1、实验12 植物多胺的薄层层析荧光测定法【多胺的作用】 多胺：具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱多胺：具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱n类似于激素，含量稍高，移动性差 n膜的稳定 n延缓衰老n渗透调节剂n抑制乙烯合成n 层析法（chromatography）是利用物质在固定相与流动相之間的分配差异以分离混合物的方法。 按照固定相的形式分：柱层析、薄层层析、纸层析等【实验原理】薄层层析是吸附层析的一种，將吸附剂如硅胶或铝土均勻涂布于在鋁片、胶片或玻璃板上形成薄层，作为层析固定相（stationary phase），再將混合物样品点附在此薄层固定相相上，以液体展开剂作为流动相（mobile pha
2、se），透过毛細作用由下往上移动。由于不同的化合物与固定相之间吸附力，和流动相间溶解度的差异，当展开剂上升、流经所吸附的样点时，吸附力弱的物质移动快，吸附力强的移动慢。由于各种物质移动的速率不同，使混合物最后在固定相薄层上分开，达到分离目的。Rf值：一种化合物在层析板上上升的高度与展开剂上升高度的比值，Rf是化合物在该分析条件下的特性参数。利用Rf 值，可以判断两化合物是否为相同的化合物；也可用于判断混合物中至少含有多少种成分n多胺属脂肪族直链胺类，以前主要用氨基酸分析仪和纸电泳等方法测定，n目前多用衍生化的方法，即将多胺的一、二级氨基接在对荧光或紫外光有吸收的基团上，再通过薄层或液相色谱分离
3、检测。常用的衍生试剂有丹磺酰氯、苯甲酰氯、苯磺酰氯及荧光胺类等。【测定方法】 试剂n高氯酸（5%）、脯氨酸（100mg/ml水）、氯仿、三乙胺、碳酸钠（饱和溶液）、乙酸乙酯、n丹磺酰氯（5mg/ml丙酮，可以少如一半，以减少试剂荧光干扰）神经性毒物，致癌Dansyl chloride二甲基氨基萘磺酰氯C12H12Cl NO2S ; FW 269.7 设备n高速冷冻离心机，荧光分光光度计，三用紫外分析仪，微量进样器，层析硅酸薄板（G8x18cm），电吹风，层析缸，离心管。【材料与设备】材料材料n2周小麦幼苗叶片；大豆、玉米、小麦胚 -20C处理（10个）【实验步骤】u 层析板的制作n材料：硅胶、
4、氧化铝、纤维素粉、DEAE纤维素、琼脂、葡聚糖n厚度：0.25 mm, 110 度活化1小时, 用前温化n称取层析用硅胶（G60）4克于研钵内，加入12ml（+/- 1ml）5%淀粉水溶液(含0.1% HBO3)磨匀，将硅胶倾倒于层析用玻璃板（8x18cm）上，铺平。凉干(2h,1017通风橱中)，置110C烘箱内烘干活化（30 分钟，1019干燥箱中）。n板子的质量与研磨的力度、时间有关。研磨时间越长，越凝固。研磨时间短、稀，控制时间与力度。一般用力5分钟可以n精胺 (Spm spermin C10H26N4 Mr:202.3)n亚精胺 (Spermidine Mr 145.2)n尸胺 (C
5、adecine Mr102) 1,5-Diaminopentane dihydrochloride FW 175.1 98%n腐胺 (Putrecine Mr 88.15) 1,4-Diaminobutane dihydrochloride FW 161.08 98%n均分别用5%高氯酸配制成10、1、0.1、0.01 mmol/L标准液。【多胺标准液的配制多胺标准液的配制】【多胺粗提液的制备多胺粗提液的制备】n300mg新鲜小麦叶片（取自叶片中段）用3ml冰冷的5%高氯酸分数次在小研钵里研磨，研磨液合并，在冰浴中浸提1小时（其间摇晃数次）。然后高速离心（15000g，20min，4C），其上
6、清液即为多胺粗提液，也可用青霉素瓶装保存于-25C冰箱中。n（1克叶片足够+5ml 冰冷的5%高氯酸）400l多胺粗提液+400l丹磺酰氯+300l饱和碳酸钠搅拌、室温、黑暗中过夜（60度水浴25min，可当天完成）+100l脯氨酸搅拌、室温中反应30min+500l苯搅拌、静置取有机相层析【丹磺化与萃取丹磺化与萃取】标样丹磺化第1组精胺第2组亚精胺 第3组尸胺 第4组腐胺第5组混合标样点样：先用铅笔在层析片上距底端约1.5cm处轻轻画一条横线作为起始线，再画一条短线垂直于起始线，作为样品的点样点。可在起始线上点3个样品（单一标样、混合标样及自提样品），一起排列展开，但是相邻距离及样点与层析板
7、边缘距离均应至少保持3cm ，以避免展开时因扩散而导致样品重叠。注意：请每个人在点样前，在层析板背面上方写上名字和学号n用微量进样器点220ul多胺丹磺化合物的苯提取液于硅胶薄板，以垂直的角度快速、轻巧地点样后，移开针头，让溶剂挥发。n样点的直径不宜过大，小于0.3-0.5cm，样点越小，分离效果越好。当样点过大时時，Rf 值相近的点常因扩散現象而重叠不易区分，导致分离的效果变差。n用过的针头，以纸巾將管內的溶液吸引出，再用干淨的溶剂润洗2-3 次，就可以重复使用，继续在层析片上点下一个样品。n溶剂挥发后，层析板放在密闭且充满饱和蒸汽的展開槽中展开4560min（展开剂为氯仿：三乙胺=100：
8、20V/V 液面不能高过样点, 密闭层析, 溶剂饱和）n当展开剂到达顶端边缘时，立即以铅笔标出展开剂的前沿位置，用电吹风吹干薄板，并置紫外分析仪下对照标准多胺，用铅笔划出各多胺斑点，求出各类多胺的Rf值。n (254nm紫外灯，用酒精洗加样器, 被分离物 Rf0.5-0.8 之间, Rf大于0.05可以区别)n 由于多胺分子中含有氨基团，它易与固定相硅羟基Si-OH发生吸附，故在流动相中加入三乙胺。如果不加，SPM/SPD不能分离，而太多的三乙胺会使色谱峰产生拖尾。n将上述薄板上的各点多胺衍生物的斑点用刀片刮下，并溶于5ml乙酸乙酯内，将瓶口塞紧旋涡搅拌，静置15-20min，取其上清液在荧光分光光度计上检测，其数值可采用浓度直读或查标准曲线的方法求得，最后换算成PAs nmol/g.FW表示植物叶片内多胺的含量。多胺含量
