1、 第十章第十章DNA的生物合成的生物合成 中心法则中心法则 (The Central Dogma)遗传信息从遗传信息从DNADNA到蛋白质的传递规律到蛋白质的传递规律. .DNADNA的遗传信息转录为的遗传信息转录为RNARNA，RNARNA通过翻译指导合成蛋白质。通过翻译指导合成蛋白质。DNADNA还通过复制将遗传信息代代相还通过复制将遗传信息代代相传。传。19701970年发现年发现RNARNA能逆转录为能逆转录为DNADNA，是对中心法则的补充。，是对中心法则的补充。 DNARNA蛋白质转录复制翻译逆转录逆转录 复制复制 DNADNA的生物合成的生物合成逆转录逆转录 复制（复制（repl
2、ication）：）：以亲代以亲代DNADNA为模板合成两个相同子代为模板合成两个相同子代DNADNA的过程。的过程。DNA双螺旋结构双螺旋结构碱基配对规律碱基配对规律 第一节 复制的特征Parental DNAPossible mechanisms for replication 半保留复制的实验依据半保留复制的实验依据(M. Meselson & F. W. Stahl, 1958)培养于普通培养液继续培养含N -DNA的细菌15第一代第二代 一一. 半保留复制半保留复制 (semiconservative replication) 复制时，亲代的双链复制时，亲代的双链DNA解开成两条单链
3、，解开成两条单链，分别分别作为模作为模板，板，以以dNTP(dATPdNTP(dATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP) )为原料为原料, , 按照碱基配对按照碱基配对(A(AT T、G GC)C)规律与模板上的碱基配对规律与模板上的碱基配对, ,经依赖经依赖DNADNA的的DNADNA聚合聚合酶酶(DNA-pol(DNA-pol) )催化催化, ,合成一条与模板互补的新链合成一条与模板互补的新链, , 新形成的两个新形成的两个子代子代DNADNA分子与亲代分子与亲代DNADNA碱基序列碱基序列完全相同。每个完全相同。每个子代子代DNADNA分子分子中一股单链是从亲代完整
4、地接受过来中一股单链是从亲代完整地接受过来, , 另一股单链是新合成的另一股单链是新合成的, ,故称为半保留复制。故称为半保留复制。 A TG CC GT A亲代DNAA G C TTCGATCGAA G C T子代DNA 半保留复制的意义半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNADNA与亲与亲代代DNADNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性保守性。是物种稳定的分子基础，但是物种稳定的分子基础，但是相对的，不是绝对的。是相对的，不是绝对的。 二二. 双向复制双向复制1. 复制
5、起始点复制起始点 (origin, ori)：多数生物体内多数生物体内DNA分子两条链同分子两条链同时复制。复制是在时复制。复制是在DNA分子的特定位点开始，称为复制起始分子的特定位点开始，称为复制起始点，常用点，常用ori (origin)表示。表示。 原核生物的原核生物的DNA只有一个只有一个Ori位点，位点， 复制从起点开始，到终点结束，完复制从起点开始，到终点结束，完 成整个成整个DNA分子的复制分子的复制,即原核生物即原核生物 的的DNA只有一个复制单位只有一个复制单位,为单复为单复 制子，称为复制体制子，称为复制体。 复制子：能独立完成复制的功能单位。复制子：能独立完成复制的功能单
6、位。 真核生物染色体真核生物染色体DNA有多个复制起始点。同时形成多个复有多个复制起始点。同时形成多个复制单位，从一个制单位，从一个DNADNA复制起始点复制起始点起始的起始的DNA复制区域称复制复制区域称复制子子(replicon) ，每个复制子在一个细胞分裂周期中必须起，每个复制子在一个细胞分裂周期中必须起动而且只能起动一次，真核生物染色体为多复制子。动而且只能起动一次，真核生物染色体为多复制子。 2.2.复制叉复制叉 (replication fork)(replication fork) 复制时，双链复制时，双链DNADNA由起始点处打开，沿两条张开的由起始点处打开，沿两条张开的 单链
7、模板合成单链模板合成DNADNA新链，两侧形成的新链，两侧形成的Y Y型结构称为型结构称为复制叉复制叉(replication fork)(replication fork)。35535353复制方向 3.3.双向复制双向复制 (bidirectional replication)(bidirectional replication) 复制是从一个起始点开始，同时向两个方向复制是从一个起始点开始，同时向两个方向进行，称为进行，称为双向复制双向复制。三三. . 半不连续复制半不连续复制 DNA双螺旋结构的两条链走向相反，复制时两条链都能作双螺旋结构的两条链走向相反，复制时两条链都能作为模板合成子
