1、 色谱分析的基本要求是实现混合物中各组分的分离色谱分析的基本要求是实现混合物中各组分的分离。色谱分离的首要条件是。色谱分离的首要条件是相邻两组分的保留值存在一定相邻两组分的保留值存在一定差别，两组分的色谱峰间距足够远差别，两组分的色谱峰间距足够远。由各组分在两相间。由各组分在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的的分配系数决定，即由色谱过程的热力学热力学性质决定。另性质决定。另一条件是一条件是每个组分色谱峰区域宽度足够窄每个组分色谱峰区域宽度足够窄。由组分在色。由组分在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学动力学性质决性质决定。定。 因此，研究、解释色谱
2、分离行为应从热力学和动力因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。学两方面进行。15-3 15-3 色谱理论基础色谱理论基础 1952 1952年，年，MartinMartin等人提出的塔板理论将一根等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔精馏塔，用，用塔塔板板概念来描述组分在柱中的分配行为。概念来描述组分在柱中的分配行为。 塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。一、塔板理论一、塔板理论（Plate theo
3、ry）塔板理论假定塔板理论假定:塔板之间不连续；塔板之间不连续；塔板之间无分子扩散；塔板之间无分子扩散；组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为达一次平衡所需柱长为理论塔板高度理论塔板高度H H；某组分在所有塔板上的分配系数某组分在所有塔板上的分配系数K K相同；相同；流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。板体积加入。当塔板数当塔板数n n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔
4、板数n50n50时，峰形接近正态分布。时，峰形接近正态分布。 根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数算塔板数n n的公式，用以评价一根柱子的柱效。的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论理论塔板数塔板数： 上式中，上式中，t tR R为保留时间；为保留时间；W W1/21/2为半峰宽（以时间为为半峰宽（以时间为单位）；单位）；W Wb b为峰底宽度（以时间为单位）。可见为峰底宽度（以时间为单位）。可见，理论塔板数理论塔板数n n由组分保留值和峰宽决定由组分保留值和峰宽决定。 2
5、22/1)(16)(54. 5bRRWtWtn 若柱长为若柱长为L L，则每块理论塔板高度，则每块理论塔板高度H H为：为： 由上述两式知道，理论塔板数由上述两式知道，理论塔板数n n越多、理论塔越多、理论塔板高度板高度H H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。越小、色谱峰越窄，则柱效越高。 上述两式包含死时间上述两式包含死时间t t0 0，它与组分在柱内的分，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效理论塔板数有效理论塔板数n neffeff和和有效理论塔板高度有效理论塔板高度H Heffeff表示：表示：effeffbRReff
6、nLHWtWtn 222/1)(16)(54. 5nLH 21effknnk 有关塔板理论的说明有关塔板理论的说明说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；件等；应定期对柱效进行评价，以防柱效下降，延长柱应定期对柱效进行评价，以防柱效下降，延长柱寿命。寿命。塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，解释了流出曲线形程，导出流出曲线的数学模型，解释了流出曲线形状和位置，提出了计算和评价柱效的参
7、数。状和位置，提出了计算和评价柱效的参数。 但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：不能解释：v 峰形为什么会扩张？峰形为什么会扩张？v 影响柱效的动力学因素是什么？影响柱效的动力学因素是什么？ 19561956年，荷兰化学工程师年，荷兰化学工程师Van DeemterVan Deemter等在等在研究气研究气- -液色谱时，提出了色谱过程液色谱时，提出了色谱过程动力学理论动力学理论- - -速率理论速率理论。该理论吸收了塔板理论中的塔板高。该理论吸
8、收了塔板理论中的塔板高度度H H的概念，同时考虑了组分在两相间的扩散和的概念，同时考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，导出了速率理论方程式，较完善地解传质过程，导出了速率理论方程式，较完善地解释了影响塔板高度的各种因素。适用于气相色谱释了影响塔板高度的各种因素。适用于气相色谱和液相色谱。和液相色谱。二、速率理论二、速率理论（Rate theory） Van Deemter Van Deemter方程：方程： 式中，式中， u u为流动相线速度；为流动相线速度；A A、B B、C C为常数。为常数。 A A分别表示涡流扩散项系数；分别表示涡流扩散项系数；B B分子扩散项系数；分子扩散项系数； C
