1、L/O/G/O高效液相色谱检测技术高效液相色谱检测技术 教师：刘深勇教师：刘深勇内容概要内容概要工作原理工作原理结构组成结构组成常见故障与维护常见故障与维护HPLC概述概述HPLC应用应用 高效液相色谱法(HPLC)是上个世纪七十年代迅速发展起来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 一、一、HPLC HPLC 简介简介 HPLC即
2、 High performance liquid chromatography, 或 High pressure liquid chromatography，译为：高效液相或高压液相。高效液相色谱法(HPLC)是上个世纪七十年代迅速发展起来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 一、一、HPLC HPLC 简介简介 HPLC是在经典
3、的液相色谱法基础上发展起来的，其以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组成、比例和pH值可灵活调节，分离模式多样。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。 高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验，并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的
4、自动化水平和分析精度。现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。 高效液相色谱法的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80% 则需用高效液相色谱来分析
5、。HPLC因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析，世界各国己将该法收载于药典。p高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到 的阻力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达150-350 105Pa。p高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱法高得多，一般可达1-10mL/min。p高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。p高灵敏度：采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11 g 。高效液相色谱法特点HPLC主要知名品牌
6、主要知名品牌 沃特斯（Waters 安捷伦（Agilent） 岛津（Shimazu） 其它：戴安、菲尼根、热电等。HPLCHPLC的特点的特点GC与与LC的比较的比较测定对象拓展检测器不同高效液相色谱仪高效液相色谱仪p 液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。p液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入,流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数
7、或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器5，检测到的信号送至数据系统6记录、处理或保存。一、高效液相色谱仪流程一、高效液相色谱仪流程馏分收集器馏分收集器高压输液系统高压输液系统梯度洗脱装置梯度洗脱装置辅辅助助系系统统流动相输流动相输送系统送系统进进样样系系统统分分离离系系统统检检测测系系统统储液器储液器高压泵高压泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器数据处理系统数据处理系统数据处数据处理系统理系统HPLC的基本结构分离部分分离部分分析部分分析部分控制部分控制部分岛津LC-20A见HPLC结构外观Waters 机型Waters 机型Thermo f
8、isher液相色谱质谱联用液相色谱质谱联用大连依利特大连依利特北京北分北京北分上海伍丰上海伍丰江苏天瑞江苏天瑞LCFL2200浙江福立北京东西分析北京东西分析莱伯泰科HPLCHPLC结构的几种形式结构的几种形式 串联式二元高压泵系统 并联式二元高压泵系统 四流路串联式单高压泵系统串联式二元高压泵HPLC结构示意图分离部分 分离部分由高压输液泵、色谱柱及相关组件组成。 由高压输液泵吸取流动相，使之进入色谱柱，由进样器注入样品后，由色谱柱进行分离。 在高压输液泵之前常用脱气机。 在色谱柱部分要装柱温箱保持色谱柱的温度恒定。高压输液泵高压输液泵目前HPLC配备高压输液泵大致有两种类型： 一种是两个高
