1、分子生物学实验技术分子生物学实验技术武汉大学基础医学院生化与分子生物学系武汉大学基础医学院生化与分子生物学系喻红喻红Tel : 68759795(O)Tel : 68759795(O)基础医学研究技术基础医学研究技术_分子生物学研究v分子生物学研究对象分子生物学研究对象v分子生物学研究技术分子生物学研究技术v实验内容：实验内容： 核酸的分离纯化、鉴定与分析核酸的分离纯化、鉴定与分析 基因工程技术基本流程基因工程技术基本流程Contents核酸的分离制备及分析1基因工程基本流程2分子生物学实验常用仪器介绍32011级硕士生分子生物学实验 核酸的分离制备及分析及在医学研究中的应用核酸的分离制备及分
2、析及在医学研究中的应用 DNA的制备与分析的制备与分析v真核细胞基因组DNA的分离纯化(蛋白酶K法) vDNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 基因表达水平分析的原理与方法（基因表达水平分析的原理与方法（RNA的分离纯化及分析）的分离纯化及分析） v真核组织总RNA提取（TRIzol试剂法）v RNA紫外定性、定量分析及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定v目的基因PCR及PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 v凝胶成像系统的应用（示教） 基因工程技术基本实验基因工程技术基本实验v利用感受态细菌（DH5a）进行重组质粒转化、Amp琼脂平板筛选 v利用阳性克隆菌（单菌落）进行质粒的小量扩增v质粒DNA提取
3、（碱裂解法）v质粒DNA的限制性内切酶酶切及酶切片段非变性 PAGE鉴定 2011级硕士研究生分子生物学实验课程表日期日期2011.9授授 课课 内内 容容9.99.169.23I I核酸的分离纯化、鉴定与分析核酸的分离纯化、鉴定与分析 及在医学研究中的应用及在医学研究中的应用ADNA的制备与分析的制备与分析l 介绍介绍DNA分离纯化的原则、分析鉴定方法及研究新进展分离纯化的原则、分析鉴定方法及研究新进展l 真核细胞基因组真核细胞基因组DNA的分离纯化的分离纯化(蛋白酶蛋白酶K法法)l DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定II II基因工程基本
4、原理、流程及应用基因工程基本原理、流程及应用A感受态细胞制备、质粒转化、阳性克隆扩增感受态细胞制备、质粒转化、阳性克隆扩增l 概述基因工程基本流程概述基因工程基本流程l 利用感受态细菌进行质粒转化、平板筛选利用感受态细菌进行质粒转化、平板筛选l 利用阳性克隆菌进行质粒的小量扩增利用阳性克隆菌进行质粒的小量扩增9.109.179.24B基因表达水平分析的原理与方法基因表达水平分析的原理与方法（RNA的分离纯化及分析）的分离纯化及分析）l 介绍介绍RNA分离纯化的原则、要点、条件、分析方法分离纯化的原则、要点、条件、分析方法及新进展及新进展l TRIzol试剂提取真核组织总试剂提取真核组织总RNA
5、l RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定l 介绍介绍PCR技术的原理及应用技术的原理及应用l 采用提纯的质粒采用提纯的质粒DNA进行目的基因进行目的基因PCRB质粒质粒DNA的提取、鉴定分析的提取、鉴定分析1介绍质粒在基因工程中的应用介绍质粒在基因工程中的应用2质粒质粒DNA的碱裂解法提取的碱裂解法提取9.119.189.251.PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定产物琼脂糖凝胶电泳鉴定2.凝胶成像系统的应用（示教）；凝胶成像系统的应用（示教）；1.质粒质粒DNA的限制性内切酶酶切分析；的限制性内切酶酶切分析；2.DNA小片段的非变性小片段的非变性PAGE考考 试试核酸的分离
6、与纯化核酸的分离与纯化基本原则：基本原则：1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研 究核酸结构和功能的基础；究核酸结构和功能的基础；2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。真核核酸提取的主要步骤真核核酸提取的主要步骤 来源：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）v温和裂解细胞，溶解核酸核酸，使核酸核酸与组蛋白分离；v采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。Step 1Step 2Step 3Step 4细胞的破碎：物理方法溶胀和自溶化学方法生物酶降解核酸的纯化核酸的浓缩和沉淀核酸的贮存
7、核酸分离提取的主要步骤核酸分离提取的主要步骤真核基因组真核基因组DNADNA的制备与分析的制备与分析 v蛋白酶蛋白酶K K苯酚抽提法苯酚抽提法分离纯化真核细胞基因组DNA vDNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 制备基因组制备基因组DNADNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。可是进行基因结构和功能研究的重要步骤。可从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。常采用从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。常采用EDTAEDTA、SDSSDS以及蛋白酶以及蛋白酶K K等试剂作用下破膜、消化细胞，并使组等试剂作用下破膜、消化细胞，并使组织蛋白与织蛋白与DNADNA分子分离，
