较小小，该溶剂就能使两种组分在柱上获得良好，该溶剂就能使两种组分在柱上获得良好的分离效果。的分
25、离效果。 或者，也可选择两种溶剂进行分离。或者，也可选择两种溶剂进行分离。一种溶剂对一种溶剂对某一组分某一组分Rf 值很大，对另一组分值很大，对另一组分Rf 值值很很小小，这样，该，这样，该溶剂可使前一组分很快从柱上洗脱，然后用另一种对溶剂可使前一组分很快从柱上洗脱，然后用另一种对两种组分两种组分Rf 值都很大的溶剂，洗脱剩下的组分。值都很大的溶剂，洗脱剩下的组分。 一般来说，用两种溶剂进行淋洗，可节约溶剂和时一般来说，用两种溶剂进行淋洗，可节约溶剂和时间。间。本实验用此法制备薄层板本实验用此法制备薄层板6片：吸附剂为硅胶片：吸附剂为硅胶G（ 4g4g ），用用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液（
26、的羧甲基纤维素钠水溶液（8-108-10mlml ）调成浆料。）调成浆料。样品溶剂改用乙醚。（原为二甲苯）样品溶剂改用乙醚。（原为二甲苯）实验内容：实验内容：1、合成乙酰二茂铁、合成乙酰二茂铁（以二茂铁为原料（以二茂铁为原料,将干燥后的粗将干燥后的粗产物用石油醚（产物用石油醚（6090）重结晶。）重结晶。 ）2、薄层色谱试验薄层色谱试验（以纯净的二茂铁为标准，检验产品（以纯净的二茂铁为标准，检验产品中是否含有未反应完的二茂铁，同时为确定柱色谱的溶中是否含有未反应完的二茂铁，同时为确定柱色谱的溶剂提供实验基础）剂提供实验基础）3、柱色谱试验、柱色谱试验（提纯乙酰二茂铁，样品粗乙酰二茂铁提纯乙酰二
27、茂铁，样品粗乙酰二茂铁乙醚溶液，乙醚溶液，3：1石油醚石油醚/乙醚混合溶剂乙醚混合溶剂 ）4、产品表征、产品表征：测熔点、红外光谱：测熔点、红外光谱实验关键步骤实验关键步骤：1、滴加磷酸时一定要在振摇下用滴管慢慢加入。滴加磷酸时一定要在振摇下用滴管慢慢加入。2、烧瓶要干燥，反应时应用干燥管，避免空气中烧瓶要干燥，反应时应用干燥管，避免空气中的水进入烧瓶内。的水进入烧瓶内。3、用碳酸氢钠中和粗产物时，应小心操作，防止用碳酸氢钠中和粗产物时，应小心操作，防止因加入过快使产物逸出。因加入过快使产物逸出。4、格重结晶及减压过滤操作规范。格重结晶及减压过滤操作规范。 实验关键步骤：实验关键步骤：1、装柱
28、要紧密，要求无断层、无缝隙。装柱要紧密，要求无断层、无缝隙。2、在装柱、洗脱过程中，始终保持有溶剂覆盖吸附在装柱、洗脱过程中，始终保持有溶剂覆盖吸附剂。剂。一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。实验关键步骤：实验关键步骤：1、薄层板的制备应注意两点：载玻片应干净且不被、薄层板的制备应注意两点：载玻片应干净且不被手污染及吸附剂在玻片上应均匀平整。手污染及吸附剂在玻片上应均匀平整。2、点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板、点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板面；展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，面；展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值和准确值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。