9、 C传质阻力项系数（包括液相和固相传质阻力系数）传质阻力项系数（包括液相和固相传质阻力系数） 该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素。任何减少方程右边三项数值的方法，都可的各种因素。任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低降低H H，从而提高柱效。，从而提高柱效。CuuBAH 1.1.涡流扩散项涡流扩散项A A（MultipathMultipath term term） 在填充柱中，由于受到固定相颗粒在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组分在迁移过程中随流动相不的阻碍，组分在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的断改变方向，形成
10、紊乱的“涡流涡流”。从。从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性不均匀性同一组分运行路线长短不同一组分运行路线长短不同同流出时间不同流出时间不同峰形展宽。峰形展宽。流动方向流动方向展宽程度以展宽程度以A A表示：表示： A = 2A = 2 d dp p其中其中d dp p 填充物平均直径；填充物平均直径； 填充不规则因子。填充不规则因子。 可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A A，提，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0A=0。流动方向流动方向 2.2.纵向扩散
11、项纵向扩散项B/uB/u（Longitudinal diffusion termLongitudinal diffusion term） 纵向分子扩散是由于纵向分子扩散是由于浓度梯度浓度梯度引起的。当样品引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈被注入色谱柱时，它呈“塞子塞子”状分布。随着流动状分布。随着流动相的推进，相的推进，“塞子塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小散，使谱峰展宽。其大小 B = 2B = 2 D Dm m 弯曲因子，表示固定相几何形状对自由分子扩弯曲因子，表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；散的阻碍情况；D Dm m组分在流动相
12、中的扩散系数。组分在流动相中的扩散系数。讨讨 论论q 流动相分子量大，流动相分子量大，Dg小，即小，即B小小q Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；q u 增加，组分停留时间短，纵向扩散小；（增加，组分停留时间短，纵向扩散小；（B/u）q 对于液相色谱，因对于液相色谱，因Dm 较小，较小，B 项可忽略。项可忽略。)/1(流动相流动相MDg 球状颗粒球状颗粒大分子量流动相大分子量流动相适当增加流速适当增加流速短柱短柱低温低温B = 2 Dm 3. 3. 传质阻力项传质阻力项CuCu（Mass-transfer termMass-transfer term
13、） 因传质阻力的存在，使分配不能因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间瞬间”达达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。程不完全相同。 传质阻力项传质阻力项C C包括流动相传质阻力系数包括流动相传质阻力系数C Cm m和和固定相传质阻力系数固定相传质阻力系数C Cs s。)1(32)1(01. 022222lfgplgDdkkDdkkCCC 讨讨 论论F 减小填充颗粒直径减小填充颗粒直径d dp p。F 采用分子量小的流动相，使组分在气相中的扩采用分子量小的
14、流动相，使组分在气相中的扩散系数散系数D Dg g增加。增加。F 减小液膜厚度减小液膜厚度d df f，液相传质阻力系数，液相传质阻力系数C Cl l下降。但下降。但此时此时k k又减小。因此，当保持固定液含量不变时，又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低可通过增加固定液载体的比表面来降低d df f。但比表。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。面过大又会因吸附过强使峰拖尾。F 增加柱温，可增加组分在液相中的扩散系数增加柱温，可增加组分在液相中的扩散系数D Dl l，但但k k值也减小，为保持合适值也减小，为保持合适C Cl l值，应控制柱温。值，应控制柱温。
15、)1(32)1(01. 022222lfgplgDdkkDdkkCCC 当当u u一定时，仅在一定时，仅在A A、B B和和C C较小时，较小时，H H较小，柱较小，柱效较高；反之，则柱效效较高；反之，则柱效较低，色谱峰将展宽。较低，色谱峰将展宽。 以以u u对对H H作图，可得作图，可得H-H-u u曲线（如左图），从该曲线（如左图），从该曲线得到：曲线得到：板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u4.4.流速流速u u由由Van DeemterVan Deemter方程方程 H = A + B/u + CuH = A + B/u + Cu可知可知C/B BC2A
16、涡流扩散项涡流扩散项A A与流速与流速u u无关；无关；低流速区（低流速区（u u小），小），B/uB/u大，分子扩散项占主导大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如，此时选择分子量大的气体如N N2 2和和ArAr为载气，可为载气，可减小扩散，提高柱效；减小扩散，提高柱效；高流速区（高流速区（u u大），大），CuCu大，传质阻力项占主导，大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如此时选择分子量小的气体如H H2 2和和HeHe为载气，可增为载气，可增加扩散系数，提高柱效；加扩散系数，提高柱效；曲线的最低点对应曲线的最低点对应最佳线速（最佳线速（u uoptopt ） 下的下的最小
