1、第一节第一节 薄层色谱概论薄层色谱概论 第二节第二节 制备薄层色谱制备薄层色谱 第三节第三节 离心薄层色谱离心薄层色谱第四节第四节 制备型加压薄层色谱制备型加压薄层色谱 l薄层色谱薄层色谱l(Thin-Layer Chromatography TLC)l是快速分离、定性和定量分析的一种非常重要的色谱技术。l它是将固定相涂布于玻璃，铝铂，塑料片等载板上形成一均一薄层。将被分离的物质点加在薄层的一端，置展开室中，选用适当的展开剂，借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一端，使性质不同的物质得以分离。l分离原理随所用固定相不同而不同，可分为: l(l) 吸附薄层色谱 采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，利
2、用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的目的。l(2) 分配薄层色谱 由硅胶、聚酰胺和纤维素铺成薄层，不同组分在指定的两相中有不同的分配系数。l(3) 离子交换薄层色谱 由含有交换活性基团的纤维素铺成薄层。l(4) 分子排阻薄层色谱 也称凝胶薄层。利用样品中分子大小不同、受阻情况不同加以分离。 l(5) 亲和薄层色谱 利用酶、受体、抗原抗体特异性识别作用。 l1. 比移值比移值: 一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的比移值（比移值（Rf 值）。值）。是薄层色谱的基本定性参数。l l由于影响被分离物质在薄层上移动距离的因素较多，因此R f值的重现性较差，如果
3、将被分离物质与一参比物点在 同一块薄层上，用相同的色谱条件进行分离。相对比移值就是被分离物质(s)和参比物(i)的Rf值之比，或是被分离物质(s)和参比物（i) 在薄层上移动距离之比.l由于参比物的Rf值或移动距离可大于或小于被分离物质的Rf值或移动距离，因此相对比移值可大于或小于 l，但其重复性及可比性均优于R f值。相对比移植以下式表示：lTLC不仅适合于小量样品的制备，也可用于较大量样品的纯化。如果将薄层加宽加厚，把样品点成一条线，能分离几百毫克样品。尤其是对于Rf值相近的物质的分离。lTLC除了用于分离外，更主要的是通过与已知结构化合物相比较，来鉴定少量有机混合物的组成。此外, 经常利
4、用 TLC寻找柱色谱的最佳分离条件。 常用的两种制备型薄层色谱包括：l传统的制备薄层法（PTLC），即流动相借毛细作用流经固定相。l借外力强制性的使流动相流经固定相，如离心薄层和加压薄层。 l一、固定相及载体一、固定相及载体l二，粘合剂与添加剂二，粘合剂与添加剂l三、薄层板的制备三、薄层板的制备l四，上样四，上样l五、展开剂选择五、展开剂选择l六、薄层展开六、薄层展开l七、检测方法七、检测方法l八、被分离物质的收集八、被分离物质的收集l九、九、PTLC分离化合物的纯化分离化合物的纯化l 经典的制备型薄层色谱，设备简单，经典的制备型薄层色谱，设备简单，操作方便。操作方便。薄层色谱与常压柱分离配薄
5、层色谱与常压柱分离配合使用合使用，仍然在实验室中有较多的应，仍然在实验室中有较多的应用。尤其是在一些没有现代分离手段用。尤其是在一些没有现代分离手段的实验室中广为使用。的实验室中广为使用。 l一、固定相及载体一、固定相及载体l1固定相：固定相：薄层色谱必须将被分离物质点于固定相上进行分离，固定相要根据被分离化合物的性质来选择。l分离亲脂性化合物常常选用硅胶，氧化铝，乙酰纤维素及聚酰胺。l分离亲水性化合物常常选用纤维素，硅藻土及聚酰胺。 但也有例外，脂溶性叶绿素在氧化铝及纤维素上均能得到较好的分离。l2载体：玻璃板，铝箔，塑料片等（吸附薄层）； 纤维素，硅藻土（分配薄层）l（1）硅胶）硅胶：是最