9、压输液泵，各自输送流动相后进入混合器。俗称“二元高压泵”。 另一种是只有一个高压输液泵，在这个输液泵之前配备一个电磁阀控制流路，通常这种形式的泵有四个流路。俗称“四元低压泵”。但其实质上仍是单泵。 有一台安捷伦HPLC和天美HPLC ，均为四元低压的单泵。梯度洗脱梯度洗脱2p 低压梯度低压梯度： 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。p因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合
10、后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。高压输液泵（外观）高压输液泵（外观）高压输液泵（内部）高压输液泵（内部）排空阀高压输液泵高压泵（一个，串联式）装电磁阀的部位泵传动的带齿皮带俯视图（内部）高压输液泵原理单向阀实物单向阀实物为何有两个泵头，却只能算是一个泵？在同一个轴上有两个相位相差180度的偏心轮，当其中一个吸液时，另一个排液。交替进行。这样就减少了输液的脉动。排空阀（Purge阀）起什么作用？Purge阀阀 Purge阀主要用于两个方面： 1 刚开机时，要打开Purge阀(逆时针方向拧180度)，启动高压输液泵冲洗约5min，排掉一段流动相以去除管腔中的气泡 2更换不同的
11、流动相时，要将前面一段流动相排尽。 开启Purge阀时，一般用较高的流速（5ml/min）来冲洗管腔。混合器混合器混合器混合器的作用混合器的作用 混合器主要是用来混匀流动相的。 流动相不均匀对检测影响很大。 混合器通常是通过一些U形管来使流动相混匀，即“蛇形管”模式。也有的是采用一些过滤介质来实现的。由于在混合过程中没有动力装置，故称为“静态混合”。 此外，好的混合器可使仪器系统压力比较恒定。岛津岛津20AT型型HPLC输液泵脱气机手动进样器柱温箱差示折光检测器紫外检测器混合器脱气机脱气机脱气脱气p脱气原因 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐
12、的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。p方法 超声波振荡脱气 惰性气体鼓泡吹扫脱气 真空脱气装置脱气机内部构造岛津仪器将柱温箱和手动进样器设计为一体。这一设计的最大弊端是维护手动进样器十分不便！ 手动进样阀原理手动进样阀实图进样前，进样，进样后3个过程示意图柱温箱柱温箱 柱温箱是保障色谱柱在恒定的温度下工作的前提条件，也是HPLC结果重现性的保障 没有柱温箱是很难进行定性定量分析的因
13、为温度可影响物质的保留时间，峰形等参数 除制备型HPLC以外，一般分析型HPLC都要有柱温箱国产柱温箱国产柱温箱安捷伦自带的卧式柱温箱安捷伦自带的卧式柱温箱色谱柱色谱柱 色谱柱可分为正相色谱柱、反相色谱柱、特殊专用柱（手性色谱柱、离子色谱柱、 氨基酸分析柱、糖类分析柱等） 操作仪器前一定要认清是什么型号、什么材质的色谱柱！否则，乱用流动相，一次就可导致色谱柱报废！如：环糊精为填料的手性色谱柱，如果流动相含有水，即可溶解，一次性报废！反相色谱柱反相色谱柱 目前最常用的为反相色谱柱。 反相色谱柱一般是以硅胶颗料上键合C18、C8而成。常用的为C18。 C18反相色谱柱适合分离很多物质，且色谱柱较为
14、耐用。C18注意事项注意事项 但流动相PH值一定要保证在28之间。低于或高于，色谱柱即遭破坏。 反相色谱柱一定不能用纯水作流动相，否则键合的C18坍塌，报废！ 流动相中水的比例最大为流动相中水的比例最大为90%。液相色谱柱液相色谱柱 色谱柱不能震动、跌落！ 色谱柱不用时，从仪器上取下后要用适当色谱柱不用时，从仪器上取下后要用适当的溶剂保存，并在两端拧上堵头！的溶剂保存，并在两端拧上堵头！红红色色部部分分即即为为堵堵头头如何认识不同型号仪器的构造？如何认识不同型号仪器的构造？ 无论何种HPLC，其结构总离不开高压输液泵、进样器、柱温箱、检测器几个部分。 搞清仪器不同部分的作用是做好实验和维护仪器
15、的前提！共用一个机箱的串联式二元高压输液泵共用一个机箱的串联式二元高压输液泵 （典型代表是安捷伦）（典型代表是安捷伦）安捷伦安捷伦1200内部构造内部构造二元高压输液泵的HPLC（Agilent）并联式二元高压输液泵 这种形式的输液泵制造工艺要求比串联泵这种形式的输液泵制造工艺要求比串联泵更高。更高。 Waters公司是以做并联泵为主要产品的。公司是以做并联泵为主要产品的。 岛津近期也推出了并联泵产品，如：岛津近期也推出了并联泵产品，如：LC-20AD 国产国产HPLC中只有极少数厂家生产：如：上中只有极少数厂家生产：如：上海伍丰、江苏天瑞等。海伍丰、江苏天瑞等。二元高压并联泵HPLC结构示意