17、板高最小板高H Hminmin 。H = A + B/u + Cu 单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中的分离情况，需要引进一个综合指标谱柱中的分离情况，需要引进一个综合指标分离度分离度，作为色谱柱总分离效能的指标。，作为色谱柱总分离效能的指标。三、分离度三、分离度（Resolution）R=1.5 R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t, min 是同时反映色谱柱效能和选择性的是同时反映色谱柱效能和选择性的综合性指综合性指标标，也称总分离效能指标或分辨率。定义为：，也称总分离效能指标或分辨率。定义为： 利用此式，可直接从色谱流出曲线上
18、求出分离度利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度 R R越大，相邻组分分离越好。当越大，相邻组分分离越好。当R=1.5R=1.5时，时，分离程度可达分离程度可达99.7%99.7%，R=1.5R=1.5通常用作是否分开的通常用作是否分开的判据。判据。2121)(2)(211212bbRRbbRRWWttWWttR R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t, min 分离度分离度R R是柱的总分离效能指标，既反映两组是柱的总分离效能指标，既反映两组分保留值的差值，即固定液对两组分的选择性分保留值的差值，即固定液对两组分的选择性r r2,12,1的大小（由固定液的热力学性质
19、决定），又考虑的大小（由固定液的热力学性质决定），又考虑到色谱峰宽度对分离的影响，即柱效能到色谱峰宽度对分离的影响，即柱效能n neffeff的高低的高低（取决于色谱过程的动力学因素）。（取决于色谱过程的动力学因素）。 对于相邻的两组分，假设其色谱峰底宽相等对于相邻的两组分，假设其色谱峰底宽相等，即，即W Wb1b1=W=Wb2b2，可导出，可导出R R与与n neffeff、 和和r r2,12,1的关系式的关系式Rt212, 122, 1144effRReffRnttnrRtr 2122211212)(21bRRbRRbbRRWttWttWWttR 222/1)(16)(54. 5bRRe
20、ffeffWtWtHLn 色谱基本分离方程色谱基本分离方程70%CH3OH+30%H2O60%CH3OH+40%H2O50%CH3OH+50%H2O40%CH3OH+60%H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响1：9,10-蒽醌；蒽醌； 2：2-甲基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌； 3：2-乙基乙基-9,10-蒽醌蒽醌4：1,4-二甲基二甲基-9,10-蒽醌；蒽醌； 5：2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-蒽醌蒽醌改变组成改变组成 使使 k 最佳最佳色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，由于分析物
21、组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意。实际工作中采用程序升温（但同时出使其它待测物的分离不令人满意。实际工作中采用程序升温（GC）和梯）和梯度淋洗（度淋洗（LC）来解决这个问题。）来解决这个问题。15-4 15-4 色谱定性定量分析色谱定性定量分析一、定性分析一、定性分析 色谱定性分析就是确定各色谱峰所代表的化合物。色谱定性分析就是确定各色谱峰所代表的化合物。 1.1.利用保留值定性利用保留值定性 （1 1）利用已知物保留值对照定性）利用已知物保留值对照定性 当有待测组分的纯样品时，用当有待测组分的纯样品时，用对照法对照法进行定性进行定性
22、极为简单。用已知物质与未知样对照定性，是色谱极为简单。用已知物质与未知样对照定性，是色谱分析中最可靠的定性方法。分析中最可靠的定性方法。定性依据是保留值定性依据是保留值。 （2 2）相对保留值法）相对保留值法 由于绝对保留值受操作条件的影响较大，重由于绝对保留值受操作条件的影响较大，重复性较差。可采用相对保留值作为定性指标，消复性较差。可采用相对保留值作为定性指标，消除操作条件的影响。相对保留值是某组分除操作条件的影响。相对保留值是某组分i i与基与基准物准物s s的调整保留值的比值：的调整保留值的比值：,R iR ii sR sR stVrtV （3 3）利用双柱保留值法定性）利用双柱保留值
23、法定性 双柱定性是利用两根极性差别较大的色谱柱双柱定性是利用两根极性差别较大的色谱柱对混合物进行分离，然后用纯物质分别在两根柱对混合物进行分离，然后用纯物质分别在两根柱子上进行保留值对照定性。如果得到的结果一致，子上进行保留值对照定性。如果得到的结果一致，即可确定该组分，结果较可靠。即可确定该组分，结果较可靠。2.2.利用文献保留数据定性利用文献保留数据定性 在实际工作中遇到未知试样时，利用文献上在实际工作中遇到未知试样时，利用文献上的保留值定性是一种较为方便的方法。只要文献的保留值定性是一种较为方便的方法。只要文献中所用的固定相和柱温相同，某一组分的相对保中所用的固定相和柱温相同，某一组分的
24、相对保留值和留值和保留指数保留指数都是基本不变的。目前，保留指都是基本不变的。目前，保留指数定性已成为广泛应用的一种色谱定性方法。数定性已成为广泛应用的一种色谱定性方法。3.3.利用选择性检测器定性利用选择性检测器定性 l各种类型的检测器对不同类别的化合物有选择各种类型的检测器对不同类别的化合物有选择性响应。性响应。l火焰光度检测器火焰光度检测器有机物。有机物。l电子捕获检测器电子捕获检测器含电负性强的原子或基团。含电负性强的原子或基团。l氮磷检测器氮磷检测器含氮、磷的化合物。含氮、磷的化合物。4.4.利用与其他仪器联用定性利用与其他仪器联用定性 l色谱与一些结构分析仪器联用，分离、定性色谱与一些结构分析仪器联用，分离、定性分析。分析。l色谱色谱- -质谱质谱l色谱色谱- -红外红外
