1、1第一节 概述 转基因生物：利用基因工程技术改变基因组的构成， 用于农业生产或者农产品加工动植物、微生物及产品。主要是转基因植物。 转基因食品：转基因动植物、微生物产品，如转基因大豆：转基因动植物、微生物产品直接加工品，如转基因大豆油：以 和为原料生产的食品和添加剂，如转基因大豆油加工成的人造奶油。 转基因成分（外源基因成分）：物种本身不具有的，而是来源于其他物种的功能基因序列。2转基因食品的特征 具有其原有基因表达的性状和功能 存在外源DNA的表达产物及其生物活性3基因重组体 载体：自我复制，运载工具 目的基因：转基因生物性状改变直接相关DNA 调控元件：使目的基因表达精确开始和终止，表达增
2、强 标记基因：进行标记以便筛选转化细胞 报告基因：编码某种易于检测蛋白质或酶的基因基因组基因组基因组基因组启动子启动子终止子终止子外源目的基因外源目的基因基因重组体示意图基因重组体示意图4外源基因表达的产物主要包括：目的基因、标记基因和报告基因表达的蛋白，或意外表达的蛋白。使得其具有有传统食物有不同的生物特性，由此产生安全性问题。5第二节 食品中转基因成分检验检测方法概述主要针对外源DNA 及其表达产物DNA分析蛋白质抗原特性PCR法ELISA和蛋白印迹法6检测流程采样采样混样混样样品制备样品制备目标物质提取目标物质提取PCR或蛋白质检测或蛋白质检测结果判断结果判断结果报告结果报告7采样要求1
3、 一般规定：所用器具清洁干燥无DNA和蛋白质污染；避免样品散落，防止污染生态环境；短时间内完成，避免样品组成发生变化2 抽样方法：随机原则；“三层五点”；若加工工程损坏DNA,则加大采样量8采样要求3 抽样数量：根据转基因限量水平确定每批中应抽取的原始样品最小数量4 样品制备与保存：分三份，用于检测，复检和备查；及时加贴标签，注明编号、货物名称、品种、抽样时间、抽样人及其他必要信息9外源基因检测 根据检测目的和检测结果特异性水平不同， 检测方法可分为四类：初筛试验：普遍存在的基因重组通用元件基因特异性试验：基因重组体中含有的外源基因组成结构特异性试验：目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列事件特
4、异性试验：插入的基因序列和植物基因组之间的连接区10DNA提取及纯化 为什么要提取纯化？植物细胞中DNA主要存在于细胞核和细胞质中，细胞中各种DNA称为总DNA，其中95%以上的DNA是与蛋白质结合存在的。植物细胞中还存在大量多糖、蛋白质、多糖、多酚类物质和RNA等成分。 这些物质都会影响后续DNA的PCR检测。11DNA提取及纯化转基因成分检测时需要先提取总DNA，利用去污剂或有机溶剂破坏细胞膜，裂解细胞，是DNA与蛋白质分离并游离于提取液中，然后去除杂质成分。DNA纯化的原理是根据乙醇或异丙醇竞争结合水分子的能力远强于DNA，在DNA提取液中加入乙醇或异丙醇，DNA因溶解度降低而析出。 1
5、2DNA提取方法 一类：改进的传统方法，如苯酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲基胺法（简称CTAB法）、二氧化硅法等。第二类：试剂盒法，试剂盒法因为操作简便而被广泛应用。 13CTAB法样本准备：样本准备：固体样本要研磨成大小在2mm以下的颗粒，也可以用液氮研磨至DNA充分释放并满足DNA提取的要求；液态样本可以通过离心沉淀、加热蒸发、冷冻干燥等方法得到干物质用于DNA提取。 14CTAB法原理CTAB能溶解细胞膜并能与DNA结合成CTAB-DNA复合物，该复合物可溶解于高盐溶液中（如氯化钠），蛋白质、多糖等物质在此溶解中因溶解度降低而生成沉淀，经离心后与复合物分离；然后将该复合物置于低盐溶液中，因
6、其不溶性而沉淀析出；最后将复合物沉淀溶解于高盐溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，离心后获得纯化的DNA。 15CTAB法主要试剂 按下表配置试剂，定容至200ml,高压灭菌16DNA质量和纯度检测琼脂糖凝胶电泳 在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶里进行电泳，紫外灯下观察DNA条带判断核酸定量检测 紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值，OD260/OD280一般在1.7 1.9，高了表明有RNA污染，低了表明有蛋白质或有机溶剂污染。 17核酸PCR检测PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加
7、。 PCR反应体系是由DNA模版、引物、dNTP 、DNA聚合酶、镁离子和缓冲液等组成。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 18变性：变性：94退火：退火：56延伸：延伸：7219我国标准检测方法核酸PCR定性检测：检测目标基因是否存在 （有没有）核酸PCR定量检测：检测目标基因存在的量（有多少）201 核酸核酸PCR定性检测定性检测检测原理是定性PCR检测对象包括转基因食品目的基因、启动子、终止子、标记基因等外源基因和元件。根据转基因产品的特异性序列设计引物，对试样中外源目的基因进行PCR扩增。依据扩增产物中是否存在预期特异性片段