8、代为模板合成子代DNA。 DNA的新链合成只能沿的新链合成只能沿53方向进行。方向进行。 DNA解链并开始复制后，一条新链合成方向与复制叉移动解链并开始复制后，一条新链合成方向与复制叉移动方向相同，即以方向相同，即以35走向的亲代链为模板，因此该链可沿走向的亲代链为模板，因此该链可沿53方向方向连续合成，连续合成，这条新链称为这条新链称为领头链。领头链。 另一条链合成方向与复制叉移动方向相反，新链不能连续另一条链合成方向与复制叉移动方向相反，新链不能连续合成称为合成称为随从链随从链。随从链的复制必须待模板链解链至一定随从链的复制必须待模板链解链至一定长度才能进行复制，长度才能进行复制，随复制叉
9、延伸过程，可合成许多随复制叉延伸过程，可合成许多DNA片段片段(冈崎片段冈崎片段)，再经连接酶催化形成连续的新链。再经连接酶催化形成连续的新链。 这种领头链连续复制，随从链不连续复制的方式称这种领头链连续复制，随从链不连续复制的方式称DNA复复制的半不连续性。制的半不连续性。 领头链领头链 (leading strand)(leading strand) 顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行 的，得到一条连续的子链。的，得到一条连续的子链。53355解链方向3 随从链随从链 (lagging strand)(lagging strand) 复制方向与
10、解链方向相反，须等解开足够长复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。段所组成。53355解链方向33553 冈崎片段冈崎片段： 19681968年日本生化学者冈崎利用电镜及放射自显影年日本生化学者冈崎利用电镜及放射自显影 技术，观察到技术，观察到DNADNA复制中出现一些不连续的片段复制中出现一些不连续的片段， 因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。 原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸，原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸， 真核生物约为数百个核苷酸。真核生物
11、约为数百个核苷酸。 第二节第二节DNADNA复制的酶学复制的酶学 DNA复制体系复制体系 复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程, ,需要多种物质的共同参与需要多种物质的共同参与: : 底物：底物：dNTP (dATPdNTP (dATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP) ) ； 聚合酶聚合酶(polymerase)(polymerase)：依赖：依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶， 简写为简写为DNA-polDNA-pol或或DDDPDDDP； 模板模板(template)(template)：解开成单链的：解开成单链的DNADNA
12、母链；母链； 引物引物(primer)(primer)：提供：提供3 3 -OH-OH末端的寡核苷酸；末端的寡核苷酸； 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子 一、一、DNA聚合酶聚合酶 催化催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是聚合到核酸链上的酶。是DNA复复制的主要酶。全称叫制的主要酶。全称叫依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或或DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为），均缩写为DDDP。 ( (一一) DNA) DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应1.1. 5
13、5 至至3 3 的聚合活性的聚合活性 催化四种催化四种dNTPdNTP一个一个地接到一个一个地接到DNADNA链上去。链上去。(dNMP)(dNMP)n n + dNTP + dNTP (dNMP) (dNMP)n+1n+1 + PPi + PPi 聚合反应机理聚合反应机理：53OPGOPA模板链CTA35引物3355OHOPGOPAOOHTP模板链CTA35引物333555POOHTPP35 依赖于引物和模板依赖于引物和模板 催化核苷酸聚合有方向性：催化核苷酸聚合有方向性： 5 5 3 3 聚合反应的特点：聚合反应的特点：(1) 以单链以单链DNA为模板为模板(2) 以以dNTP为原料为原料