6、常用的薄层固定相，90以上分离工作都应用之。l） 普通型硅胶普通型硅胶：无定型多孔粉末，表面带有硅醇基，呈弱酸性。因为有一羟基(silanol Si-OH)，呈弱酸性（PH = 4.5）,通过硅原子上的羟基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键， 所以表现为吸附性能。硅胶吸附水分形成水合硅醇基，降低吸附能力。通常在150活化后失水提高活度，此时约有46个硅醇基/nm2,。（温度大于500，硅胶脱水形成硅醚（SiO-Si）,而失去吸附能力）。l 活性硅胶适合分离酸性或中性化合物，如酚类，醛类，生物碱类，甾体及氨基酸类，是基于吸附作用；l 非活性硅胶含有一定量的水分，在分离色素等时，是基于分配作用。
7、l ） 改性硅胶改性硅胶：借化学反应，将有机分子键合在硅羟基上，故称化学键合固定相。可分为极性键合相和非极性键合相。l 极性键合硅胶：含极性基团（如氰基，氨基，二醇基），与普通硅胶相比活性低。一般作正相色谱，用非极性或极性溶剂为展开剂l 非极性键合硅胶：键合相表面为极性极小的烃基如18烷基，乙基，辛基等。最常用的是18烷基键合硅胶。用极性较大溶剂为展开剂或无机溶剂为展开剂。因为Rf与正相色谱相反，故称反相薄层色谱法。 l3)硅胶的粒度与孔径硅胶的粒度与孔径： l硅胶的分离效率与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。l原则上，粒度越小，分离效果越好。l孔径（）或孔体积表示硅胶粒子孔的大小的尺度，与
8、传递阻滞有关；l表面积越大，表明其吸附力越大，有较强的保留。 l4）硅胶薄层板的厚度）硅胶薄层板的厚度l 普通薄层厚度为250m, l 高效薄层板为200m，l 制备薄层板厚度0.5-2mml5）市售硅胶及预制板规格）市售硅胶及预制板规格（符号及含义）（符号及含义）l 硅胶G: 是含有13煅石膏（gypsum）黏合剂的硅胶l 硅胶H：不含黏合剂的硅胶l 硅胶HF254：不含黏合剂，含有一种无机荧光剂（如锰激活的硅酸锌），在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光l 硅胶GF254：含有煅石膏黏合剂，含荧光剂，在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光l硅胶HF254+366：不含粘合剂，在254与
9、366nm波长有荧光l硅胶PF254：制备型的，在254nm有荧光（有荧光剂，适用于不发光不易显色物质的制备与分离） l2氧化铝氧化铝：在薄层中其应用仅次于硅胶。由氢氧化铝400500煅烧而成。广泛的用于萜类，生物碱，脂肪类，芳香类化合物的分离。因制法和处理方法不同可分为碱性，酸性，中性三类l 碱性氧化铝：PH 910适于中性、碱性化合物的分离l 酸性氧化铝：PH 45适于酸性化合物的分离l 中性氧化铝：PH 77.5适于酸性或对碱不稳定的化合物的分离l 氧化铝因其含水量活性可分为五级。制备型薄层用氧化铝选用23级市售氧化铝市售氧化铝：含10G ，PH 7.58；不带粘合剂的氧化铝 PH=9,
10、也可加入波长254nm的荧光指示剂。 l3纤维素纤维素 l 与纸层析相似，按分配的原理 。纤维素分子是由大量纤维二糖通过糖苷键连接的，由于有许多的OH基，所以具有亲水性。一分子水与与纤维素的两个羟基结合，形成“纤维素H2O”络合物。这种固定相可以视为一种多糖浓溶液，即使使用与水相混溶的溶剂时，仍然形成类似不相混溶的两相。l 层析用纤维素分：l 普通纤维素l 乙酰化纤维素l 离子交换纤维素l4聚酰胺聚酰胺：l 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物，薄层色谱中常用的是聚己内酰胺。聚酰胺分子内有许多酰胺基，酰胺基中的碳基与酚类、黄酮类、酸类中的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与酮类或硝基化合物形成
