1、第十章第十章 DNA的的生物合成生物合成 本章重点介绍遗传中心法则和本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。修复、突变和重组作一般介绍。 DNADNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继是绝大多数生物体遗传信息的载体，继19531953年年Watson & CrickWatson & Crick提出提出DNADNA双螺旋结构模型后，双螺旋结构模型后，19581958年，年，CrickCrick提出了提出了“中心法则中心法则”(Central dogma)(Central dogm
2、a)揭示了遗传信息的传递揭示了遗传信息的传递规律。规律。生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆
3、转逆转录录复制复制复制复制DNARNA遗传信息传递的遗传信息传递的 中心法则中心法则 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。中心法则的意义中心法则的意义DNADNA复制复制：以：以DNADNA为模板合成为模板合成D
4、NADNA，遗传信息从亲代细胞向子代细，遗传信息从亲代细胞向子代细 胞传递。胞传递。转录转录：以：以DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA，信息由，信息由DNADNA分子传递至分子传递至RNARNA分子。分子。翻译翻译：以：以mRNAmRNA为模板合成蛋白质，遗传信息表达至蛋白质。为模板合成蛋白质，遗传信息表达至蛋白质。逆转录逆转录：以：以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA。（。（RNARNA病毒，端粒酶）病毒，端粒酶）RNARNA复制复制：以：以RNARNA为模板合成为模板合成RNARNA。 （RNARNA病毒）病毒）第一节第一节 DNADNA的复制（的复制（DNADNA指导
5、下的指导下的DNADNA合成）合成）第二节第二节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复第三节第三节 DNADNA突变突变 第四节第四节 逆转录作用（逆转录作用（RNARNA指导下的指导下的DNADNA的合成）的合成）第五节第五节 DNADNA的遗传重组的遗传重组第十章第十章 DNA的的生物合成生物合成第一节 DNA的半保留复制一一、概念和实验依据概念和实验依据二二、DNA复制有关的酶类复制有关的酶类三、三、DNA的复制的起始点和方式的复制的起始点和方式四、原核细胞四、原核细胞DNA的复制过程的复制过程五、五、DNA复制的忠实性复制的忠实性六、真核细胞六、真核细胞DNA的复制的复制 DNADNA
6、的半保留复制的概念的半保留复制的概念 DNA DNA在复制时，两条链在复制时，两条链解开分别作为模板，在解开分别作为模板，在DNADNA聚合酶的催化下按碱聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成模板链互补的新链，组成新的新的DNADNA分子。这样新形分子。这样新形成的两个成的两个DNADNA分子与亲代分子与亲代DNADNA分子的碱基顺序完全分子的碱基顺序完全一样。由于子代一样。由于子代DNADNA分子分子中一条链来自亲代，另一中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制制方式称为半保留复制。DNA的半保留复制
7、实验依据 19581958年年MeselsonMeselson & Stahl & Stahl用同位素示踪标记加密度梯度离用同位素示踪标记加密度梯度离心技术心技术实验实验, ,证明了证明了DNADNA是采取半保留的方式进行复制是采取半保留的方式进行复制。 1、E.coli在以15N （15NH4Cl）为唯一氮源的培养基中培养，使细菌的亲代DNA中含15N ，具有较高的密度。 2、将生长在15NH4Cl培养基的E.coli转移到以14N （14NH4Cl）为唯一氮源培养基中培养，使得新合成的核苷酸含有轻的同位素14N，密度较低。3、如果DNA是半保留复制，那么E.coli在含有14N氮源介质中复
8、制一轮后分离出的DNA分子应当是14N和15N各占50的杂化分子（一条15N-DNA链和一条14N-DNA链），分子的密度处于14N和15N之间。进行半保留复制第二轮产生的DNA分子中，有一半不含有15N，表现出低密度；另一半是14N和15N各占50的杂化DNA分子，表现出中等密度。通过平衡密度梯度离心，不同密度的DNA分子可以按照它们在铯盐中的浮力彼此分开，密度高的DNA分子出现在离心管的低部，密度最低的出现在离心管的上部，中等密度的位于中部。DNA的半保留复制实验依据（1 1）DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerases)(DNA polymerases)（2 2）引物酶）引物
9、酶(primase(primase) ) ：启动：启动RNARNA引物引物链的合成。链的合成。 (3 (3） DNADNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）（4 4）DNADNA解链酶解链酶(DNA helicase(DNA helicase) ) (5 (5）单链结合蛋白）单链结合蛋白(single-strand (single-strand binding protein, SSB)binding protein, SSB)：结合在解开的：结合在解开的DNADNA单链上，防止重新形成双螺旋。单链上，防止重新形成双螺旋。 (6 (6）拓扑异构酶）拓扑异构酶(topoi