14、(3) 引物提供引物提供3 -OH(4) 聚合方向为聚合方向为5 3 (5) 形成形成3 - 5 磷酸二酯键磷酸二酯键 2.2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 3 55 外切酶活性：外切酶活性：切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸即时校读即时校读5 5 33 外切酶活性：外切酶活性： 切除引物切除引物 切除突变的片段切除突变的片段C T T C A G G AG A A G T C C G G C G5335 ( (二二) DNA) DNA聚合酶的种类聚合酶的种类1. 1. 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5 5 33 聚合酶活性聚合
15、酶活性+ + + +3 3 55 外切酶活性外切酶活性+ + + +5 5 33 外切酶活性外切酶活性+ +- -功功 能能切除引物切除引物填补空隙填补空隙修复合成修复合成不清不清复制的主复制的主要酶要酶活性最高活性最高 DNA-pol I:单一肽链的大分子，二级结构以单一肽链的大分子，二级结构以-螺旋为主，螺旋为主， 含含AR 18个个-螺旋。螺旋。曾被称为复制酶曾被称为复制酶(replicase)含量最多含量最多功能功能: 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。隙进行填补。proteaseN-terminalC-termin
16、alProtease 小片段（小片段（323 A.A）：具有具有5 3 外切酶活性外切酶活性大片段（大片段（604 A.A）：具有具有5 3聚合活性聚合活性和和3 5 外切酶活性外切酶活性(Klenow 片段片段)是是实验室实验室常用的工具酶。常用的工具酶。可被水解成两个片段可被水解成两个片段 DNA-pol III: 是是E.coli的复制酶，在复制延长中真正起聚合新的复制酶，在复制延长中真正起聚合新链作用的链作用的DNA聚合酶。聚合酶。 由由10种亚基组成的不对称二聚体：种亚基组成的不对称二聚体： 核心酶核心酶 (,):3 5 外切酶活性和外切酶活性和5 3 聚聚合酶活性合酶活性 亚基亚基
17、: sliding clamp protein -复合物复合物: 识别带引物的单链识别带引物的单链DNA，促进全酶，促进全酶组装至模板上，稳定酶结构，增强核心酶活性。组装至模板上，稳定酶结构，增强核心酶活性。 催化效率最高催化效率最高 2. 2. 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 DNA-polDNA-pol 引物酶活性，复制起始引发引物酶活性，复制起始引发 DNA-polDNA-pol 没有其他没有其他DNA-polDNA-pol时才起作用时才起作用 DNA-polDNA-pol 催化线粒体催化线粒体DNADNA的复制的复制 DNA-polDNA-pol 复制中延长子链的主要酶，
18、复制中延长子链的主要酶， 有解螺旋酶活性有解螺旋酶活性 DNA-polDNA-pol 与原核生物的与原核生物的DNA-polIDNA-polI相似，相似， 在复制中起校读、修复和填补在复制中起校读、修复和填补 缺口作用。缺口作用。 (三三) 复制的保真性复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制：至少依赖三种机制：1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3. 复制中的即时校读功能。复制中的即时校读功能。 二、解旋解链酶类二、解旋解链酶类解开并理顺解开并理顺DNADNA双链，维持双链，维持DNADN
19、A 处于单链状态。主要有处于单链状态。主要有解螺旋酶解螺旋酶、 DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶和和单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白。 ( (一一) ) 解螺旋酶解螺旋酶 (helicase(helicase) ) : : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对， 而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNADNA解开成单解开成单 链，它才能起模板作用。链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质， 当时称为当时称为reprep蛋白。作用是蛋白。作用是利用利用ATPA