11、氢键，同时由于所分离混合物结构不同，含羟基等活性基团的数目和位置不同，因而形成氢键的能力不同，所以对这些化合物的吸附能力不同而得到分离。l 5葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 分子筛的原理 l (1)亲水性葡聚糖凝胶l葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷，dextran)悬浮于有机相中，加入交联剂使葡聚糖交联聚合而成其商品名为Sephadex，加入交联剂量不同可制成不同交联度的凝胶 l交联度越大，网状结构越紧密，吸水时膨胀体积越小 l用于薄层色谱的凝胶粒度要细，小于40um,交联度要低，G50以下 l(2)亲酯性萄聚糖凝胶l 萄聚糖凝胶只能用于水溶性物质的分离鉴定。但在葡聚糖分子上引入有机基团，则可
12、使之成为亲脂性葡聚糖凝胶，如在G25凝胶上引入羟丙基基团，与糖分子以醚键相连，使之成为既有亲水性又有亲脂性的LH20葡聚糖凝胶，适用于有机物如黄酮、蒽醌、色素等成分的分离。 l6.离子交换剂离子交换剂 l 葡聚糖凝胶离子交换剂l 在 G25或G50葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基、磺丙基、二乙基氨乙基及季铵乙基等而制成的既具凝胶的优点又具离子交换性质的载体，在生化及天然化合物方面得到广泛应用。l7硅藻土硅藻土l 硅藻土商品名 celite，是高度多孔的，比表面积大的固体，本身具极弱的吸附力，常作为分配色谱用的载体；或以一定比例加入硅胶等吸附剂中可以降低硅胶的吸附力，而有利于某些化合物的分离。l
13、为使薄层牢固地附着于支持体上需加合适的粘合剂;l为特殊的分离检出有时要在固定相中加入某些添加剂. 理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强，且具有化学惰性 l1，煅石膏，煅石膏 l 将石膏（CaSO4.2H2O） 在120140 烤24小时，过200目筛，备用。用煅石膏作粘合剂的优点是能使用腐蚀性的显色剂；但其缺点为薄层的硬度不够，且不利于无机物的分离。l2，羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素钠 CMC-Na l 先将羧甲基纤维素钠调成糊状，再加足量水搅拌均匀，并加热煮沸使尽可能溶解，放置澄清后，取上清液代替水与吸附剂搅匀涂布薄层。l 常用的浓度为0.2-10，浓度越高, 薄层硬度越大，是常用的粘合剂，但
14、其缺点为不能耐受有腐蚀性的显色剂。 l3，淀粉，淀粉 l将淀粉配成将淀粉配成5%的溶液的溶液,在在85加热至有粘加热至有粘性性,加入适量吸附剂制成薄层加入适量吸附剂制成薄层. 缺点为不能耐受有腐蚀性的显色剂。l4，预制板粘合剂，预制板粘合剂l 上述三种粘合剂均于实验室自制TLC时使用l 商品市售预制板粘合剂有：聚乙烯醇，聚丙烯醇，聚丙烯酰胺。l 5. 添加剂添加剂 荧光剂; 酸、碱或PH缓冲液等。l三、薄层板的制备三、薄层板的制备l 当前国外商品化的各种预制板均有市售，可满足各种需要。（除个别特殊需要人工制板外）l 预制板使用方便,涂布均匀,薄层光滑及有很好的牢度.预制板有玻璃板、塑料板或铝箔