8、再用酚、分子分离，再用酚、氯仿氯仿/ /异戊醇异戊醇抽提去除蛋白质，抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀而获得高纯最后经乙醇沉淀而获得高纯DNADNA。操作中常加入。操作中常加入RNaseRNase除去除去RNARNA，这一方法获得的这一方法获得的DNADNA可用于可用于SouthernSouthern分析，还可用于分析，还可用于PCRPCR的模的模板、基因组板、基因组DNADNA文库构建等实验。通常可得到文库构建等实验。通常可得到100100200kb200kb的的DNADNA片段。（一般真核细胞基因组片段。（一般真核细胞基因组DNADNA有有10107-97-9bpbp。）。） DNADNA提取
9、应注意提取应注意（1 1）防止和抑制）防止和抑制DNaseDNase对对DNADNA的降解；的降解；（2 2）尽量减少对溶液中）尽量减少对溶液中DNADNA的机械剪切破坏。的机械剪切破坏。蛋白酶蛋白酶K K苯酚抽提法苯酚抽提法操作步骤操作步骤 1 1材料处理材料处理新鲜或冰冻组织处理：新鲜或冰冻组织处理： 取约取约50100mg肝组织肝组织, 剪碎，加组织细胞裂解液剪碎，加组织细胞裂解液0.5ml匀浆。匀浆。 将匀浆液转至将匀浆液转至1.5ml Eppendorf管（管（Ep管）中。管）中。(此时于匀此时于匀 浆液中加入终浓度为浆液中加入终浓度为20g/ml的无的无DNase的的RNase A
10、)。 加加5l蛋白酶蛋白酶K (终浓度终浓度100g/ml)，混匀。，混匀。 37水浴水浴1h后转为后转为50水浴水浴3h（裂解细胞，消化蛋白），（裂解细胞，消化蛋白）， 经常摇动。经常摇动。 2室温下加室温下加500l饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。3离心离心12000rpm10min,取上层水相到新取上层水相到新Ep管中管中 (约约450l)。 4加等体积氯仿加等体积氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1），充分混匀，离心），充分混匀，离心12000rpm10min，取上层水相，取上层水相(约约300l)到另一到另一Ep管中。管中。5加加1/10体积
11、的体积的3 mol/L 醋酸钠醋酸钠(pH5.2)和和2.5倍体积预冷的倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。无水乙醇，颠倒混匀。6离心离心14000rpm15min，小心弃上清液。，小心弃上清液。7沉淀用沉淀用70%冷乙醇洗涤冷乙醇洗涤1-2次，离心收集沉淀次，离心收集沉淀DNA,室温室温下挥发乙醇下挥发乙醇(勿使勿使DNA完全干燥完全干燥)。8沉淀沉淀DNA加加50-100l TE缓冲液溶解，缓冲液溶解，20保存或直保存或直接分析接分析.操作步骤操作步骤 1.1. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用EpEp管、滴头等用管、滴头等用品及品及ddHddH
12、2 2O O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在、试剂等应高压灭菌，操作尽量在44以下进行。以下进行。2.2. 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。3.3. 弃去乙醇时动作应轻，切忌甩干，以免弃去乙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNADNA丢失。丢失。4.4. 37%37%以上浓度的异丙醇或者以上浓度的异丙醇或者70%70%以上浓度的乙醇可选择性沉淀以上浓度的乙醇可选择性沉淀DNADNA，一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类，一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与与DNADNA共沉淀；所以常规需要共沉淀；所以常规需要70%70
13、%乙醇漂洗乙醇漂洗DNADNA沉淀物。沉淀物。5.5. 室温下放置室温下放置16h16h或或6565放置放置1h1h，可加快基因组，可加快基因组DNADNA沉淀的溶解。沉淀的溶解。注意事项注意事项核酸的鉴定与分析核酸的鉴定与分析 v紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。v核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。v核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。v多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。vDNA测序 v基因表达
14、分析:（RNA详细结构和数量的分析） DNADNA的鉴定的鉴定一、紫外法测紫外法测DNADNA的纯度及浓度的纯度及浓度原理 组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50g/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。操 作 取取15lDNA样品溶于双蒸水至样品溶于双蒸水至3ml，分别于，分别于260、280、230nm处比色并记录。处比色并记录。定量分析：定量分析： DNAA260核