10、somerase(topoisomerase): ):兼具兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将内切酶和连接酶活力，能迅速将DNADNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。态，便于解链。解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引引物物引物酶引物酶和引发和引发体体DNA聚合聚合酶酶ISSB3 3 5 3 5 5 RNA引物引物DNA复制酶系总览拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶和单链结合蛋白的作用引物酶合成RNA引物连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATPAMP+PPiATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPPOHTGGATCGP
11、TTPPPA A CCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链DNA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应5 RNA引物引物子链3 3 5 模板链DNADNA聚合酶的聚合酶的3 - 5 外切酶水解位点外切酶水解位点3 3 5 5 错配碱基错配碱基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点DNA聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点单链缺口单链缺口5 大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNADNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶作用聚合酶
12、作用3 -5 核酸核酸外切酶作用外切酶作用5 -3 核酸核酸外切酶作用外切酶作用转化率转化率DNA聚合酶聚合酶109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+-50比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶切除引物切除引物修复修复修复修复复制复制功能功能 1999年发现聚合酶年发现聚合酶 和和，它们涉及，它们涉及DNA的错误倾的错误倾向修复（向修复（errooune repair）DNADNA聚合酶聚合酶I I水解引物并填补空缺水解引物并填补空缺大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两
13、个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化复制起始与方向复制起始与方向DNA的双向和单向复制的双向和单向复制环状环状 DNA复制时复制时所形成的所形成的结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制半不连续复制半不连续复制原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体D
14、NA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5 RNA引物引物3 3 大肠杆菌大肠杆菌复制起点复制起点OriC成串排列的重复序列成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型聚合酶聚合酶III核心酶核心酶大肠杆菌复制体大肠杆菌复制体结构示
15、意图结构示意图聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶RNA引物引物引发体引发体拓扑异构酶拓扑异构酶II -夹子夹子 -聚体聚体 -夹子夹子 -复合物复合物RNA引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物体引物体引物体引物体解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体复制的终止复制的终止oric复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复
16、制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶连锁染色体连锁染色体DNA复制过程半保留复制有特定的起点需要RNA作为引物，以后引物被切除，补上DNADNA合成方向是53复制可以是单向，也可以是双向，但速度不一定相等半不连续复制，有前导链和后滞链之分DNA复制过程基本特点 DNADNA复制过程是一个高度精确的过程，大肠杆菌复制过程是一个高度精确的过程，大肠杆菌DNADNA复制复制5 5 10109 9碱基对仅出现一个误差，保证复制忠碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点实性的原因主要有以下三点: :DNADNA聚合酶的高度专一性（严格遵循聚合酶的高度专一性（严格
17、遵循 碱基配对原则，但错配率为碱基配对原则，但错配率为7 7 1010-6 -6 ）DNADNA聚合酶的校对功能（错配碱基被聚合酶的校对功能（错配碱基被 3-5 3-5 外切酶切除）外切酶切除） 起始时以起始时以RNARNA作为引物作为引物DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸起始时以RNA作为引物的作用 DNADNA复制为什么要合成一个复制为什么要合成一个RNARNA引物，而后引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证又把这个引物消除呢？这是保证DNADN
18、A聚合过程高聚合过程高度精确的又一措施。度精确的又一措施。DNA DNA 聚合酶具有聚合酶具有3 35 5 外切外切酶功能，以校对复制过程中的核苷酸酶功能，以校对复制过程中的核苷酸，也就是说，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始酸来开始DNADNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时暂时”的，当的，当DNADNA开始聚合以后再以开始聚合