15、板，后两种还有剪裁方便之优点。l 国外市售预制板较多，包括普通薄层预制板（硅胶、氧化铝、纤维素、硅藻土、聚酰胺、离子交换纤维素、键合硅胶反相板）；高效薄层预制板（、键合硅胶预制板、手性预制板）等，规格众多，尺寸不同，分离效果及重现性均较手工制板好。l 国内预制板规格类型较少，进口又贵，所以主要靠自己手工制作。l1，载板的制备，载板的制备：l常用载板主要为玻璃板，塑料板，金属铝箔等较少应用 l载板必须是表面光滑，平整清洁 玻板大小视实验所需而定。一般分析用： 35cm； 420cm； 1010cm,制备用 ：2020cm， 2040cml2，薄板涂铺方法，薄板涂铺方法l（1）干法铺板）干法铺板
16、l 将吸附剂直接倒在板上一端，取一适当玻棒两端包裹上适当厚度的橡皮膏或塑料管，视薄层厚度要求而定。l用力移动玻璃管，（用力不可过猛或太快，也不能中途停止，以免薄层厚薄不均）如此制成的薄板称为软板。l由于该板易吹散，现已比较少用，多用硬板。l（2）湿法铺板）湿法铺板：l一般都要加黏合剂，故称粘合薄层板（硬板）。常用两种硬板为：硅胶+G、硅胶+CMC-Nal硅胶G板铺制。G的含量为1013，制板时每份硅胶G+水23份，研成糊状，倒在板上铺布。l硅胶CMC-Na板铺制: 硅胶H或硅胶G + CMC-Na水溶液（0.5）（1：3），研成糊状，倒入板上铺布。l0.5CMC-Na配制：l 取适量CMC-N
17、a + 蒸馏水加热煮沸，完全融解，放冷静置。铺板时取其上清液使用。 l 铺板时为了防止由于搅拌而带入气泡，常常加入少量乙醇或丙酮或将吸附剂糊首先置于真空干燥器中减压脱气，以免薄层表面出现气泡，影响分离效果。l 其他一些加黏合剂铺层的处理方法见有关参考书。l 倾注法：取适量调好的吸附剂糊，倒在干净的薄板上用玻棒涂成一均匀薄层，再稍加震动，使薄层平整均匀。置水平台上晾干，严防灰尘沾污。再置烘箱中110活化一小时，置干燥器中备用。l本法均匀度较差，一致性差，适于小板的制备.l 平铺法：在水平的较大玻璃上放上要铺的薄板。薄板两边加上做好的框边，倒上吸附剂糊，用一玻璃板或玻棒向一个方向均匀的将吸附剂刮平
18、，然后轻轻震动均匀，置于平台上晾干，活化备用。l适于大板的制备。l（3）机械涂铺法：手动涂布器，自动涂布器。由于手动推进速度不同，使厚度不均匀。铺板机国产进口皆有，可调节制成厚度不同的薄层，供分析与制备用。刮板厚度分别为： l0.3, 0.4, 0.5 和 0.6mm (固定相干燥缩水后的相应的薄层厚度为: 0.15, 0.2, 0.25 和 0.3mm) 一般用于分析的薄层厚度为0.250.5mm,用于制备的薄层厚度为0.52mm。l注意：l 吸附剂在手工调制时，研磨的方向顺一个方向，否则凝固不均匀。l 涂布速度要快，避免固定相过度凝固，使涂布困难l 涂布时速度保持一致l 涂布后的薄层应水平
19、放置，室温晾干备用，避免因通风导致产生裂纹，避免灰尘沾污。l 活化时一般硅胶板105110,0.5-1小时。有些薄层板不必活化，晾干即可用，如聚酰胺板。l上样是制备薄层分离的最关键步骤之一。l1. 溶解溶解：上样前，先将样品溶于少量溶剂中，低挥发性的溶剂可引起点样带扩散变宽。因此最好选择挥发性溶剂（二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，醇），l避免用水，DMF,DMSO等不易挥发易扩散的溶剂。l样品浓度应在510左右，定性0.011范围。浓度过高易造成超载，出现拖尾或重叠，影响分辨率和分离度。 l2. 方法方法： 手工点样：毛细管（分析），滴管或注射器。l定性点样： 一般点状点样，要求圆而小、点样时,点样