15、酸稀释倍数核酸稀释倍数50/1000纯度分析：纯度分析： DNA A260/A280=1.8 A260/A2801.8，有，有RNA杂质，用杂质，用RNase消化；消化； A260/A2801.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A2302.0，可能有盐未除尽。，可能有盐未除尽。注：此法不能区分注：此法不能区分DNA和和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。，不能用于核酸粗制品的测定。核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳核酸的分级分离核酸的分级分离v核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，
16、具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。 影响核酸电泳的因素影响核酸电泳的因素 1 核酸的性质核酸的性质 核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等 2 凝胶孔径的大小凝胶孔径的大小 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，表7-1列出不同凝胶浓度与其对应DNA分子的分离范围。 3 电场强度和电场方向电场强度和电场方向 低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与电压成正比。 4 电泳环境电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。常用有三种，即Tri
17、s-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 的DNA分离效果好，TAE缓冲容量低，但便宜。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性.核酸电泳的指示剂与染色剂v 核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青 溴酚兰溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的dsDNA片段大致相同. 二甲苯青二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与甘油、蔗
18、糖或聚蔗糖400组成上样缓冲液.上样缓冲液的作用有增加样品密度(比重)，使DNA沉入加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指示带，可推测核酸电泳的速度和位置.使样品溶液呈色，使加样操作更直观方便。v 核酸电泳后需染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次核酸电泳后需染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色是银染色. 溴化乙锭溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。银染银染色：色：银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，可将核酸带染成黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.琼脂
19、糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼低熔点琼脂糖熔点为脂糖熔点为6265，溶解后在，溶解后在 37下维持液下维持液体状态约数小时，主要用于体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质片段的回收，质粒与外源性粒与外源性DNA的快速连接等的快速连接等.二、二、DNADNA的琼
20、脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 原理vDNADNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中筛效应向正极移动过程中, , 因因DNADNA分子的大小及构分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNADNA分分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（比。电泳时加溴化乙锭（EBEB），其与），其与DNADNA结合形成结合形成一种荧光络合物，在一种荧光络合物，在254254365 nm365 nm紫外线照射下可紫外线照射下可产生
21、桔红色的荧光，可用于检测产生桔红色的荧光，可用于检测DNADNA。 DNADNA的鉴定分析的鉴定分析【操作步骤】1琼脂糖凝胶板的制备：将琼脂糖凝胶板的制备：将1%2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到冷却到6070，倒入凝胶槽，厚度约，倒入凝胶槽，厚度约35 mm，放置样品梳，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶淹没过胶12 mm为止。为止。2加样：样品中加加样：样品中加1/5体积的体积的6凝胶上样缓冲液混匀，取凝胶上样缓冲液混匀，取15 l加加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的入凝胶点样
