1、 RubiscoRubisco（1,5-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶，二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenaseribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定性作
2、用。本课题拟以小麦为实验材料，采用着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用ELISAELISA测试技术，研究测试技术，研究RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶的特性，这些结活化酶的特性，这些结果将有助于进一步阐明果将有助于进一步阐明Rubisco Rubisco 及及RubiscoRubisco活化酶的作用活化酶的作用机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。 Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、
3、菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。 本实验利用免疫化学技术提供一个快速、本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定准确而简易的定量测定RubiscoRubisco和和 RubiscoRubisco活活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对的变化。
4、进一步对RubiscoRubisco和和 RubiscoRubisco活化酶活化酶做深入的研究。做深入的研究。v RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶的提取和纯化活化酶的提取和纯化v RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备v RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶活化酶ELISAELISA标准曲线的制定标准曲线的制定v C3C3、C4C4植物中植物中RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶含量比较及其活化酶含量比较及其与光合作用的关系与光合作用的关系v 光暗
5、处理对小麦光合作用及光暗处理对小麦光合作用及RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活化酶活化酶的影响的影响 v 施氮处理对小麦光合速率和施氮处理对小麦光合速率和RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活化酶活化酶的影响的影响 v RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶单克隆抗体制备初探活化酶单克隆抗体制备初探RubiscoRubisco和和 RubiscoRubisco活化酶活化酶的分离提纯的分离提纯RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备抗体的分离与纯化抗体的分离与纯化利用抗
6、体定量测定不同处理下利用抗体定量测定不同处理下Rubisco Rubisco 及及RubiscoRubisco活化酶的含量活化酶的含量 植物材料植物材料 扬麦扬麦5 5号号 动物材料动物材料 新西兰大白兔新西兰大白兔 高速冷冻离心机高速冷冻离心机 液相层析收集系统液相层析收集系统 垂直板电泳系统垂直板电泳系统 Beckman LS-9800Beckman LS-9800液体闪烁仪液体闪烁仪 酶联免疫测定仪酶联免疫测定仪以皮内多位点分数次注射法进行免疫以皮内多位点分数次注射法进行免疫首次免疫首次免疫加强免疫加强免疫二次免疫二次免疫0.5ml抗原抗原+0.5ml佐剂佐剂,皮内注射于皮内注射于兔子背
7、部多个部兔子背部多个部位位三周后，三周后，0.5ml抗抗原原+0.5ml佐剂佐剂,皮皮下注射于兔子背下注射于兔子背部多个部位部多个部位三周后，静脉注三周后，静脉注射射0.5ml抗原抗原检测效价检测效价一周后，耳缘静一周后，耳缘静脉采血，检测抗脉采血，检测抗体效价体效价 用心脏取血的方法采血用心脏取血的方法采血 44下离心下离心30min30min，除去红细胞，获得血清；或者，除去红细胞，获得血清；或者将血液收聚在培养皿中，将血液收聚在培养皿中，3737放置放置6h6h，用吸管吸取析，用吸管吸取析出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下2020，或加或加0
8、.1%NaN30.1%NaN3或或0.01%0.01%硫柳汞后，储存于硫柳汞后，储存于44冰箱中。冰箱中。 用一系列已知浓度的标准抗原用一系列已知浓度的标准抗原（ RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶）与活化酶）与制备的制备的RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶的活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与之相比较，求得样品将待测样品与之相比较，求得样品中抗原的含量中抗原的含量RubiscoRubisco含量（含量（mgmgg g-1-1FWFW）=提取液（提取液（mLmL）+ +鲜叶重（鲜叶重（g
9、 g） 稀释倍数稀释倍数 由标准曲线计算的由标准曲线计算的RubiscoRubisco浓度浓度/ /叶片鲜重叶片鲜重依依FolinFolin- -酚试剂法（薛应龙，酚试剂法（薛应龙，19851985）测定，以）测定，以BSABSA作标准曲线作标准曲线光合速率用便携式光合速率测定仪测定光合速率用便携式光合速率测定仪测定叶绿素含量用分光光度计测定叶绿素含量用分光光度计测定1 1 、 RubiscoRubisco的提纯和纯度鉴定的提纯和纯度鉴定图2 Rubisco在 D E AE-TOYOPEARL-650M 上0-0.5 mol/L NaCl梯度洗脱曲线00.511.522.50510152025
10、303540455055管号蛋白质含量( m g / m l)00.10.20.30.40.50.6NaCl浓度( m ol/L)NaClRubisco峰 Rubisco的电泳图谱A为Rubisco的ND-PAGE图谱 B为Rubisco的SDS-PAGE图谱55 00014 8002 2、 小麦小麦RubiscoRubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定活化酶的的提纯和纯度鉴定图4 Rubisco 活 化酶在D E A E - TOYOPEARL-650M上0 -0.5 mol/L KCl梯 度洗脱曲线00.511.522.5051015202530354045505560管号蛋白质含量( m
11、g / m l)00.10.20.30.40.50.6KCl浓度( m ol/L)KClRubisco活化酶峰Rubisco活化酶的SDS-PAGE图谱A为Rubisco活化酶;B为标准蛋白45 00041 0001 1、RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备2 2、RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶活化酶ELISAELISA标准曲线的制定标准曲线的制定3 3、C3C3、C4C4植物中植物中RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶含量比较及其活化酶含量比较及其与光合作用的关系与光合作用的关系4 4、光暗处理对小麦光合作用及、光暗处理对小麦光合作用及RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活化酶活化酶的影响的影响 5 5、不同施氮水平对小麦光合速率和、不同施氮水平对小麦光合速率和RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活活化酶的影响化酶的影响 6 6、 RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶单克隆抗体制备初探活化酶单克隆抗体制备初探