8、，判断样品中是否含有转基因成分。21为了提高反应准确性，在试样PCR反应的同时，应设置阴性和阳性对照。在阳性对照PCR反应时，内源基因和待测样品的特异性序列都得到扩增，阴性对照没有任何扩增，表明PCR体系正常工作。222 实时荧光定量实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR是在普通PCR反应体系中，增加能与模版结合的两端有荧光基团标记的寡聚核苷酸探针。 在PCR体系中加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，两条引物分别与待扩增目的DNA片段的5端和3端互补结合；
9、探针则与两条引物之间的目的DNA片段互补结合。23Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 扩增反应所经历的PCR循环数称为循环阈值Ct值。Ct值与模版起始拷贝数的对数呈线性关系，只要获得测试样品的Ct值就可以利用标准曲线计算出该样品中目标核酸的绝对含量。 243 LAMP检测检测 LAMP即环介导恒温扩增，已经被广泛地应用于生命科学领域中各个角落的DNA或RNA的特异高效扩增。扩增目的片段时要依赖一种具有链置换特性的DNA聚合酶和四条能
10、够识别靶序列上六个特异区域的引物。 本方法特异性高，不需要热循环设备，具有操作简单、快速的优点。2526蛋白质检测（ELISA）原理原理:从测试样品中按照一定的程序提取含有目标蛋白的基质，利用抗体与目标蛋白（为抗原）特异性结合的特性，通过对偶联抗原与抗体复合物的作用产生的信号进行检测，而实现对转基因产品特异蛋白的检测。 优点：优点：具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化。缺点：缺点：由于抗原抗体的专一性，每种转基因产品都需要开发专门的检测试剂。另外加工容易破坏蛋白的抗原性，影响结果的准确性。27ELISA吸附原理图28将原料样品粉碎后，加入缓冲液混匀，震荡抽提蛋白质，离心后去上清液稀释，加入偶联
11、抗体孵育，在一定条件下是特异性蛋白进行显色反应，测定其吸光值。同时使用与基质一致的标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算相应外源蛋白的浓度。 每一轮反应都要包括空白、阴性标准品、阳性标准品和测试样品。蛋白质检测操作蛋白质检测操作29其他检测方法1 蛋白质组学技术分析 通过研究外源基因在同种或不同种作物中的蛋白质差异性表达检测转基因产品 目前主要采用双向电泳-质谱技术及基于同位素标记的质谱分析技术进行蛋白质组学分析 优点：不仅能够鉴定差异表达的蛋白，还能对其进行较为准确的定量302 近红外光谱分析法313 变性高效液相色谱法基于异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下异源双链
12、因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中保留时间比同源双链短，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或者多峰的洗脱曲线。只能鉴定是否存在转基因成分，不能检测转基因具体发生的位置及该区域的基因序列等信息。32基因芯片技术基因芯片：基因芯片：通过微加工技术 ，将数以万计的特定序列的DNA片段（基因探针）有规律地排列固定于支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。 33基片：基片：又称载片，是基因芯片中用于固定探针的基质，通常采用标准的载玻片或者其他固体载体，经过化学修饰制备而成。 基因芯片探针：基因芯片探针：又称寡核苷酸探针，是基因芯片中固定于基质表面、能
13、与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的核酸分子。 杂交：杂交：指两条互补的单链核酸形成一条稳定的 双螺旋分子的过程34基因芯片检测原理：探针与待测样品中目标序列按碱基互补原理发生特异性杂交反应，从而实现对目标序列的检测。35基因芯片检测流程样品样品核酸核酸cDNA文库文库DNA列阵列阵基片基片基因芯片基因芯片标记的核酸标记的核酸核酸杂交核酸杂交洗涤洗涤检测检测提取PCR、标记PCR、纯化固定36基因芯片技术在转基因食品检验中的应用 检测芯片：检测芯片： 进行转基因成分筛选； 转基因食品品系或品种确定； 转基因重组体构成元件分析。 表达谱芯片表达谱芯片 主要应用于转基因食品安全性评估 ，评价
14、转基因食品中外源特异性成分产生了怎样的影响。包括：营养成分、毒性、过敏物质等变化；基 因突变或代谢途径改变；人体内发生 突变而有害人体健康的可能性等。 37优点：优点：基因芯片与传统的检测方法相比，灵敏性、特异性高，假阳性、假阴性率低，操作简便快速，高通量。缺点：缺点：成本高3839l基片材料选择固体类或薄膜类：普通玻璃片、硅片、聚丙烯膜、尼龙膜等能适应透射光和反射光测量 具有惰性和稳定性能使单位载体上结合的分子数达到最大具有活性基团l基片活化 对载体表面进行化学预处理，使探针固定于介质表面 在基片上结合的活性基团：氨基、巯基、醛基、环氧化物等，与配基结合后形成具有生物特异性的亲和表面，可以固定蛋白质、核酸、多肽等。40杂交信号检测1. 杂交反应完成后，将基因芯片用激光共聚焦芯片扫描仪进行扫描2. 激光的激发光源氏荧光生色基团产生高强度的发射荧光，光电倍增管将光信号转换、放大成点信号后收集3. 通过计算机处理获得数据，统计并分析结果41核酸杂交将基因芯片与待测样品靶分子两者放置于杂交反应体系中，在一定条件下进行杂交反应，使探针与目标序列按碱基互补配对原则进行特异性结合。42