22、孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。分子量标准物。3电泳：电压电泳：电压210 V/cm 胶胶, 待溴酚蓝移至凝胶的待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关距离时，关闭电源。闭电源。4取出凝胶，浸于取出凝胶，浸于0.5 g/ml EB溶液中染色溶液中染色2030min后后, 置紫外置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。区带。【注意事项】1 1加样时勿破坏样品孔，否则加样时勿破坏样品孔，否则DNADNA带型不整齐。带型不整齐。2 2上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400400可增加样品密可增加样品密度，使
23、样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。3 3EBEB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有有EBEB的溶液用后应妥善净化处理。的溶液用后应妥善净化处理。4 4EBEB也可预加在凝胶中或上样缓冲液中进行也可预加在凝胶中或上样缓冲液中进行DNADNA电泳时的同步电泳时的同步染色，但染色，但EBEB是带正电荷的分子，电泳时向阴极移动，会影响是带正电荷的分子，电泳时向阴极移动，会影响DNADN
24、A的实际迁移率。若延长的实际迁移率。若延长DNADNA电泳时间，电泳时间，EBEB会从凝胶中迁移会从凝胶中迁移出来，从而使小片段出来，从而使小片段DNADNA难于检测，可将凝胶浸在难于检测，可将凝胶浸在0.5 g/ml 0.5 g/ml EBEB溶液中重新染色后检测。溶液中重新染色后检测。5 5加样孔的加样量依加样孔的加样量依DNADNA样品中片段的数量及大小而定，通常样品中片段的数量及大小而定，通常对对0.5cm0.5cm宽的加样孔，宽的加样孔，DNADNA上样量在上样量在0.10.10.5g0.5g即可有良好的即可有良好的观察效果。观察效果。6 6小的凝胶小的凝胶微型和中型凝胶的电泳一般比
25、大凝胶要快，常微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳( (10 V/cm)10 V/cm)。应。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。真核细胞真核细胞RNARNA的制备与分析的制备与分析 v真核组织总RNA提取(TRIzol试剂法)v RNA紫外定性、定量分析v甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定抑制抑制RNaseRNase活性活性是提取是提取RNARNA的关键的关键v实验中严格控制内源性和外源性实验中严格控制内源性和外源性RNaseRNase的污染。的污染。RNaseRNase可耐受多
26、种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。v外源性外源性RNaseRNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNaseRNase也也会造成污染。这些外源性的会造成污染。这些外源性的RNaseRNase可污染器械、玻璃制可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。v各种组织和细胞中则含有大量各种组织和细胞中则含有大量内源性的内源性的RNaseRNase。 RNARNA操作
27、中的要求操作中的要求v 玻璃器皿均应在使玻璃器皿均应在使用前于用前于180的高温下干烤的高温下干烤6hr或更长时间。或更长时间。v 塑料器皿可用塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。v 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在干燥，再浸泡在3% H2O2 室温室温10min，然后用，然后用0.1% DEPC水冲水冲洗，晾干。洗，晾干。v 配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用0.1%
28、DEPC，在，在37处理处理12hr以上，然以上，然后用高压法除去后用高压法除去DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处处理过的无菌双蒸水配制，然后经理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。滤膜过滤除菌。v 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验中手套要勤换。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验中手套要勤换。v 设置设置RNA操作专用实验室，所有器械等操作专用实验室，所有器械等应为专用。应为专用。防止防止RNARNA酶污染的措施酶污染的措施1.1. 焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPCDEPC）：）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的RNA