20、TP供能，解开供能，解开DNADNA 双链。双链。 复制相关蛋白的基因复制相关蛋白的基因：dnaAdnaA、dnaBdnaB、 dnaCdnaC dnaXdnaX相应的表达产物蛋白质：相应的表达产物蛋白质：DnaADnaA、DnaBDnaB、 DnaCDnaC DnaXDnaX DnaDna A A：辨认复制起始位点：辨认复制起始位点 DnaDna B B：解螺旋酶：解螺旋酶 DnaDna C C：辅助解螺旋酶使其在起始点上：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结合并打开双链。结合并打开双链。 ( (二二) ) 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB)(SSB) : :大肠杆菌大肠杆菌SSBSS
21、B是由是由177177个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的 同源四聚体，结合单链同源四聚体，结合单链DNADNA的跨度约的跨度约3232个核苷个核苷 酸单位。酸单位。 SSBSSB与解开的与解开的DNADNA单链紧密结合，防止单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制在复制 中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。 ( (三三) DNA) DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase(topoisomerase) ) 拓扑：拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物是指物体或图像作弹性移位而又保持
22、物 体原有的性质。体原有的性质。 拓扑异构酶拓扑异构酶：是一类可改变：是一类可改变DNADNA拓扑构象的酶。拓扑构象的酶。 对对DNADNA分子的作用是分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键既能水解、又能连接磷酸二酯键 可松弛可松弛DNADNA超螺旋，有利于超螺旋，有利于DNADNA解链。解链。 拓扑异构酶拓扑异构酶I I（topotopo I I）: : 在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 蛋白。蛋白。 主要作用是切开主要作用是切开DNADNA双链中的一股，使双链中的一股，使 DNADNA解链旋转中不打结，解链旋转中不打结，DNADNA变为松弛变为松弛 状态再封闭切口。状态再封闭切口。
23、催化反应不需要催化反应不需要ATPATP。 拓扑异构酶拓扑异构酶IIII（ topotopo II II）: : 在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶(gyrase(gyrase) )。 能切断能切断DNADNA双链，使螺旋松弛。在双链，使螺旋松弛。在ATPATP参参 与下，松弛的与下，松弛的DNADNA进入负超螺旋，再连接进入负超螺旋，再连接 断端。断端。 三、引物酶和引发体三、引物酶和引发体 引物酶引物酶 (primase(primase):): 依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶。聚合酶。 催化催化RNARNA引物的合成。引物的合成。 在大肠杆菌，引物酶是在大肠杆菌，引物酶是
24、dnaGdnaG基因的产物。基因的产物。 RNARNA引物引物：在在DNADNA模板的复制起始部位由引物酶催模板的复制起始部位由引物酶催 化化NTPNTP的聚合，形成短片段的的聚合，形成短片段的RNARNA，为，为DNADNA 聚合提供聚合提供3 3 -OH-OH末端。末端。 引发体引发体 (primosome(primosome):): 是由是由DnaBDnaB、DnaCDnaC等蛋白因子一起形成复合体，等蛋白因子一起形成复合体，再结合引物酶再结合引物酶(DnaG(DnaG) )形成较大的聚合体，结合形成较大的聚合体，结合到模板到模板DNADNA上。上。 复制开始时，在引发体的下游解开双链，
25、复制开始时，在引发体的下游解开双链， 再由引物酶催化引物的合成。再由引物酶催化引物的合成。 四、四、DNADNA连接酶连接酶（DNA ligaseDNA ligase） 连接连接DNADNA链链3 3 -OH-OH末端和相邻末端和相邻DNADNA链链5 5 -P-P末端，形成磷酸二酯键，末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的从而把两段相邻的DNADNA链连接成完整的链。反应需要链连接成完整的链。反应需要ATP/NADATP/NAD+ +。 只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的在的DNADNA或或RNARNA单链。单链。