20、斑点直径最大不得超过5mm，一般以23mm较为合适；高效板斑点直径约为12mm. 若需重复点样,应待上次点样的溶剂挥发后,在重复点样。以防点样点过大,造成拖尾、扩散等现象。影响分离效果。l制备点样：一般带状（线状）点样，要求窄又细,以获得较好的分离效果。点样后必须将溶剂吹干再进行展开，但要避免高温加热，使成分分解。l对于制备薄层，若点样带较宽，可先用较大极性溶剂，将薄层板展开到点样带上端2cm处，以起到浓集作用。然后将薄板干燥后，再用展开剂展开 l 自动点样仪：l 点样不触及薄层，用氮气吹干。 l3. 位置位置: 经典薄层起始线距底边约1-1.5cm,高效板1 cm，展距前者为1015 cm，
21、后者为57 cm；点间距经典薄层12 cm，高效板0.5 cm,l4. 上样量上样量: l1.0mm厚的硅胶板或氧化铝板最多可上样5mg/cm,对2020cm板可最高分离10100mg样品。l如果吸附剂的厚度加倍，可多上样。切勿超载，出现拖尾或重叠，影响分辨率和分离度。lPTLC所用展开剂的条件由分析型TLC预试来确定。由于两者所用吸附剂的颗粒大小相同，所以分析型TLC展开剂可直接用于PTLC.l薄层色谱条件是依据被分离组分的性质（溶解度，酸碱性，极性）吸附剂（活性）以及展开剂极性三个因素决定的。l在上述三个因素中，被分离物质是固定的，吸附剂常用的种类也不多，而展开剂种类则是千变万化。不仅可以
22、应用不同极性的单一溶剂作为展开剂，更多的是应用不同极性的混合溶剂。所以对于特定物质的分离，展开剂对分离起决定作用。 l1. 溶剂强度溶剂强度：是指单一溶剂或混和溶剂洗脱某种溶质的能力.在正相色谱中，它随极性增大而增大。l极性小的溶剂，对极性小的组分溶解强，在TLC中能较快的向前迁移，与极性大的组分分离。极性小组分的Rf比极性大组分的大。l极性大的溶剂，对极性大的组分溶解强，较快向前迁移，而与极性小的组分分离。极性大组分的Rf比极性小组分的大。 l常见溶剂极性顺序常见溶剂极性顺序l石油醚（petro） 环己烷 (Cyclohex) 正己烷 (Hex) 二硫化碳（CS2） 四氯化碳(CCl4)三氯
23、乙烷(CH3CCl3) 苯（Ph） 甲苯（Toluene） 二氯甲烷(CH2Cl2) 氯仿(CHCl3) 乙醚 (Et2O) 乙酸乙酯 (EtOAc) 丙酮(Acetone) 正丙醇 乙醇 (EtOH) 甲醇(MeOH) 吡啶(Py) 羧酸(R-COOH) 水l 在实际操作中，一般按极性顺序选单一溶剂展开，看其Rf及分离效果，另加入第二种、第三种溶剂来调节之。l Rf最佳范围为0.20.5，可使用范围为0.20.8。l对极性化合物，如果Rf太小，可加极性较大溶剂；如果太大，可加非极性溶剂。l当样品中含有碳基时，在非极性溶剂中加入少量丙酮；当样品中含有羟基时，于非极性溶剂中加入少量甲醇、乙醇等；
24、当含有羧基酸性样品时，可加入少量的甲酸、乙酸；当含有氨基的碱性样品时，可加入少量六氢吡啶、二乙胺、氨水等，可改善拖尾的出现，提高碱性或酸性化合物的分离效果。总之，加入的溶剂应与被测物的官能团相似。l 下列是几种常用的两相溶剂系统（不同比例）l正己烷：乙酸乙酯 环己烷：乙酸乙酯l正己烷：丙酮 石油醚：乙酸乙酯l氯仿：甲醇 丙酮：甲醇l石油醚：苯（甲苯） l正己烷：苯（甲苯） l聚酰胺薄层溶剂洗脱顺序聚酰胺薄层溶剂洗脱顺序 ：l聚酰胺薄层单一溶剂洗脱能力的顺序聚酰胺薄层单一溶剂洗脱能力的顺序:l在聚酰胺薄层上的分离是由于氢键的形成能力，这决定于化合物本身及展开剂的极性，在水中形成氢键的能力最强，在
25、有机溶剂中形成氢键能力较弱，在碱性溶液中形成氢键能力最弱，因此在聚酸胺薄层上单一溶剂洗脱能力的顺序是：l水乙醇甲醇丙酮稀氢氧化铵（钠）溶液甲酸胺二甲基甲酸胺 l常用的多元展开剂有常用的多元展开剂有：l水一乙醇（50:50）、水一甲醇（50:50）、l水一丁酮一甲醇（40:30:20）、l水一乙醇一丁酮一乙酰丙酮(15:15:15:5）、l水一乙醇一乙酸一二甲基甲酰胺（30:20:10:5）、l苯一甲醇一丁酮（60:20:20）等l2.选择展开剂的方法选择展开剂的方法 l 三角形法三角形法 l 点滴实验法点滴实验法 l Camag Vario-Ks展开室法展开室法 l 三角形法三角形法。按照展开