29、RNA酶抑制酶抑制剂。它通过和剂。它通过和RNARNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。2.2. 异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的目前被认为是最有效的RNARNA酶抑制剂，它在裂酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使解组织的同时也使RNARNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对从核蛋白中解离出来，又对RNARNA酶有强烈的变性作用。酶有强烈的变性作用。3.3. 氧钒核糖核苷复合物：氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和
30、核苷形成的复合物，由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和它和RNARNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNARNA酶酶的活性。的活性。4.4. RNARNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasinRNasin）：）：从大鼠肝或人胎盘中提取从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。得来的酸性糖蛋白。RNasinRNasin是是RNARNA酶的一种非竞争性抑制剂，酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种可以和多种RNARNA酶结合，使其失活。酶结合，使其失活。5.5. 其它其它：SDSSDS、尿素、硅藻土等对、尿素、硅藻土等对RNARNA酶也有一定抑制作用酶
31、也有一定抑制作用。 常用的常用的RNA酶抑制剂酶抑制剂RNARNA的分离和纯化的分离和纯化- TRIzol- TRIzol试剂法试剂法原理原理v首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，加入氯仿产生第二相，离心后，RNARNA存在于水相。存在于水相。v经异丙醇沉淀水相中的经异丙醇沉淀水相中的RNARNA可用于可用于NorthernNorthern杂交分析、杂交分析、RT-PCRRT-PCR等；等；v存在于有机相的存在于有机相的DNADNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到
32、的而分别分离，得到的DNADNA大小约大小约20Kb20Kb，适用于，适用于PCRPCR的模的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。1.1. 取取150-200mg150-200mg鼠肝组织置匀浆器中，加鼠肝组织置匀浆器中，加2ml Trizol2ml Trizol冰上冰上匀浆，将匀浆液匀浆，将匀浆液1ml 1ml 转至转至EpEp管中，静置管中，静置minmin。2.2. 加入加入0.3ml0.3ml氯仿，振荡氯仿，振荡15s15s，静置，静置2min2min。3.3. 44离心，离心，12000rpm12000rpm15min15min，取上清，取上
33、清0.4ml0.4ml转入新转入新EpEp管。勿触动中下层（沉淀可用于管。勿触动中下层（沉淀可用于DNADNA提纯）提纯）4.4. 加入加入0.5ml0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min10min。5.5. 44离心，离心，12000rpm12000rpm10min10min，弃上清。，弃上清。6.6. 加入加入1ml 75%1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀乙醇，轻轻洗涤沉淀,10000rpm,10000rpm5min5min， 44，弃上清。，弃上清。7.7. 晾干，加入晾干，加入5050l l双蒸水溶解。（双蒸水溶解。（1515l l
34、用于紫外测定；用于紫外测定；1010l l用于变性电泳）用于变性电泳）操作步骤操作步骤RNA的鉴定 一、一、紫外法定性、定量分析紫外法定性、定量分析 260nm260nm下下ODOD值为值为1 1时相当于时相当于4040g/mlRNAg/mlRNA。取取1212lRNAlRNA样品样品溶于双蒸水至溶于双蒸水至3ml3ml ，分别于，分别于260260、280280、230nm230nm处比色并记录。处比色并记录。定量分析定量分析： RNA RNAA A260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40/100040/1000（g/mlg/ml）纯度分析纯度分析：A A260260读数在读数在0.15-1
35、.00.15-1.0之间才可靠。之间才可靠。 RNA A RNA A260260/A/A280280=1.9-2.1=1.9-2.1 A A260260/A/A2802801.91.9，有杂蛋白，用酚，有杂蛋白，用酚/ /氯仿抽提氯仿抽提; ; A A260260/A/A2302302.02.0，可能有盐未除尽。，可能有盐未除尽。做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug 二、二、RNA的甲醛变性凝胶电泳的甲醛变性凝胶电泳 原理原理v在核苷酸碱基配对抑制剂甲醛、甲酰胺或尿素存在在核苷酸碱基配对抑制剂甲醛、甲酰胺或尿素存在的情况下，的情况下，RNA的迁移率和碱基的组成和构象无关，的迁移率和
