1、 SNP 什么是SNP SNP的特点 SNP的分类 SNP的检测 SNP的应用 = 单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸() 的变异而引起的多态性一般而言, SNP在群体中发生频率不小于 1%从理论上来看每一个位点都可以有4 种不同的变异形式, 包括转换、颠换、插入和缺失，但通常发生的只有两种, 即转换和颠换,二者之比为 A G G C T A G A A T T C C A T T C G A G T CA G G C T A G A A T T G C A T T C G A G T C在人类基因组中，CpG二核苷酸的胞嘧啶是最易发生突变的位点, 其中大多数是甲基化的,可自发地脱
2、去氨基而形成胸腺嘧啶（C T）一个SNP表示在基因组某个位点上有一个 核苷酸的变化，多个核苷酸的变化，即SNPs在描述SNPs时，当前的一致意见是用术语 haplotype（单体型）代替术语allele（等位基因）位于一条染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点，被称作单体型对于所有那些在某一位点是对于所有那些在某一位点是A A而不是而不是G G的人来说，该位点周围染色体区域的人来说，该位点周围染色体区域上的上的SNPsSNPs状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型 u 位点丰富 SNP是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在人类基因
3、组中大概每1000 个碱基就至少有一个SNP,人类基因组上的SNP总量可达300万个甚至更多 具有代表性 某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素 遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性，因为SNP 是基于单核苷酸的突变，所以其突变率低 易实现分析的自动化 SNP 与传统分子标记方法存在明显不同， 不再以DNA 长度差异作为检测手段，而是直接检测序列变化，从而摆脱凝胶电泳的瓶颈限制，实现高效检测u SNP的分类根据SNP在基因组分布的位置可分为 基因编码区SNP (cSNP) 总的来说, c
4、SNP比较少,因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5, 但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义,因此倍受关注根据对遗传性状的影响,cSNP又可分为两种l 同义cSNP 即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的“含义”相同l 非同义cSNP 碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变,可能最终影响到蛋白质的功能l 基因周边SNP (pSNP）l 基因间SNP (iSNP） 基因非编码区SNP 大多数SNP 位于基因组的非编码区，它们对个体表现型是无意义的，但对群体而言，这些SNP 作为遗传标记在群体遗传和生物进化中却有很大作用u SNP
5、的检测SNP 检测技术按研究对象主要分为两大类 未知单核苷酸突变位点的检测技术l 温度梯度凝胶电泳（TGGE） 通过温度的变化，使点突变或正常的DNA片段由于氢键不稳定，造成TM值不同而表现出不同的解链行为。作为一种常用的检测SNP的强有力的工具，TGGE可分析长度在200900bp内的双链DNA片段，但如果在GC富集区，则SNP检出率则大大下降l Taqman技术1. PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5端为报告荧光基团（reporter），3端为淬灭荧光基团 (quencher) 2. PCR过程中，两个探针能与正向
6、引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光3. 特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5到3外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光4. 两个探针的5端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型 技术路线图l Multiplex SNaPshot-多重单碱基延伸技术1.在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP, 紧挨多态位点5端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中
7、，引物延伸一个碱基即终止2.经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型3.根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点4.对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得 技术路线图 该技术的优势a.分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅亚于直接测序。b.多位点同时检测：可以同时检测达12个位点，而Taqman一次仅能检测一个c.不受SNP位点多态特性限制：不管该位点是G/C, A/T, G/A, C/T还是插入/缺失多态，都可以放在一个体系中检测 d.不受样本量的限制：而Taqman对少量样本不适合 e.可以检测出受污染的样本：如果一个样本的分型峰谱
8、偏离正常的分布，它可以提示该样本可能受到污染或浓度过低，而其它分型方法则不能做到这一点l 变性梯度凝胶电泳（DGGE）l 单链构象多态性（SSCP）l 变性的高效液相色谱法（DHPLC）l 毛细管电泳（CE）l 基因芯片技术(Gene chip） 已知单核苷酸突变位点的检测技术l 限制性内切酶酶切片断长度多态分析（RFLP） 有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型 如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3端
9、改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现 技术路线图 方法特点方法特点 优点a)该技术方法简单，不需要特殊昂贵设备，而且能较快定购到实验所需试剂，实验前期准备时间短； b)如果所用的限制性内切酶正好是普通常用酶，在一定样本量的前提下，检测成本比较低； 缺点a)该方法费时费力，部分位点可能需要较长时间来优化； b)酶切不完全会严重降低检测准确率。 l 等位基因特异性PCR (AS- PCR) AS- PCR 技术主要是依赖引物的设计及优化PCR 反应条件，根据基因SNP 位点设计引物，使引物最后一个碱基与突变位点互补，使得只
10、有完全互补的序列才能扩增，因此只需根据PCR 产物的有无来判定结果 近来研究发现错配的3末端仍可以低于正常配对末端的速度延伸，干扰判定结果。改进的方法是在引物人为引入错配碱基、降低3末端特异性碱基不匹配的扩增产物，不影响或较小影响完全匹配的特异性产物的生成。引入长度差异性引物和双向等位特异PCR 是近年来常用的方法。l等位基因特异寡核苷酸片段分析（ASO）l突变错配扩增检验 （MAMA）u SNP的应用 遗传图谱的构建 在许多物种中发现、收集与鉴定的SNPs已经构成了庞大的序列变异数据库, 极大地促进了遗传图谱的构建工作,使得原来冗长乏味的事情变得轻松而有趣 用SNP标记还有助于将遗传图谱和物
11、理图谱进行进一步的整合 DNA指纹的确立 作为一种新型的DNA指纹, SNPs标记在物种鉴定、物种起源与亲缘关系、遗传育种等领域得到了广泛的应用 SNPs指纹在区分近缘种的研究中非常有效。 群体遗传和连锁不平衡 群体遗传学研究群体的基因库或者说群体遗传组成及其变化机制 在分子水平上的群体遗传学研究取决于能否得到足够的DNA多态性。尽管与一些常用的分子标记(如SSR)相比, 二等位基因的SNP显得多态性并不高，但如果考虑许多单碱基位点变异所构成的单体型时,SNP所含的信息量就非常大了，而这为群体遗传的研究提供了有力的工具 SNP标记在群体水平上的应用最具有吸引力的方面是利用群体遗传学中的连锁不平衡原理来进行高密度图谱的构建和进行关联分析 从某种意义上说,当前人们对SNPs产生如此之大的兴趣在于它作为一种标记,通过连锁不平衡作图法可以用于鉴定导致生物特定性状(如人类疾病)的基因
