1、病毒致瘤因素及其致瘤机理病毒致瘤因素及其致瘤机理一、致瘤病毒：一、致瘤病毒：（一）致瘤病毒的定义（二）DNA致瘤病毒（三）RNA致瘤病毒二、致瘤病毒的致瘤机理二、致瘤病毒的致瘤机理（一）病毒癌基因（二）病毒癌基因及其前身细胞癌基因（三）病毒癌基因的基因产物（癌基因章详细讲）（四）致癌机制 参考书：参考书：n肿瘤基础理论 （朱世能主编）n肿瘤学 （曾益新主编）n肿瘤分子生物学（孙靖中主编）n预防肿瘤学基础（湖医肿瘤所编）n肿瘤分子细胞生物学（陈意生、史景泉主编）一、致瘤病毒：一、致瘤病毒：（一）致瘤病毒的定义（一）致瘤病毒的定义1971年 Henle提出肿瘤病毒的标准1.在人类肿瘤中检测出病毒、
2、病毒决定性 抗原、或 病毒相关核酸2.注射病毒可诱导非人类的灵长目动物 （如猿、猴等）发生肿瘤3.在体外培养，病毒可使正常细胞转化4.患者的抗病毒相关抗原抗体的频率或滴定度明显高于健康人或患其他肿瘤的病人病毒致瘤必须具备下列证据：v病毒感染在肿瘤发生之前v肿瘤细胞中显示病毒特异性抗原 或特异性颗粒v病毒DNA整合到宿主细胞的基因组中整合的 病毒基因在体外能导致细胞恶性转化，这些恶性细胞并能传代v消灭病毒应该使该肿瘤不形成或至少使肿瘤的发病明显减少肿瘤基础理论：肿瘤基础理论： （朱世能主编）（朱世能主编）鸡肉瘤滤液鸡肉瘤滤液 注射到小鸡注射到小鸡小鸡得肉瘤小鸡得肉瘤提取病毒，电镜观察提取病毒，电
3、镜观察1910年年 Rous 第一个发现肿瘤病毒：第一个发现肿瘤病毒：1966年得诺贝尔奖！年得诺贝尔奖！一些重要的致瘤病毒：一些重要的致瘤病毒：发现年份发现年份 发现者发现者 致瘤病毒致瘤病毒1908 Ellermann/Bing 鸡白血病病毒鸡白血病病毒1911 Rous 鸡肉瘤病毒鸡肉瘤病毒1932 Shope 鸡纤维瘤病毒鸡纤维瘤病毒1933 Shope 兔乳头状瘤病毒兔乳头状瘤病毒1934 Lucke 蛙肾癌病毒蛙肾癌病毒1936 Bittner 小鼠乳腺癌病毒小鼠乳腺癌病毒1951 Gross 小鼠白血病病毒小鼠白血病病毒1953 Gross/Stewart 多瘤病毒多瘤病毒196
4、0 Sweet/Hilleman SV 40病毒病毒1962 Trentin 人腺病毒人腺病毒12型型1964 Epstein/Barr EB病毒病毒1966 Moloney 小鼠肉瘤病毒小鼠肉瘤病毒1970 Morgan 猴疱疹病毒猴疱疹病毒、1980 Gall/Yoshida 人类细胞白血病病毒人类细胞白血病病毒（二）（二）DNA致瘤病毒致瘤病毒乳-多-空病毒 人类乳头状瘤病毒人类乳头状瘤病毒 HPV （24种亚型）种亚型） 多瘤病毒科多瘤病毒科 PY 小鼠多瘤病毒小鼠多瘤病毒 人类人类BK病毒病毒 人类人类JC 病毒病毒 猴空泡病毒猴空泡病毒SV40腺病毒科（人） 高致瘤性、致瘤性、无致
5、瘤性高致瘤性、致瘤性、无致瘤性疱疹病毒科 -疱疹病毒疱疹病毒 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒,水痘水痘-带状病毒带状病毒 -疱疹病毒疱疹病毒 巨细胞病毒巨细胞病毒(CMV) -疱疹病毒疱疹病毒 EB病毒病毒乙型肝炎病毒 (HBV) 衣壳核心核心壳粒被膜1.DNA致瘤病毒的共同特点致瘤病毒的共同特点:超微结构和超微结构和DNA结构结构20面体对称型面体对称型, 除疱疹病毒外皆无被膜除疱疹病毒外皆无被膜(Envelope)核心核心-DNA和蛋白质复合物和蛋白质复合物外外-衣壳衣壳(Capsid) -由壳粒组成由壳粒组成(Capsomere)DNADNA病毒（无被膜）病毒（无被膜） 噬菌体噬菌体病毒的形状