26、 若若DNADNA两股都有单链缺口，只要缺口前后碱基互补也可连接。两股都有单链缺口，只要缺口前后碱基互补也可连接。 DNA连接酶在连接酶在复制、复制、DNA修复、修复、 重组、剪接重组、剪接中均起中均起缝合缺口缝合缺口作用。作用。 是重要的是重要的工具酶工具酶之一。之一。 第三节第三节DNA生物合成过程生物合成过程 一、原核生物一、原核生物DNADNA的生物合成的生物合成（一）复制的起始（一）复制的起始1. 1. 识别复制起始点识别复制起始点2. 2. 解开解开DNADNA双链：双链： 由拓扑异构酶松弛超螺旋，由拓扑异构酶松弛超螺旋， 解螺旋酶解开双链，解螺旋酶解开双链， SSBSSB结合到单
27、链上使其稳定。结合到单链上使其稳定。3. 3. 形成引发体和生成引物形成引发体和生成引物Genome in E. coliE. coli 复制起始点复制起始点oriC的序列特征的序列特征 三组各三组各13bp的串连重复序列（的串连重复序列（Tandem repeats） 两对两对 9 bp反向重复序列（反向重复序列（inverted repeats）,富含富含AT，是，是 DnaA蛋白的结合部位。蛋白的结合部位。 (1)DnaA(1)DnaA辨认并结合辨认并结合oriCoriC处并使此处并使此区域区域DNADNA解链。解链。(2)DnaB(2)DnaB在在DnaCDnaC协助下解开双链并协助下
28、解开双链并沿解链方向移动，逐渐置换沿解链方向移动，逐渐置换DnaADnaA，SSBSSB结合于解开的单链结合于解开的单链DNADNA上。上。(3)(3)引物酶引物酶DnaGDnaG进入，形成由进入，形成由DnaBDnaB、DnaCDnaC、DnaGDnaG和和DNADNA起始复制区起始复制区构成的构成的引发体。引发体。 (4)(4)引发体的蛋白质在引发体的蛋白质在DNADNA链上链上可以移动可以移动, ,消耗消耗ATPATP。(5)(5)引物酶引物酶DnaGDnaG沿沿5353方方向催化向催化NTPNTP聚合，合成短链聚合，合成短链RNARNA引物。引物。引物长度约为十引物长度约为十几个到几十
29、个核苷酸不等几个到几十个核苷酸不等。(6)(6)聚合酶聚合酶催化第一个催化第一个dNTPdNTP与引物与引物33-OH-OH生成磷酸二生成磷酸二酯键。酯键。(7)(7)拓扑酶作用拓扑酶作用, , 使解链顺利使解链顺利进行。进行。复制的起始大肠杆菌DNA复制的步骤参与复制起始的各种因子参与复制起始的各种因子DnaA蛋白蛋白 辨认起始点辨认起始点解螺旋酶（解螺旋酶（DnaB蛋白，蛋白，rep蛋白）蛋白） 解开解开DNA双链双链DnaC蛋白蛋白 协助解螺旋酶协助解螺旋酶引物酶（引物酶（DnaG蛋白）蛋白） 催化催化RNA引物生成引物生成SSB 稳定解开的单链稳定解开的单链拓扑异构酶拓扑异构酶 理顺理
30、顺DNA链链oriC (245bp的的DNA组分组分) E.coli的复制起始点的复制起始点 名称名称 功能功能 535DNA-pol IIIdCTPdTTPdGTPdATPdTTPdCTPdATPdGTP（二）复制的延长（二）复制的延长 在在DNADNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTPdNTP为原料，进行聚合作用。即新进入的为原料，进行聚合作用。即新进入的dNTPdNTP与引物或延与引物或延长中的子链上长中的子链上3 3 OHOH形成磷酸二酯键，由形成磷酸二酯键，由5 5 3 3 方向延长方向延长子链。子链。 半不连续复制：半不连续复制
31、：（1 1）领头链合成方向与解链方向一致）领头链合成方向与解链方向一致, ,连续合成连续合成（2 2）随从链方向与解链方向相反）随从链方向与解链方向相反, 5, 5 33 不连续合成不连续合成 同一复制叉上，领头链先于随从链复制，同一复制叉上，领头链先于随从链复制， 但两链由同一但两链由同一DNA-polDNA-pol催化合成催化合成 （三）复制的终止（三）复制的终止 原核生物为环状原核生物为环状DNADNA，双向复制，两个复制叉，双向复制，两个复制叉的汇合点就是复制的终点的汇合点就是复制的终点(termination, Ter(termination, Ter) )E.coliE.coli的