16、图贮液瓶高压输液泵脱气机检测器色谱柱柱温箱混合器进样器电 脑废液瓶并联泵结构的高效液相并联泵结构的高效液相四流路单高压输液泵的四流路单高压输液泵的HPLC（典型代表为安捷伦）（典型代表为安捷伦）二元高压并联泵HPLC结构示意图贮液瓶高压输液泵电磁阀检测器色谱柱柱温箱混合器进样器电 脑废液瓶脱气机安捷伦安捷伦1100整体结构整体结构安捷伦安捷伦1100内部构造内部构造四元低压单泵的HPLC（Agilent）高压输液泵 电磁阀（含四个流路）分析部分 分析部分主要就是由检测器组成。 常用的检测器有紫外检测器、差示折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器等。 紫外检测器最为常用。它又可分为可变波长检测
17、器（VWD）和二极管阵列检测器（PDA）。紫外检测器（外观）紫外检测器（内部）流通池紫外可见波长检测器示意图紫外可见波长检测器获得的色谱图光电二极管阵列（光电二极管阵列（DAD）检测器）检测器 DAD检测器仍然属于紫外检测器。 与普通紫外可见波长检测器不同的是，它的二极管有512个，可同时采集不同波长下的紫外吸收信号。 普通紫外可见波长检测器是先分光，再通过流通池。DAD是混合光先通过流通池，再分光。光电二极管阵列检测器（DAD）DAD检测器检测器DAD检测器可作三维色谱图DAD检测器与普通紫外检测器的对比检测器与普通紫外检测器的对比 DAD检测器能在检测色谱峰的同时获得光谱，便于定性。 普通
18、紫外是先分光，再通过流通池，因为是单束光，所以灵敏度高。 DAD检测器是先通过流通池，再分光，因为是混合光，所以灵敏度低。一般比普通紫外灵敏底低一个数量级！差示折光检测器差示折光检测器控制部分 控制部分主要就是工作站。工作站由硬件和软件两部分组成。 硬件一般是一块可双向传输数据的板卡，安装于电脑主机上。 软件则是与相应机型配套的程序。 有一些软件还要一个“加密狗”，外形类似于U盘。没有“加密狗”，软件就不能运行。HPLC操作注意事项操作注意事项 使用HPLC之前必须熟悉相关基础知识。包括仪器构造、流动相的选择、色谱柱的保养等。 必须经过培训方可独立操作做做HPLC的的“四项基本原则四项基本原则
19、” 流动相和样品必须微孔滤膜过滤！ 开机初始一定要排除流动相气泡！ 检测前一定要平衡仪器！ 测完样品一定要冲洗色谱柱！坚持这四项基本原则，液相一般不会出现重大问题流动相的选择流动相的选择 不同的液相流动相不同。主要是根据色谱柱和检测器来选择。千万不要认为所有液相的流动相是通用的！ 以常用的紫外检测器反相高效液相色谱为例，常用的流动相为甲醇、乙腈及水或缓冲盐。 思考：为何选择甲醇、乙腈为流动相？思考：为何选择甲醇、乙腈为流动相？流动相用缓冲盐注意事项流动相用缓冲盐注意事项 缓冲盐易于在柱塞杆上析出，对柱塞杆及柱塞杆密封圈磨损极大，如果没有及时清洗，会导到高压输液泵漏液！ 除非万不得已，尽量不用缓
20、冲盐。除非万不得已，尽量不用缓冲盐。 如果要用缓冲盐，尽量如果要用缓冲盐，尽量用挥发性缓冲盐用挥发性缓冲盐（如：醋酸醋酸铵）（如：醋酸醋酸铵），不要用非挥发性，不要用非挥发性缓冲盐（如：缓冲盐（如：磷酸缓冲盐磷酸缓冲盐）。）。 人造宝石材质柱塞杆密封圈（俗称柱塞杆密封圈（俗称“黑草帽黑草帽”）流动相的过滤流动相的过滤 流动相必须用0.22um的微孔滤膜过滤 微孔滤膜有两种，一种为有机相使用的，微孔滤膜有两种，一种为有机相使用的，另一种为水相使用的，不可混用！另一种为水相使用的，不可混用！ 有机相的膜一般为尼龙膜，水相的膜一般为混合醋酸纤维素酯膜。 用于流动相过滤的滤膜直径为50mm。流动相过滤
21、装置样品的过滤样品的过滤 样品必须用0.22um的微孔滤膜过滤 微孔滤膜有两种，一种为有机相使用的，另一种为水相使用的，不可混用。 有机相的膜一般为聚偏氟乙烯膜，水相的膜一般为混合醋酸纤维素酯膜。 用于流动相过滤的滤膜通常直径为13mm。 为减少交叉污染，样品常用一次性过滤头过滤。用一次性过滤头过滤样品测样前的准备测样前的准备 开启仪器。将逆时针将Purge阀旋转180度。启动高压输液泵，以5ml/min的流速冲洗35min以除去管路中的气泡。 打开紫外检测器，监测基线，至少使之平衡半小时。 切换至所需的色谱条件直到基线平稳之后再进样。 一定要采用进口的进样针！ 具体操作再进行详细培训。测样后冲洗色谱柱测样后冲洗色谱柱 每天测完样品后必须冲洗色谱柱！ 常用的反相色谱柱的冲洗方法为：以甲醇（或乙腈）：水10：90冲洗色谱柱约20min，再过滤至纯甲醇（或乙腈）冲洗至少30min。直至基线平稳后至少15min. 如果使用缓冲盐为流动相的组份之一，应在检测时即开启在线清洗柱塞杆的功能。冲洗色谱柱时应以甲醇（或乙腈）：水10：90先冲洗30min至1h之后再过渡至纯甲醇（或乙腈）冲柱。维护注意事项维护注意事项 在检测时要注意仪器是否有异常声响？ 监测柱压、柱温、流速的变化。 如有异常，应采取相应措施。如：停机。 故障情况应及时向主管老师报告。谢谢 谢谢