26、剂，固定相及被分离物质三者间相互影响,设计了三因素综合帮助选择展开剂的极性和固定相的活度。l图（a）适于吸附薄层;图(b) 适于分配薄层. l 点滴实验法点滴实验法 l本法非常简单,也很实用.将要被分离的化合物溶液间隔的点于薄层板上,待溶剂挥发干后,用不同的展开剂通过毛细管点到各样品点上,借毛细管作用,展开剂从圆心向外扩展,这样就出现了不同圆心的色谱,经过比较就可以发现最合适的展开剂及吸附剂.l下图是证明苯是最合适的展开剂.l Camag Vario-Ks展开室法展开室法 lCamag Vario-Ks展开室至少有5个溶剂室,可以在同一薄层板上同时筛选至少5种展开剂.l用此装置可以很快找到最合
27、适的展开剂及最佳展开条件。 l薄层展开要在密闭的器皿中进行，如广口瓶或其它带有盖子的玻璃瓶都可作为展开器。l加入展开剂的高度为0.5-1.0cm。l1.预饱和预饱和：l可在展开器中放一张滤纸，以使器皿内的蒸气很快地达到气液平衡，待滤纸被展开剂饱和以后，把点有样点的板(样点一端向下)放入展开器内。l也可使用薄层双槽展开室，加入展开剂于其中一槽，把点有样品的板放入无展开剂的另一槽内。l若使用平底展开室，可将展开室一端垫高，将薄板置于展开室垫高一端， 盖好盖子，使薄板饱和之。时间自行掌握，半小时左右。 l2.展开展开：视薄层形状而定l硬板常用上行展开，环形展开，双向张开，下行展开，多次展开l软板常用
28、近水平展开l采用多次展开的方法可以提高TLC的分离效果。l在一次展开结束后，先将薄板干燥，再放入容器中展开。l多次展开可分为单向多次展开（同一种展开剂，以增加展开距离）与梯度展开（不同种展开剂，以增加分离度）。 l上行展开实验室中应用较多l展开时薄层板并与器皿成一定的角度，同时使展开剂的水平线应在样点以下，盖上盖子。l当展开剂上升到离板的顶部约 lcm处时取出，并立即用铅笔标出展开剂的前沿位置，待展开剂干燥后，观察斑点的位置。 l1光学检测光学检测l2.蒸汽检出蒸汽检出 l3.显色法显色法l4加入参照物法加入参照物法 l1光学检测光学检测 l可见光：一些化合物如染料，蒽醌等对可见光有吸收，因此
29、在自然光下呈现不同颜色的斑点。lUV法：多数化合物在可见光下不能显色，但可吸收 UV光，在紫外灯下显示出不同颜色的斑点。l荧光法：些化合物吸收 UV光后，激发出荧光，在色谱上呈现不同颜色的荧光斑点。l荧光萃灭法：无UV可见光和荧光者，可将样品点于含有无机荧光剂的薄层板上，展开后挥去溶剂，置UV灯下观察，被分离的化合物在有色的荧光的背景下，呈现暗的斑点。l如GF254与HF254板在黄绿荧光背景下出现黑斑。这是由于这些化合物减弱了吸附剂中荧光物质的UV吸收，引起了荧光萃灭。l也可以将荧光素喷于无荧光剂的薄层板上，获得与荧光板相同的效果。 l2. 蒸汽检出蒸汽检出。利用一些物质的蒸气与样品作用，产
30、生不同颜色或产生荧光。lI2熏色是实验室常用方法，展开后的薄层板挥去溶剂，放在盛有I2结晶的密闭容器中，大多数化合物吸附I2蒸气后，呈现不同程度的黄褐色色斑。标出斑点位置，借此检出所分离的化合物位置。l当薄层离开I2蒸气后，黄褐色色斑逐渐消退。这是可逆反应，不影响产物性质。l若不退色，为不可逆反应，只可用于定性，对化合物制备不可取。 l3.显色法显色法：若化合物对UV可见和荧光均不能显示斑点，可加入显色剂显色。常用喷撒法、浸渍法，展层显色法等。显色法主要用于定性分析定位，制备型较少应用。l显色剂分两大类：一类为检查一般有机化合物的通用试剂；另一类为根据化合物或特殊官能团设计的专属性显色剂。种类