32、复制终点的复制终点(32(32位点位点) )位于环形染色体和位于环形染色体和OriCOriC相对处，有特异的相对处，有特异的 终止区序列，刚好把终止区序列，刚好把DNADNA 分成分成2 2个半圆个半圆, ,双向复制双向复制 进行进行180180度后在终点汇合。度后在终点汇合。 随从链不连续片段的连接随从链不连续片段的连接 1.1.引物水解引物水解: :前一个冈崎片段延长至后一片段时前一个冈崎片段延长至后一片段时,DNA-polI,DNA-polI 水解引物；水解引物； 2.2.填补空隙填补空隙:pol:pol利用前一个冈崎片段的利用前一个冈崎片段的3-OH,3-OH,催化催化 dNTPdNT
33、P聚合填补空缺；聚合填补空缺； 3.3.片段连接片段连接:DNA:DNA连接酶连接二个连接酶连接二个DNADNA片段，形成完整的片段，形成完整的DNADNA链。链。 领头链引物水解后的空隙由环状领头链引物水解后的空隙由环状DNADNA最后复制的最后复制的3-OH3-OH末端末端延长填补并连接。延长填补并连接。 复制终止后复制终止后, 2, 2个子代个子代DNADNA分子相互铰链在一起分子相互铰链在一起, ,在拓扑酶在拓扑酶作用下作用下, ,将其分开。将其分开。2222222 22 22 222222223333333333333333333333333333333333333322222223
34、33333333333333333333333333333333333333322222223322222222 22 22 22 22 22 22 2 G1 phase: period growth of cell S phase: DNA合成期合成期 G2 phase: cells prepare for mitosis M phase: mitosis Go phase: nondividing cellsDNA replicate periodically二.真核生物DNA的生物合成真核生物真核生物DNADNA复制的特点复制的特点 真核染色质真核染色质DNADNA结构庞大，结构庞大，D
35、NADNA复制有多个起始点，复制有多个起始点，通过许通过许多独立复制子完成。每个复制子有固定复制起点，双向复多独立复制子完成。每个复制子有固定复制起点，双向复制。制。各起点复制起始不同步。各起点复制起始不同步。 真核生物真核生物DNADNA聚合酶有聚合酶有DNA-polDNA-pol、。DNA-DNA-polpol 在复制延长中起催化作用，在复制延长中起催化作用，有有解螺旋酶活性解螺旋酶活性。DNA-DNA-polpol 有有引物酶活性。引物酶活性。 拓扑异构酶拓扑异构酶 复制因子复制因子(Replication factor, RF): RFA, RFC(Replication factor
36、, RF): RFA, RFC等等. . 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear (Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)antigen,PCNA) 聚合聚合DNADNA速度比原核速度比原核DNA-polDNA-pol慢，但总体速度不慢。慢，但总体速度不慢。 随后链也是不连续合成，冈崎片段比原核细胞的短，只有随后链也是不连续合成，冈崎片段比原核细胞的短，只有数百个核苷酸。数百个核苷酸。真核生物线性染色体真核生物线性染色体: :多个复制起点，复制叉到达下一个起点或分子末端时即终止。多个复制起点，复制叉到达下一个
37、起点或分子末端时即终止。真核真核DNADNA复制的同时复制的同时, ,组蛋白、非组蛋白同时合成组蛋白、非组蛋白同时合成, ,复制完成复制完成后后, , 装配成核蛋白装配成核蛋白, , 组成染色体。组成染色体。DNA ligaseDNA polymeraseRNase HRemove RNA primerFill the gapJoin DNA fragmentsDNA pol DNA ligase 真核生物复制的终止真核生物复制的终止 染色体染色体DNADNA呈线性，复制在末端停止。呈线性，复制在末端停止。35533553不连续片段的连接35533553 端粒与端粒酶端粒与端粒酶 端粒端粒(t
38、elomere)(telomere)是位于真核细胞线性是位于真核细胞线性 染色体末端的特殊结构染色体末端的特殊结构, ,由一段串联由一段串联 重复的富含重复的富含T T、G G的的DNADNA短序列与端粒结合蛋白构成；短序列与端粒结合蛋白构成； 端粒具有稳定染色体，防止末端降解和融合的功能；并维持端粒具有稳定染色体，防止末端降解和融合的功能；并维持 DNADNA复制的完整性。复制的完整性。 端粒端粒DNADNA序列在进化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相序列在进化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相 似，由长似，由长5-10bp5-10bp的重复单位串联而成，人的重复单位串联而成，人类类的重