19、以后再以5 53 3 外切外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。之，确保复制的忠实性。真核细胞真核细胞DNADNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点 DNA DNA与细胞周期一致与细胞周期一致 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 端粒（端粒（telemeretelemere）复制）复制真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA复制导致端粒缩短端粒酶（端粒酶（telomerasetelomerase） DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可
20、能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型3 5 TTTT
21、GGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTAAAACCCC AAAA
22、CCCC AAAACCCCT n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸真核和原核DNA细胞复制比较第二节 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于用于DNA，造成，造成DNA结构和功能的破坏，称为结构和功能的破坏，称为DNA的损的损伤。伤。DNA的修复主要有以下类型的修复主要有以下类型:五、应急反应（五、应急反应（SOSSOS修复）和易错修复修复）和易错修复二、直接修复光复活酶修复二、直接修复光复活酶修复三、切除修复三、切除修复四、重组修复四、重组修
23、复暗修复暗修复 一、错配修复一、错配修复错配修复系统能识别错配修复系统能识别DNADNA新旧链新旧链Ecoli DNA的错配修复Ecoli DNA的错配修复1、形成嘧啶二聚体2、光复活酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放DNA紫外线损伤的光复活酶修复直接修复紫外线损伤的光复活酶修复直接修复切除修复（复制前修复）DNA的重组修复（复制后修复）的重组修复（复制后修复）胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体二聚体复制复制核酸酶及核酸酶及重组蛋白重组蛋白修复复制修复复制DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶重组重组应急反应（应急反应（ SOS SOS ）和易错修复）和易错修复 定义：许多造成DNA损伤或
24、抑制复制处理均能引起引起一系列复杂的诱导效应，称应急反应（SOS response） 特点：DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA复制方式。修复结果只能维持基因组的完整性，提高细胞的存活率，但留下的错误较多，故又称错误倾向修复，使细胞有较高的突变率。DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 DNA DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNADNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传表现出异常的遗传特性，称为特性，称为DNADNA的突变。它包括由于的突
25、变。它包括由于DNADNA损伤和错配得不到修复而引损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同起的突变，以及由于不同DNADNA分子之间的交换而引起的遗传重组。分子之间的交换而引起的遗传重组。二、诱变剂的作用 碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料(intercalation dye) 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation)一、突变的类型 碱基对的置换(substitution) 移码突变(framesshift mutation) DNA突变的类型突变的类型诱变剂对DNA的作用 一、概念一、概念二
26、、逆转录酶：二、逆转录酶：Temin等等1970年从致癌年从致癌RNA病毒中发现病毒中发现三、病毒逆转录过程病毒逆转录过程四四、逆转录的生物学意义逆转录的生物学意义扩充了中心法则扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解有助于对病毒致癌机制的了解逆转录酶是分子生物学重要工具酶逆转录酶是分子生物学重要工具酶三种功能三种功能依赖依赖DNA指导下的指导下的DNA聚合酶活力聚合酶活力依赖依赖RNA的的DNA聚合酶活力聚合酶活力核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA，这，这与通常转录过程中遗传信息与通常转录过程中遗传信息从从DNADNA到到RNARNA的方向相反，
27、故的方向相反，故称为逆转录作用。称为逆转录作用。逆转录过程中逆转录过程中cDNA的合成的合成依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸核糖核酸酶酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期RNA衣壳衣壳被膜被膜逆转逆转录酶录酶转录转录转译转译整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞进入细胞丢失被膜丢失被膜丢失衣壳丢失衣壳逆转录逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋白衣壳蛋白被膜蛋白被膜蛋白逆转录酶逆转录酶1、试述遗传中心法则的主要内容，该法则的揭示在生命科学的发展中有何意义？2、如何证明DNA的复制是半保留复制？3、试述原核生物DNA复制所需要的蛋白质及其功能特点？4、DNA复制的高度准确性是通过什么来实现的？半保留复制半保留复制 复制叉复制叉 前导链前导链滞后链滞后链 冈崎片段冈崎片段复制体复制体 思 考 题