31、繁多。l实验室经常备用两种显色剂l高锰酸钾溶液（高锰酸钾9克+氢氧化钠0.75克+碳酸氢钠60克+水900毫升）l氧化性试剂l茴香醛溶液（674毫升乙醇+18.5毫升茴香醛+25毫升浓硫酸）l还原性试剂 l4加入参照物法加入参照物法l对于PTLC法，若对UV可见和荧光均不能显示斑点，因不能碘薰色、不能加显色剂等，可利用参照物的Rf值，确定被分离化合物的位置。 l 化合物的检出除用于鉴定、分离外，可用于监测有机反应进行的的情况，以寻找化学反应的最佳反应时间和达到最高反应的收率。l八、被分离物质的收集八、被分离物质的收集l在确定色带位置后，可用刮刀或用与真空收集器相连的管状刮离器，将色带吸附剂从板
32、上刮下。l后一种方法对易氧化的物质持续与空气接触，慎用。 l将回收的吸附剂以极性较低的溶剂，使化合物从中提取出来（1克吸附剂约用5毫升溶剂）.l注意:化合物与吸附剂接触时间越长，被破坏可能性也越大。可先用4型沙芯漏斗过滤洗脱液，然后用滤模（0.2-0.45um）过滤。l甲醇可溶解硅胶及其中一些物质，所以不适用于作展开剂及从硅胶上洗脱被分离的化合物。常用溶剂：丙酮，乙醇，氯仿等.l lPTLC过程中，因吸附剂中含有黏合剂及荧光指示剂，在溶剂提取过程中，吸附剂中杂质易被提取，洗脱液极性越大，提取的可能杂质越多。这些杂质往往无UV吸收，TLC检测难以发现其存在。因此溶液蒸去后，往往要经重结晶处理或相
33、应的手段进行再纯化，方可通过含量测定及光谱分析要求。 l离心液相薄层是制备薄层的一种改进。因为经典的制备型PTLC存在着许多缺陷，如展开过程太长；需要将被分开的化合物从薄层上刮下，提取出来。提取过程易引入吸附剂杂质及残留物等。为克服这些缺点，人们发明了离心薄层色谱。 l一、离心薄层色谱的技术原理一、离心薄层色谱的技术原理l二、旋转薄层色谱仪二、旋转薄层色谱仪l三、应用实例三、应用实例l 是一种强制性流动相移动方法。主要是在经典的PTLC基础上，即样品在固定相和流动相间的吸附，分配作用的不同，再加上离心力的作用，使流动相加速流动，使样品各组分之间原有的Rf差异加大，从而提高了分离效果，加快了分离
34、速度。 由于CLC仪器简单，操作简便，分离效果好等优点，而广泛用于合成和天然产物的制备分离。l二、旋转薄层色谱仪二、旋转薄层色谱仪l目前旋转薄层色谱仪有2种类型：l一种是美国Harrison的7924型Chromatotron仪及我国北京青云仪器厂生产的LBC1型离心薄层色谱仪；l另一种是日本日立公司生产的CLC型离心薄层色谱仪。 l旋转圆盘为倾斜的，核心部分是一直径为24厘米，铺有吸附剂的玻璃圆盘 。l1. 旋转薄层的制备l常用硅胶为吸附剂。为防止薄层开裂常加石膏G或羧甲纤维素钠为粘合剂。l例如：在多数情况下，利用硅胶制备2毫米厚的薄层。将薄层色谱硅胶60F254 60克+石膏CaSO4.2
35、H2O 8克加水110毫升，剧烈振摇30秒。将混合物倾倒在载体玻璃板上，使之旋转向四周扩散，最后形成一均匀薄层。在板四周可加一防护带，防止吸附剂流出板边缘。l室温干燥过夜后，置烘箱6070烘1小时。冷后，用一固定于中心的刮离器，可将吸附剂表面刮平，在中央留一空白处，用以倒入洗脱剂。l2. 层析过程l将制备板（厚度1，2，4毫米）用螺丝固定在电动机轴心上，以800r/min速度转动。输出量110毫升/分输液泵。将洗脱液加至吸附剂中央空白处。通过离心力作用，使洗脱液流经薄层板。先用洗脱液冲洗薄层板，以除去吸附剂中杂质，随后有两种操作方式l直接加入样品l干燥后再加入样品，然后开始洗脱，流速36毫升/
