1、郑永丽郑永丽上海交通大学化学化工学院上海交通大学化学化工学院20131115 概述 荧光光谱法原理 荧光的光谱特性 我们有关荧光的工作 能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级 荧光：受光激发的分子从的最低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：从的最低振动能级回到基态所发出的辐射。 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )：又称为荧光光谱法或荧光分析法是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行的 灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1-
2、3个数量级； 选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光； 试样用量少和方法简便 能提供比吸收光谱多的物理参数 应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。荧光光谱法原理荧光光谱法原理发射光谱的形状与激发波长无关荧光的光谱特性量子产率 激发波长：固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱。 发射波长：固定激发光的波长而不断改变荧光的测定波长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射波长。4005006007000250000500000750000Em 530 nm
3、 IntensityWavelength / nmEx 463 nm图 荧光染料C-540A的激发和发射光谱 测试方法： 1)判断激发波长：根据分子结构判断；参照吸收光谱； 三维扫描 2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长 3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长 强度： 比尔-朗伯定律 If=2.303YfI0b c 应用：定性和定量跃迁类型（pi-pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强）共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强）刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活可能性小，荧光强）取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减
4、弱甚至猝灭） 溶剂极性可增加或降低荧光强度；与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。 温度升高，荧光强度下降(因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低)。 体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，称为内滤光；荧光物质浓度较大，吸收自身的荧光发射，称为荧光自吸。 具酸或碱性基团的有机物，在不同 pH 值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变溶剂 温度内滤光和自吸pH值有序介质的影响有序介质的影响(表面活性剂表面活性剂)350400450050000010000001500000 IntensityWavelength (nm) 0.0001 0
5、.0005 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5 1 mg/mlCMC 定义： 荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值.(Y) 测试方法： 参比法 Yu=YS(Fu/Fs)(As/Au ) (nu/ns)(A0.05)；直接测量法，要求仪器有积分球 注意事项： 温度，溶剂，激发波长，浓度 应用： 量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系间跨越、外转移和内转移等的相对速率Q.Y. StandardsQ.Y.%Conditions for Measurement ExcitationnmCy34PBS540Cy527PBS620Cresyl
6、 Violet53Methol580Fluorescein950.1M NaOH, 220C496popop97Cyclohexane300Quinine sulfate580.1 M H2SO4, 220C350Rhodamine 101100Ethanol450Rhodamine 6G95Water488Rhodamine B31Water514Tryptophan13Water, 200C280L-Tyrosine14Water270 定义： 测量： L-型或者单通道法 T-型多通道法 应用： 流动性,分子基本性质,酶学 分子相互作用,荧光偏振免疫,成像 常用偏振研究的荧光分子： 1,6
7、-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘磺酸钠(2,6-ANS) 定义： 当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor） 的激发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。 FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于 30；供体分子和受体分子间的距离必须在 1-10 nm 之间.D和A间的FRET 效率： R0: E=50%时供体和受体分子间的 距离 对于特定的供体受体对是
8、常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件 检测两个发光分子间的重合与共定位 检测分子间的相互作用 检测分子的折叠与构象变化 BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs)染料类(Dye)FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5 定义：当激发光切断后荧光强度衰减至原强度的1/e所经历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态的平均寿命。
9、测试方法： 时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting , TCSPC); 相调制法(Phase Modulation Methods) 频闪技术(Strobe Techniques). 应用： 荧光寿命与物质所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此可以通过荧光寿命直接了解所研究体系发生的变化。 同步荧光测定；导数荧光测定；三维荧光光谱技术 时间分辨荧光测定；相分辨荧光测定； 荧光偏振测定；荧光免疫测定； 低温荧光测定； 固体表面荧光测定； 近红外荧光分析法； 荧光反应速率法 荧光显微与成像技术；空间分辨荧光技术荧光探针技术；单分子荧光检测
10、技术； 荧光光纤化学传感器探针探针Ex(nm)Em(nm)探针探针Ex(nm)Em(nm)1,8-ANS372480Cy3550570Hydroxycoumarin325386Hoechst 33342343483Aminocoumarin350445Ethidium Bromide493620NBD466536Fluo-3 (膜穿透性)506526Fluorescein495519DPH362432Rhodamine B570590EGFP488507Alexa Fluro 350343442Calcein496517我们有关荧光的工作荧光稳态模块荧光稳态模块磷磷光光模模块块显微荧光模块显微
11、荧光模块荧光寿命模块荧光寿命模块图 荧光分光光度计的光学系统HBPO-star-PEO 聚合物CMC的测定 荧光猝灭法测量分子的分布 能量共振转移制备荧光呼吸囊泡 荧光偏振测量分子的流动性 荧光寿命研究体系微环境 发光聚合物荧光性能的测定芘不溶于水，溶于乙醇、乙醚、甲苯、四氢呋喃等有机溶剂。随着溶剂的极性增加，I1/I3降低，因而可以用于聚合物组装的研究3603804004204404604800200400 IntensityWavelength / nm13Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry 48 (20) , pp.
12、 4428-4438B) Schematic representation ofthe protonation and deprotonation of PEG-b-PDMA-Azo in the C) Steady-state fluorescence spectra of the vesicular solution atpH values between 4 and 12 D) Reversible pH-induced change in the fluorescence upon the alternate addition of HCl and NaOHJonathan D. Vi
13、olin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899909Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of l
14、ive cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629633Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 1499715002Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599611 Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:13951398