6、和病毒的形状和大小大小乙型病毒性肝炎病毒基因图乙型病毒性肝炎病毒基因图病毒病毒 直径直径nm 壳粒壳粒 DNA结构结构多瘤病毒多瘤病毒 43 72 双股环状双股环状乳头状瘤病毒乳头状瘤病毒 53 72 双股环状双股环状疱疹病毒疱疹病毒 100 162 双股线状双股线状腺病毒腺病毒 70-90 252 双股线状双股线状肝炎病毒肝炎病毒 不完全环状不完全环状 Centi meterMilliMicronano水平感染水平感染, 进入细胞后进入细胞后,因细胞的特性不同产生不同的结果因细胞的特性不同产生不同的结果, 即为即为对细胞的选择性对细胞的选择性允许细胞允许细胞: (permissive cel
7、l) 病毒入细胞后繁殖病毒入细胞后繁殖,产生有感染的子病毒产生有感染的子病毒 同时细胞溶解死亡同时细胞溶解死亡(溶解性感染溶解性感染) 不会导致细胞转化不会导致细胞转化 称增殖性感染称增殖性感染非允许细胞非允许细胞: (Non-permissive cell) 病毒入细胞后不繁殖病毒入细胞后不繁殖,不产病毒不产病毒 细胞继续存活细胞继续存活 能以某种方式存在能以某种方式存在 发生整合发生整合,导致细胞转化导致细胞转化 称非增殖性感染称非增殖性感染(2) DNA致瘤病毒的感染和复制致瘤病毒的感染和复制病毒的复制周期（病毒的复制周期（Replication CycleReplication Cyc
8、le）吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配释放吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配释放吸附吸附HIV-CD4HIV-CD4EBV-CR-2 EBV-CR-2 鼻病毒鼻病毒ICAM-1ICAM-1病毒吸附病毒吸附电镜图电镜图穿入：穿入：三种方式三种方式 融合（融合（FusionFusion）胞饮（胞饮（ViropexisViropexis） 直接进入直接进入脱壳：脱壳：致瘤性致瘤性DNADNA病毒感染病毒感染增殖性感染增殖性感染 非增殖性感染非增殖性感染细胞病变细胞病变 细胞转化细胞转化病毒抗原病毒抗原肿瘤抗原肿瘤抗原病毒病毒病毒病毒DNADNA肿瘤抗原肿瘤抗原病毒繁殖病毒繁殖无病毒繁殖无病毒繁殖细胞死
9、亡细胞死亡细胞恶性转化细胞恶性转化肿瘤细胞肿瘤细胞DNADNA病毒复制的主要步骤病毒复制的主要步骤2.乳头状瘤病毒科乳头状瘤病毒科:已发现已发现24种亚型主要诱发：良性乳头状瘤：良性乳头状瘤 纤维乳头状瘤纤维乳头状瘤 纤维瘤纤维瘤与肿瘤相关性：HPV-6HPV-11 性传递的尖锐湿疣和猴乳头状瘤有关性传递的尖锐湿疣和猴乳头状瘤有关HPV-6HPV-16，18人宫颈癌检出率高人宫颈癌检出率高 16，18型多见于宫颈浸润癌型多见于宫颈浸润癌 阴茎癌阴茎癌 生殖系尖锐湿疣生殖系尖锐湿疣在转化细胞内，环状病毒基因组以游离基因在转化细胞内，环状病毒基因组以游离基因(episome)形式存在形式存在细胞分
10、化细胞分化HPV-感染表层生发细胞感染表层生发细胞-细胞细胞分裂形成乳头状瘤分裂形成乳头状瘤底层 增殖细胞-不生成病毒不生成病毒 仅有少量病毒颗粒仅有少量病毒颗粒表层 角化细胞-细胞停止分裂细胞停止分裂 有很好允许作用有很好允许作用 产生大量产生大量HPV 3.疱疹病毒科疱疹病毒科n病毒病毒 高相关肿瘤高相关肿瘤 弱相关肿瘤弱相关肿瘤-疱疹病毒疱疹病毒 病毒复制周期短病毒复制周期短 可引起宿主细胞病变可引起宿主细胞病变 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 - 口腔癌口腔癌 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 - 宫颈癌宫颈癌 水痘水痘-带状疱疹病毒带状疱疹病毒 - -疱疹病毒疱疹病毒 病毒复制周期长病毒复制周期长