36、碱基的组成和构象无关，其电泳迁移率与分子量的对数呈反比关系。其电泳迁移率与分子量的对数呈反比关系。v可用于可用于RNA的分离、的分离、Northern杂交、测定杂交、测定RNA的的长度及回收寡核苷酸。长度及回收寡核苷酸。1.1. 配制配制1 1琼脂糖变性凝胶：琼脂糖变性凝胶： 5 5MOPSMOPS2 2琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶甲醛甲醛1.11.13.53.51 1v 制备变性的制备变性的RNARNA（l l） RNA 4.5 RNA 4.5l; l; 5 5MOPS 2.0MOPS 2.0l l； 甲醛甲醛 3.5 3.5l;l; 甲酰胺甲酰胺 10.0 10.0l l； 65 65温育温育15
37、min15min，置冰浴，置冰浴10min10min，离心使样品集中；，离心使样品集中；v 加加2 2l 10l 10甲醛凝胶上样缓冲液；甲醛凝胶上样缓冲液；v 预电泳，加样，预电泳，加样，90V90V电泳电泳1h1h；v 染色，将凝胶置于染色，将凝胶置于0.50.5g/mlg/ml的的EBEB溶液中浸泡溶液中浸泡303040min40min，于紫外下观察，于紫外下观察RNARNA区带。区带。操 作 步 骤电泳结果电泳结果 100 mg100 mg动物肌肉组织经过动物肌肉组织经过总总RNARNA提取提取, ,用用2.5g2.5g进行进行RNARNA甲醛变性胶电泳结果。甲醛变性胶电泳结果。 电泳
38、结果可检测电泳结果可检测RNARNA的完整的完整性，性，28S28S和和18S18S真核细胞的真核细胞的比值约为比值约为2:12:1，表明无，表明无RNARNA降解，由下至上分别为降解，由下至上分别为 5S5S、18S18S和和28S28S的的RNARNA。PCR技术技术vPCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚是用一对寡聚DNA作作为引物，通过加温变性退火为引物，通过加温变性退火DNA合成这一周期的合成这一周期的多次循环，使目的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经产物是以指数形式积累的，经25
39、30个循环后，扩增个循环后，扩增倍数可达倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获年发明，获1993年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。1. 1. Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶： 水生栖热菌水生栖热菌(thermus aquaticus, Taq)(thermus aquaticus, Taq)的的DNADNA聚合酶聚合酶 553DNA3DNA聚合酶活性；聚合酶活性； 无无3355外切酶活性外切酶活性， 3535轮轮0.25%0.25%错配错配，与原始模板有差别；与原始模板有差别； 最适聚合酶最适聚合酶 温度
40、温度7272，选择，选择7272延伸延伸 半衰期：半衰期：92.5 130min 92.5 130min 95 40min 95 40min 97.5 5 97.5 56min6min 变性温度：变性温度：9595使其在整个扩增循环中保持足够活性使其在整个扩增循环中保持足够活性基本要素人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-60， Tm值要相近，每条引物 10-50pmol /100l 设计原则：设计原则： 1. Primer与双链与双链DNA链互补链互补 2. Primer 不要出现内部互补序列不要出现内部互补序列; (形成形成loop环，内部二级结构环，内部二级结构) 3. 注意减
41、少注意减少Primer间互补序列间互补序列; (一般不要超过一般不要超过3个互补个互补bp,否则导致否则导致Primer形成形成dimer ) 4. Primer 5未端可修饰、突变未端可修饰、突变; 5. Primer 5端增加碱基端增加碱基: 内切酶识别点内切酶识别点; ATG起始密码起始密码; TAA、TAG、TGA终止密码终止密码 2. 2. 引物引物 可选：可选：DNADNA mRNA mRNA逆转录逆转录cDNAcDNA DNA DNA包括：包括： 质粒质粒 噬菌体噬菌体 染色体染色体DNADNA 较小较小 较大较大 目的目的genegene是单拷贝是单拷贝 变性较易变性较易 变性
42、较难变性较难 非常大，变性难非常大，变性难 模板用量模板用量: : Plasmid:lng; Chromosome:300-500ngPlasmid:lng; Chromosome:300-500ng 注意：注意： 防止交叉污染防止交叉污染3.3.模板模板 4.dNTP 4.dNTP：四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 终浓度：终浓度：5050 M M 注意：不稳定，保存时间长会失效注意：不稳定，保存时间长会失效5. Mg 5. Mg 2+2+DNADNA聚合酶作用时需要聚合酶作用时需要MgMg2+2+, , 不同的酶需不同浓度不同的酶需不同浓度MgMg2+2+ Taq Taq： 0.5-1.5mM
43、0.5-1.5mM终浓度，终浓度，MgMg2+2+ 对反应影响很大，对反应影响很大， pfu pfu： MgMg2+2+ 2-3mM 2-3mM，dNTPdNTP、PrimerPrimer用量约增加一倍用量约增加一倍外界影响：外界影响： EDTA鳌合鳌合Mg2+ ,应选低浓度应选低浓度TE(10 mM Tris,1mM EDTA)；DNA模模板、引物和板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与的磷酸基团均可与Mg2+ 结合，结合， 降低降低Mg2+有效浓有效浓度度, 如果扩增产物或效率不理想时，要注意调整合适的如果扩增产物或效率不理想时，要注意调整合适的Mg2+浓度浓度.（1 1）变性温度：）变性温