39、复序列为的重复序列为 TTAGGGTTAGGG，长约长约15kb15kb； 端粒平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短端粒平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短, , 端粒端粒DNADNA逐渐变短而消失逐渐变短而消失, ,可导致染色体稳定性下降，可导致染色体稳定性下降，细胞随细胞随 之衰老。之衰老。端粒酶端粒酶 (telomerase)由由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白复合体，和蛋白质构成的一种核糖核蛋白复合体，RNA分子分子含复制端粒含复制端粒DNA所需的核苷酸模板，其蛋白质部分具有逆转所需的核苷酸模板，其蛋白质部分具有逆转录酶活性。能以自身的录酶活性。能以自身的RNA为
40、模板逆转录合成端粒为模板逆转录合成端粒DNA，维，维持端粒的长度。持端粒的长度。 人类端粒酶含三部分：人类端粒酶含三部分： 端粒酶端粒酶RNA (Human telomerase RNA, hTR)、 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白 (Human telomerase associated protein1, hTP1)、 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶 (Human telomerase reverse transcriptase, hTRT).除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外,大多数正常人体大多数正常人体细胞检测不到端粒酶活性。细胞检测不到端粒酶活性。恶
41、性肿瘤细胞中恶性肿瘤细胞中, 85%90%端粒酶强阳性。端粒酶强阳性。端粒酶可作为端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点肿瘤标志和肿瘤治疗靶点. . 爬行模型：爬行模型： 端粒及端粒酶的意义：端粒及端粒酶的意义： 端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的平的老化老化(aging)(aging)及及肿瘤肿瘤的发生有一定关系。的发生有一定关系。第四节第四节 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式一一. .逆转录病毒和逆转录酶逆转录病毒和逆转录酶 逆转录逆转录 (reverse transcription)(reverse transcription) 以以RNARNA
42、为模板，为模板，dNTPdNTP为原料为原料, ,在逆转录酶催化下在逆转录酶催化下, ,合成与合成与RNARNA互补的互补的DNADNA的过程。的过程。 逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase,(reverse transcriptase,依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶) ) 1. RNA 1. RNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 2. RNA2. RNA水解酶活性水解酶活性 3. DNA3. DNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性3D model of HIV reverse transcriptase3D model of
43、 HIV reverse transcriptase 逆转录过程：逆转录过程：RNA模板单链 DNA双链 DNADNA-RNA杂化双链 逆转录酶催化的逆转录酶催化的DNADNA合成反应也是合成反应也是5 5 33 方向方向。 需要的需要的引物引物是病毒本身的一种是病毒本身的一种tRNAtRNA。1. A retrovirus-specific cellular tRNA hybridizes with a complementary region called the primer-binding site (PBS). 2. A DNA segment is extended from tR
44、NA based on the sequence of the retroviral genomic RNA. 3. The viral R and U5 sequences are removed by RNase H. 4. First jump: DNA hybridizes with the remaining R sequence at the 3 end. 5. A DNA strand is extended from the 3 end. 6. Most viral RNA is removed by RNase H. 7. A second DNA strand is ext