11、 宿主细胞病变作用慢宿主细胞病变作用慢 巨细胞病毒巨细胞病毒(CMV) Kaposi肉瘤肉瘤 宫颈癌宫颈癌 前列腺癌前列腺癌-疱疹病毒疱疹病毒 宿主细胞范围窄宿主细胞范围窄 淋巴样细胞淋巴样细胞/T/B中复制中复制 EB病毒病毒 Burkitts L 喉会厌部癌喉会厌部癌 鼻咽癌鼻咽癌 腭扁桃体腭扁桃体 免疫母细胞肉瘤免疫母细胞肉瘤 腮腺肿瘤腮腺肿瘤EB病毒相关疾病举例：病毒相关疾病举例：* 非洲儿童淋巴瘤(Burkitts 淋巴瘤） 1964年年Epstein和和Barr在淋巴瘤的培养标本中在淋巴瘤的培养标本中分离到分离到 EB病毒病毒所有患者都有病毒抗体存在：抗所有患者都有病毒抗体存在：抗
12、-VCA 抗抗-MA 抗抗-EA 抗抗-EBNA分子杂交法分析分子杂交法分析98的标本皆有的标本皆有EBV-DNA存在存在n其他因素合同：感染，遗传等其他因素合同：感染，遗传等* 鼻咽癌鼻咽癌 鼻咽癌患者有高滴度的鼻咽癌患者有高滴度的VCA和和EA抗体抗体 IgA/EA IgA/VCA 鼻咽癌组鼻咽癌组 96 82 对照组对照组 6 6 广西苍梧县：广西苍梧县： 14829人人 IgA/VCA+ 3539人人 NPC 55人人 阳性者随访阳性者随访13年：又发现年：又发现NPC 32人人 抗补体免疫法：癌细胞抗补体免疫法：癌细胞EBNA+分子杂交法：分子杂交法： 病毒基因病毒基因 鼻咽癌鼻咽癌
13、 90 慢性鼻咽炎慢性鼻咽炎 20 其他肿瘤其他肿瘤/正常组织正常组织 阴性阴性Western Blot: 鼻咽癌组织中有鼻咽癌组织中有EB病毒蛋白表达病毒蛋白表达 LMP EBNA1 EBNA26 鼻咽癌鼻咽癌 74 81 - 其他肿瘤其他肿瘤/正常组织正常组织 - - - LMP-1表达上调凋亡调节基因表达上调凋亡调节基因bcl-2-阻止受感染细胞阻止受感染细胞凋亡凋亡癌细胞增生癌细胞增生 EB病毒病毒 W片段可能是转化基因：片段可能是转化基因： W+Y.H 转染转染 3T3细胞细胞 细胞转化细胞转化 裸鼠成瘤裸鼠成瘤 （纤维肉瘤）（纤维肉瘤） puro SV GFPpSV40 polyA
14、 LMP1 pSV40 pCMV HSV SV polyA polyA PAT-GFP-LMP1结构示意图结构示意图Paterson Institute for Cancer Research, Christie CRC Research Center, Manchester, UKCNE1电转染电转染puromycinpuromycin碱裂解法、碱裂解法、PG8000PG8000、EcoREcoR荧光显微镜荧光显微镜( (GFP)GFP)流式细胞仪流式细胞仪( (GFP)GFP)免疫组化免疫组化( (CS1-4)CS1-4)Western blot(S12)Western blot(S12)
15、CNE1 CNE1G CNE1GLPAT-GFP-LMP1PAT-GFP细胞增殖实验细胞增殖实验细胞周期细胞周期体内倍增时间、生长率体内倍增时间、生长率平板克隆形成率平板克隆形成率裸鼠体内成瘤率裸鼠体内成瘤率裸鼠移植瘤潜伏期裸鼠移植瘤潜伏期角蛋白表达角蛋白表达裸鼠移植瘤转移率裸鼠移植瘤转移率流式细胞仪流式细胞仪PIPI、Hoechst3325Hoechst3325 双双荧光染色荧光染色DNADNA片断分析片断分析免疫组化免疫组化Western blotWestern blot平板克隆平板克隆形成形成试验试验转移转移能力能力增殖增殖能力能力恶性恶性程度程度凋亡凋亡 放射放射敏感性敏感性CNE1