44、度：94-9594-95 Templete Templete：GCGC比例高、长度很长，则变性比例高、长度很长，则变性TT（2 2）退火：温度越高，扩增特异性越好）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于取决于TmTm值：值：TmTm退火退火TT； TmTm退火退火TT 若若TmTm较高，可使退火和延伸在同一温度较高，可使退火和延伸在同一温度(3(3）延伸：）延伸： 500nt-1min 500nt-1min 500nt500nt3min3min 一般：一般：404060sec60sec6.6.温度和时间：温度和时间：PCR扩增目的基因（以质粒DNA为模板） 总体积总体积50l灭菌双蒸水灭菌双蒸
45、水 30l10 xTaq buffer 5 l dNTP 2 l 上游引物上游引物 3 l 下游引物下游引物 3 l DNA模板模板 1 lTaq酶酶 2 lMg2+ 4 l2000rpm离心离心20sec将PCR产物置于-200C冰箱冻存！基因工程技术基因工程技术基因工程基因工程 对不同生物的遗传物质对不同生物的遗传物质- -基因基因，在体外进行，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质从新组合然后剪切、组合和拼接，使遗传物质从新组合然后通过载体通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）（质粒、噬菌体或病毒等）转转入微生入微生物、植物或动物细胞内，进行物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖无性繁殖，并使，并
46、使所需要的所需要的基因基因在细胞中在细胞中表达表达，产生出人类所需，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。要的产物或组建成新的生物类型。1. 分分分离出带有目的基因的分离出带有目的基因的DNA片段。片段。2. 切、接切、接将含目的将含目的DNA片段连接到载体分子上。片段连接到载体分子上。3. 转转将重组将重组DNA分子转入适当的受体细胞、增殖。分子转入适当的受体细胞、增殖。4. 筛筛筛选出获得了重组筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。分子的受体细胞克隆。5. 从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已扩增的目的从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已扩增的目的基因，并做序列分析等鉴定。基因，
47、并做序列分析等鉴定。6. 将目的基因克隆到将目的基因克隆到表表达载体上，导入宿主细胞表达外达载体上，导入宿主细胞表达外源蛋白。源蛋白。基因工程技术基因工程技术基因工程操作的主要步骤基因工程操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNADNA cDNAcDNA 人工合成人工合成PCRPCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNADNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定测序、测序、PCRPCR等等 基因工程相关
48、知识及原理基因工程相关知识及原理质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) 质粒是独立于染色体外的环状质粒是独立于染色体外的环状双链双链DNADNA分子。大小可为分子。大小可为1kb1kb到到200kb200kb，能自主复制且稳定遗，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。传的遗传因子。存在于细菌、放线菌、真菌以存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细胞中最多。其复制和遗传独立于细菌染色体，但依赖于宿其复制和遗传独立于细菌染色体，但依赖于宿主细胞复制的酶系。主细胞复制的酶系。质粒超螺旋结构质粒超螺旋结构质粒类型质粒类型质粒按复制方式分为两种类型：
49、质粒按复制方式分为两种类型：v松弛型质粒松弛型质粒：质粒的复制在寄主细胞松弛的控制下，不需要质粒编码的功能蛋白，而依赖于宿主提供的酶。每个细胞中含有10-200份拷贝。松弛型质粒的复制即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒。v严紧型质粒严紧型质粒：质粒复制是在寄主细胞严格控制下，需要质粒编码的功能蛋白，与寄主细胞的复制耦联同步。往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝。质粒在基因工程中的应用质粒在基因工程中的应用v大多数基因工程使用松弛型质粒。大多数基因工程
50、使用松弛型质粒。v严谨型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒严谨型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。害致死的基因。v质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。质粒质粒载体载体(Vector)(Vector)：用于携带重组用于携带重组DNADNA，并且能够使外源，并且能够使外源DNADNA一起复制一起复制与表达的质粒与表达的质粒( (运载工具运载工具) )。具备的条件：具备的条件： 易于鉴定、筛选易于