45、ended from the viral RNA. 8. Both tRNA and the remaining viral RNA are removed by RNase H. 9. Second jump: The PBS region of the second strand hybridizes with the PBS region of the first strand. 10. Extension on both DNA strands. LTR stands for long terminal repeat. RNARNA病毒经逆转录成为双病毒经逆转录成为双链链DNADNA，
46、能整合入宿主细，能整合入宿主细胞基因组，并随宿主细胞胞基因组，并随宿主细胞复制和表达复制和表达, ,可能使宿主可能使宿主细胞发生癌变。细胞发生癌变。A typical, minimal retrovirus consists of: 1. an outer envelope which was derived from the plasma membrane of its host 2. many copies of an envelope protein embedded in the lipid bilayer of its envelope 3. a capsid; a protein
47、shell containing 4. two molecules of RNA and 5. molecules of the enzyme reverse transcriptaseHuman Immunodeficiency Virus (HIV)Human Immunodeficiency Virus (HIV) Reverse transcription in virus分子生物学研究可应用逆转录酶合成分子生物学研究可应用逆转录酶合成DNADNA。以以mRNAmRNA为模板，经逆转录合成的与为模板，经逆转录合成的与mRNAmRNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNADNA链，称为链，称
48、为互补互补DNADNA ( complementary DNA,( complementary DNA,cDNAcDNA) )cDNA 二二. . 滚环复制和滚环复制和D D环复制环复制 一些简单低等生物或染色体以外的一些简单低等生物或染色体以外的DNADNA复制的特殊形式。复制的特殊形式。535353D环复制滚环复制线粒体DNA为D环复制D D环复制的特点环复制的特点是复制起点不在是复制起点不在双链双链DNADNA同一位同一位点，内、外环复点，内、外环复制有时序差别制有时序差别 第四节第四节 DNA损伤与修复损伤与修复 突变突变 (mutation)：是指遗传物质结构改变而引起是指遗传物质结
49、构改变而引起 的遗传信息的改变，也称为的遗传信息的改变，也称为DNA损伤损伤 (DNA damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA 分子上碱基的改变。分子上碱基的改变。 一、突变的意义一、突变的意义(一一) 突变是进化、分化的分子基础突变是进化、分化的分子基础进化过程是突变的不断发生所造成的。没进化过程是突变的不断发生所造成的。没有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。遗传有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。遗传学家认为：没有突变就不会有遗传学。学家认为：没有突变就不会有遗传学。大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，叫自发突变或自然突变
50、（叫自发突变或自然突变（spontaneous mutation）。）。 (二二) 突变导致基因型改变突变导致基因型改变这种突变只有基因型的改变，而没有可察这种突变只有基因型的改变，而没有可察 觉的表型改变。觉的表型改变。 多态性多态性 (polymophism)：是用来描述个体：是用来描述个体 之间的基因型差别现象。利用之间的基因型差别现象。利用DNA多态性多态性 分析技术，可识别个体差异和种、株间差分析技术，可识别个体差异和种、株间差 异。异。 (三三) 突变导致死亡突变导致死亡 突变发生在对生命至关重要的基因上，可突变发生在对生命至关重要的基因上，可 导致个体或细胞的死亡。导致个体或细胞