16、CNE1G CNE1GL恶性肿瘤的侵袭及转移原发灶侵袭正常组织转移瘤MMPsMMP-2MMP-9降解细胞外基质基底膜立题依据临床病理部分：技术路线慢性鼻咽炎（30例）鼻咽癌（30例）鼻咽癌颈淋巴结转移灶（24例）LMP1LMP1MMP-2MMP-2MMP-9MMP-9免疫组化法结果临床病理部分：LMP1MMP-2MMP-9positive rate %020406080100鼻咽炎 鼻咽癌 转 移灶 转 移 灶临床标本免疫组化结果LMP1在NPC及NPC转移灶组织中的表达情况：MMP-2、MMP-9在NPC及NPC转移灶中的表达实验病理部分：技术路线CNE1CNE1CNE1CNE1CNE1CN
17、E1CNE1CNE1CNE1GLCNE1GLCNE1CNE1CNE1CNE1CNE1CNE1CNE1GLCNE1GLCNE1CNE1CNE1CNE1CNE1GLCNE1GLCNE1GLCNE1GLCNE1GLCNE1GLCNE1GLCNE1GLCNE1-GL细胞亚克隆筛选CNE1CNE1CNE2ZCNE2ZCNE1GLCNE1GLMMP-2MMP-2MMP-9MMP-9免疫组化法Western-BlotCNE1CNE1CNE1GLCNE1GL基底膜粘附实验细胞运动实验重组基底膜侵袭实验粘附能力运动能力侵袭能力实验病理部分：结果CNE1、CNE2Z和CNE1GL细胞MMP-2、MMP-9表达情况
18、（98.2%）（1.8%）（92.6%）（7.4%）491/5009/500463/50037/500CNE1-GL（47.6%）（52.4%）（29.6%）（70.4%）238/500262/500148/500352/500CNE2Z（30.2%）（69.8%）（15.5%）（84.5%）151/500349/50077/500423/500CNE1 阳性阳性 强阳性强阳性强阳性强阳性阳性阳性MMP-2 MMP-9细胞系细胞系MMP-2MMP-9High positive rate %020406080100CNE1 CNE2Z CNE1GL 实验病理部分：结果MMP-2和MMP-9在三组
19、细胞中的表达（Western-Blot结果）：实验病理部分：结果CNE1和CNE1-GL细胞与基底膜成分粘附实验OD值细胞系细胞系 MeanS.D. CNE1 0.9519 0.068 CNE1-GL 1.2508 0.0711groupsCNE1CNE1-GL Mean OD value0.00.25.50.751.001.251.50实验病理部分：结果CNE1和CNE1-GL细胞运动实验结果细胞系例数MeanMeanS.D.S.D.CNE1CNE1CNE1-GLCNE1-GL3 33 3123.667123.6675.5085.50855.66755.6675.0445.044方差分析：两
20、组比较方差分析：两组比较P P0.0010.001CNE1和CNE1-GL细胞侵袭实验结果细胞系例数MeanMeanS.D.S.D.CNE1CNE1CNE1-GLCNE1-GL3 33 3339.00339.0035.837635.8376157.67157.6723.180523.1805方差分析：两组比较方差分析：两组比较P P0.010.01Invasion Assay Migration Assay0123cells number050100150200250300350400CNE1CNE1-GLCNE1细胞运动实验结果（HEHE染色染色200200）CNE1-GL细胞运动实验结果（