36、分。l圆形色谱板上展开的圆形色谱带可借UV灯检出，覆盖的石英玻璃不防碍UV穿过。l有时可持续通氮气入色谱室中，以防洗脱液凝结和样品被氧化。l加入样品后，随洗脱液的洗脱，可得到各组分浓缩的同心圆状色谱，通过肉眼可直接观测到。见图l在色谱板边缘，色带快速脱离色谱板，流出管外，从而能选择性收集之。 l3.色谱条件选择l用硅胶作吸附剂，洗脱剂选择：一般要求将分析薄层色谱条件的Rf调至0.5以下，否则将相同洗脱溶剂用于离心薄层时，洗脱速度太快。l实验证明一个2mm厚的薄层，可分离50500mg的混合物。可应用梯度洗脱法，提高产品洗脱分离速率。 l(二二)、日立、日立Hitachi CLC-5离心色谱仪离
37、心色谱仪l使用之前使用之前 ，先将吸附剂与洗脱剂混合物加到两，先将吸附剂与洗脱剂混合物加到两块直径为块直径为30厘米的水平薄板之间，像厘米的水平薄板之间，像Sandwich一样。一样。l离心使过量溶剂排出，然后将样品混合物加到离心使过量溶剂排出，然后将样品混合物加到仍潮湿的吸附剂薄层上，采用常规法进行色带仍潮湿的吸附剂薄层上，采用常规法进行色带洗脱。洗脱。 l与Chromatotron相比，当所用吸附剂厚度相同时，两者具有相同的载药量。l但Chromatotron厚度不能超过4毫米。l而Hitachi可允许装入更厚的吸附薄层。l（46毫米）l l说明：l 离心薄层吸附剂用普通薄层层析用硅胶，氧
38、化铝外，还可用离子交换，分子筛（葡聚糖凝胶），制板方式与普通薄层板相似。l 该方法对Rf较大的二成分分离效果较好，对Rf较小者，分离效果差。l 该方法仅适用于少量样品的分离（1g），不适合于大量样品的分离。对于天然产物成分的分离，效果不佳。l 圆形旋转薄层板处理后，可反复使用。l传统的制备板薄层是靠毛细管作用，展开剂将样品展开。而加压薄层色谱（OPLC）是靠外压作用，使展开剂强制性流动的一种技术。lOPLC由于采用更细的吸附剂，更长的色谱板，因而分离效果更好。所用时间短，扩散效应相对减少。 lOPLC可分为两种情况：l非全程的加压薄层（off-line OPLC） l全程的加压薄层（on-li
39、ne OPLC ）l一、制备型非全程加压薄层一、制备型非全程加压薄层l该方法是Tyihak等1979年设计的一种加压板层析技术。该法吸附剂由一层塑料膜完全覆盖，在外压下使蒸汽相消失。即该分离是在安全封闭的体系中进行的。其分离展开可以从仪器展开室玻璃观察到。流动相到达薄板前沿后，减去压力，打开展开室，取出薄层，供分析或分离制备。该过程为非全程的 OPLC，其操作完全与PTLC一样。 l二、制备型全程加压色谱二、制备型全程加压色谱l该技术是在非全程加压薄层技术基础上发展起来的。是将薄层板完全封闭起来，洗脱液流经监测器，并自动收集各流分。l 1 加压层析板：l它需要特殊预制板（硅胶60F254S板厚
40、2毫米），刮去四周边缘的吸附剂3毫米，使成斜边缘。将暴露玻璃板边缘和吸附剂的边缘浸入聚合物混悬液（Labo MIM）中，室温干燥数小时。聚合物形成一层膜附着于板上。当洗脱剂在压力下展开时，聚合物与板上的一层塑料薄膜紧密结合，防止溶剂向四周渗漏，形成封闭的体系，产生一平面薄层柱。l在板的两端各挖一条0.5毫米宽的通道，让洗脱液流进和流出。 l2 加样与层析 加样后，层析板放入层析缸，溶剂出入口应接在出入通道上，否则流动相不能分布均匀，然后在板上铺一聚司氟乙烯膜。加压前，使溶剂阀关闭，使溶剂的压力达到一定值，打开阀门，让溶剂在通道上分布，流动相均匀流过薄层全程，从输出通道流出，经过检测器收集之。 l3常用仪器：有chronipress10;25型，匈牙利生产；KB5121型，5129型。l本法可分离50毫克0.5克样品。两个化合物的分离仅需1小时，较复杂成分的分离需几个小时。l三、应用实例三、应用实例 (略）略）