21、HEHE染色染色200200）CNE1细胞侵袭实验结果（HEHE染色染色200200）CNE1-GL细胞侵袭实验结果（HEHE染色染色200200）4.基因组基因组/转化基因转化基因/病毒抗原病毒抗原*基因组：直线双链直线双链 长度为长度为140235kb 封闭环状封闭环状 （如（如EB病毒）病毒） 在细胞核的核小体中在细胞核的核小体中 由宿主细胞由宿主细胞DNA聚合酶进行复制聚合酶进行复制 例例EBV基因组：基因组：DNA长度长度173kb 分子量分子量110106 道尔顿道尔顿*转化基因: HSV-I 23kb Mtr I SV40: LT HSV-II 7.5kb Mtr II HPV:
22、 E6,E7 22kb Mtr III 腺腺V: E1A,E1B EBV W片段片段*病毒抗原：EBNA2 LMP（三）（三）RNA致瘤病毒致瘤病毒1.概述概述：10多个科多个科 仅有一个科的少数病毒致瘤仅有一个科的少数病毒致瘤 病毒类型病毒类型 病毒名称病毒名称 可引起肿瘤可引起肿瘤 RNA C型病毒型病毒 白血病白血病 B型病毒型病毒 乳腺癌乳腺癌 HTLV(HIV) 人人T细胞白血病细胞白血病/淋巴瘤淋巴瘤 特点：均含逆转录酶，故称逆转录病毒特点：均含逆转录酶，故称逆转录病毒/逆病毒逆病毒 （Retrovirus）2.超微结构及生物学分类：超微结构及生物学分类： 超微结构：超微结构：圆形
23、圆形/类圆形类圆形 中央：拟核中央：拟核 nucleoid 外层：被膜（糖蛋白外层：被膜（糖蛋白+脂类）脂类）envelope内源性内源性/外源性外源性RNA致瘤病毒致瘤病毒 内源性前病毒内源性前病毒 外源性外源性RNA致瘤病毒致瘤病毒来源来源 多来源正常组织多来源正常组织 多来自恶性肿瘤多来自恶性肿瘤传播方式传播方式 性细胞垂直传递性细胞垂直传递 感染方式水平传播感染方式水平传播 整合于宿主细胞整合于宿主细胞 感染因子水平传播感染因子水平传播 中的病毒基因中的病毒基因 可感染生殖细胞可感染生殖细胞 转为垂直传播转为垂直传播病毒复制病毒复制 基本静止基本静止 感染细胞中复制感染细胞中复制 不复
24、制病毒不复制病毒 不引起细胞死亡不引起细胞死亡致瘤作用致瘤作用 不致瘤不致瘤 有致瘤作用有致瘤作用 除经诱导除经诱导 体外使细胞转化体外使细胞转化 （放射放射/化学物）化学物）外源性致瘤病毒的复制：外源性致瘤病毒的复制：V-RNA逆转录酶ss-V-cDNAds-V-DNA聚合酶V-DNAV-mRNAV-RNA+protein 急性和慢性急性和慢性RNA致瘤病毒致瘤病毒: 按致瘤潜伏期和体外转化能力 致瘤潜伏期致瘤潜伏期 体外转化能力体外转化能力 病毒复制病毒复制 致癌基因致癌基因急性急性 34周周 有有 缺失性病毒缺失性病毒 有有V-onc 需辅助病毒需辅助病毒 转化蛋白转化蛋白 才能复制才能
25、复制 细胞转化细胞转化慢性慢性 412月月 无无 非缺失性病毒非缺失性病毒 无无V-onc 可复制完整可复制完整 病毒病毒3.RNA致瘤病毒的基因结构：致瘤病毒的基因结构：病毒基因排列：病毒基因排列： gag pol env onc 主要结构主要结构 多聚酶多聚酶 被膜被膜 肿瘤肿瘤 蛋白基因蛋白基因 基因基因 基因基因 基因基因基因产物：基因产物：主要结构蛋白主要结构蛋白 逆转录酶逆转录酶 被膜糖蛋白被膜糖蛋白 转化蛋白转化蛋白V-onc:编码与细胞恶性转化有关的转化蛋白编码与细胞恶性转化有关的转化蛋白 只有急性只有急性RNA病毒有病毒有v-onc二、致瘤病毒的致瘤机理二、致瘤病毒的致瘤机理
26、 病毒： 病毒癌基因 正常细胞： 原癌基因 癌细胞： 癌基因 胚胎期 细胞分化(正常成熟细胞) 癌细胞 癌基因活性 - - （一）病毒癌基因（一）病毒癌基因RNA-V: H-ras K-ras abl fos sis20多种多种 （慢性病毒不含癌基因）慢性病毒不含癌基因）DNA-V: EBV: EBNA2, LMP-1? SV40: A 基因（早期基因）编码基因（早期基因）编码T抗原抗原 细胞癌基因与病毒癌基因同源：细胞癌基因与病毒癌基因同源： 病毒癌基因来源于细胞癌基因（后一章讲）病毒癌基因来源于细胞癌基因（后一章讲）（二）病毒癌基因及其前身细胞癌基因病毒癌基因及其前身细胞癌基因 原癌基因：
27、在正常细胞中适度表达，是维持原癌基因：在正常细胞中适度表达，是维持 细胞最细胞最基本功能（生长和分化等）所必需的。基本功能（生长和分化等）所必需的。 目前认为：目前认为： RNA致瘤病毒中的癌基因实际是来源于细胞的癌基致瘤病毒中的癌基因实际是来源于细胞的癌基因，当逆转录病毒因，当逆转录病毒DNA整合入细胞后，在细胞整合入细胞后，在细胞DNA和和病毒病毒DNA之间发生转录作用，使病毒捕捉到细胞癌基之间发生转录作用，使病毒捕捉到细胞癌基因而成为病毒癌基因组的组成部分因而成为病毒癌基因组的组成部分。（三）病毒癌基因的基因产物病毒癌基因的基因产物（癌基因章详细讲）（四）致癌机制（四）致癌机制DNA致瘤
28、病毒的致瘤机理：致瘤病毒的致瘤机理：病毒病毒DNA整合整合 激活原癌基因激活原癌基因 恶变恶变至宿主细胞至宿主细胞DNA 细胞遗传细胞遗传 细胞代谢细胞代谢 细胞分化细胞分化 恶变恶变 性状改变性状改变 调节功能调节功能 增殖失控增殖失控 紊乱紊乱病毒基因组病毒基因组 转化转化 细胞膜结合细胞膜结合 改变细改变细 恶变恶变编码产物编码产物 蛋白蛋白 细胞细胞DNA结合结合 胞调节胞调节获得性环境因素获得性环境因素（化学、物理、病毒）体细胞体细胞基因组基因组突变突变遗传性突变遗传性突变激活促进生长的激活促进生长的癌基因癌基因灭活肿瘤抑制灭活肿瘤抑制基因基因癌基因产物的表达癌基因产物的表达抑癌基因
29、产物的丧失抑癌基因产物的丧失恶性肿瘤恶性肿瘤转化蛋白致瘤性致瘤性DNADNA病毒转化细胞的机理病毒转化细胞的机理转化性V-mRNA病毒核浆RNA致瘤病毒的致瘤机理致瘤病毒的致瘤机理*急性急性RNA致瘤病毒致瘤病毒（有病毒癌基因，致瘤潜伏期短）（有病毒癌基因，致瘤潜伏期短）病毒病毒RNA 逆转录酶逆转录酶病毒病毒c-DNA病毒病毒c-DNA整合至宿主细胞整合至宿主细胞DNA病毒基因组中病毒基因组中LTR的转录激活作用的转录激活作用病毒基因组包含病毒癌基因高度表达病毒基因组包含病毒癌基因高度表达病毒癌基因产物作用病毒癌基因产物作用导致细胞恶性转化导致细胞恶性转化*慢性慢性RNA致瘤病毒致瘤病毒（无
30、病毒癌基因，致瘤潜伏期长）U3 R U5U3 R U5R U5R U5细胞细胞DNA LTR gag-DNA LTR gag-polpol-env env LTR LTR 细胞原癌基因细胞原癌基因 正常病毒DNA含有病毒的癌基因产物LTR: LTR: 前病毒末端重复顺序前病毒末端重复顺序U5-: LTR 5U5-: LTR 5端顺序，含病毒启动子端顺序，含病毒启动子U3-: LTR 3U3-: LTR 3端顺序端顺序R: 20R: 20个核苷酸左右的短顺序，使合成的起始部位个核苷酸左右的短顺序，使合成的起始部位正链正链RNARNA病毒复制的主要步骤病毒复制的主要步骤负链负链RNARNA病毒复制的主要步骤病毒复制的主要步骤
