1、重庆医药高等专科学校药物分析教研室重庆医药高等专科学校药物分析教研室张亚红张亚红 项目项目8 8 葡萄糖注射液的无菌检查葡萄糖注射液的无菌检查观看观看“欣弗欣弗”事件视频事件视频案例引入案例引入案例剖析案例剖析药物制剂的卫生学检查意义药物制剂的卫生学检查意义1确定药物是确定药物是否污染或其否污染或其污染程度，污染程度，控制药品的控制药品的质量；质量；2保证用药的保证用药的有效性和安有效性和安全性；全性；3可作为衡量可作为衡量药品生产全药品生产全过程卫生水过程卫生水平的根据之平的根据之一。一。药物制剂的卫生学检查两种情况药物制剂的卫生学检查两种情况无菌检查无菌检查微生物限度检查微生物限度检查提纲
2、提纲 概述概述 检查环境要求 常见检验品种 培养基 培养基的适用性检查 稀释液以及冲洗液 方法验证试验 供试品的无菌检查 一、概述一、概述（一）定义（一）定义系指用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。正确进行样品采集（取样量及比例按药典正确进行样品采集（取样量及比例按药典规定）规定）严格进行无菌操作严格进行无菌操作无菌操作工作区与工作台面必须进行洁净无菌操作工作区与工作台面必须进行洁净度验证度验证（二）无菌检查的基本原则（二）无菌检查的基本原则 无菌检查是利用无菌操作的方法，将被检查的无菌检查是利用无菌操作的方法，将被
3、检查的药品分别加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体药品分别加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体培养基中，置于适宜温度下培养一定时间后，观察有培养基中，置于适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断药品是否合格。无微生物生长，以判断药品是否合格。 污染的检出率要比实际产品的污染率低得多。污染的检出率要比实际产品的污染率低得多。（三）无菌检查的原理（三）无菌检查的原理 例如，在一批药品中，染菌部分占例如，在一批药品中，染菌部分占1010，任抽取一份样品，任抽取一份样品，其染菌概率为，其染菌概率为P P0.10.1，未染菌概率，未染菌概率q q1 10.10.10.90.9，任抽取，任
4、抽取两份样品，都染菌的概率为两份样品，都染菌的概率为P P2 20.010.01，均未染菌的概率为，均未染菌的概率为q q（1 1P P）2 20.810.81。检查时，若取。检查时，若取n n个样品，则均无菌的概率为个样品，则均无菌的概率为q q（1 1P P）n n。（三）无菌检查的原理（三）无菌检查的原理取样数量增加，取样数量增加，该批药品通过该批药品通过无菌检查的概无菌检查的概率降低！率降低！ 无菌检查是根据某批产品中部分样品的抽检结果，无菌检查是根据某批产品中部分样品的抽检结果，推断整体的灭菌情况，涉及统计学方法的应用。推断整体的灭菌情况，涉及统计学方法的应用。 在少量染菌（即在少量
5、染菌（即P P很小时），无菌检查法就不能检很小时），无菌检查法就不能检验出来。所以，无菌检查必须按照验出来。所以，无菌检查必须按照中国药典中国药典规定规定的步骤进行。的步骤进行。 （三）无菌检查的原理（三）无菌检查的原理 二、检查环境及人员要求二、检查环境及人员要求 无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净度1000010000级和局部洁净度级和局部洁净度100100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。全过程必须严格遵守无菌操作。无菌检查人员必须具全过程必须严格遵守无菌操作。无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。在进入无备微生物专业知
6、识，并经过无菌技术培训。在进入无菌室前，除按要求更换工作服外，还应严格按照无菌菌室前，除按要求更换工作服外，还应严格按照无菌室有关规定进行操作，保持环境的无菌状态。室有关规定进行操作，保持环境的无菌状态。 GMPGMP空气洁净度标准空气洁净度标准洁净洁净度级度级别别悬浮粒子最大允许数悬浮粒子最大允许数/m3浮游浮游菌菌cfu/m3沉降沉降菌菌90mmcfu/4h表面微生物表面微生物静态静态动态动态接触接触55mmcfu/碟碟5指手套指手套cfu/手套手套0.5m5.0m0.5m5.0mA级级352020352020 1 1 1 1B级级352029352 000290010555C级级352
7、00029003 520 00029 0001005025D级级3 520 00029 000不作规不作规定定不作规不作规定定20010050三、常见检验品种三、常见检验品种注射剂注射剂 (水针、粉针、油乳注射剂）眼用以及外伤用制剂眼用以及外伤用制剂（眼科手术、烧伤、严重创伤面给药制剂）无菌封装的原料药无菌封装的原料药医疗器具和医用材料医疗器具和医用材料（可吸收的止血剂、外伤用脱脂棉、纱布、可被吸收的羊肠线及一次性注射器、博士伦等） （一）培养基的概念：（一）培养基的概念： 由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质。积累代谢产物用
8、的营养基质。培养基的培养基的必备条件必备条件营养物的浓度与比例应恰当营养物的浓度与比例应恰当适宜的酸碱度适宜的酸碱度适当的物理状态适当的物理状态本身必须是无菌的。本身必须是无菌的。四、培养基四、培养基 （二）培养基的配制程序：（二）培养基的配制程序：称量称量加水加水加热溶解加热溶解补足水分补足水分调节调节pHpH分装分装包扎、标记包扎、标记高压灭菌高压灭菌需氧菌、厌氧菌培养基需氧菌、厌氧菌培养基真菌培养基真菌培养基无菌检查用培养基无菌检查用培养基（三）（三）无菌检查的培养基无菌检查的培养基硫乙醇酸硫乙醇酸盐流体培养基盐流体培养基 3035 红色氧化层（h深度的1/5） 100水浴加热除去氧化层
9、， 时间不超过20分钟 灭菌后放置3天 沸水浴，10分钟后改良马丁培养基改良马丁培养基 2328无菌性检查无菌性检查 每批培养基随机取不少于每批培养基随机取不少于5 5支（瓶），培养支（瓶），培养1414天，应天，应无菌生长。无菌生长。灵敏度检查灵敏度检查 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 12ml12ml，9 9支，支，4 4种菌，种菌，3030 35 35 培养培养3 3天。天。 改良马丁培养基改良马丁培养基 9ml9ml，5 5支，支，2 2种菌，种菌，2323 28 28 培养培养5 5天。天。 结果判断：空白管应无菌生长结果判断：空白管应无菌生长, ,加菌管均生长良好。加菌管
10、均生长良好。菌液制备菌液制备（100 cfu/ml 100 cfu/ml 的菌悬液）的菌悬液）五、培养基的适用性检查五、培养基的适用性检查 181.1.菌种要求菌种要求 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 5 代。代。 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 生孢梭菌生孢梭菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉五、培养基的适用性检查五、培养基的适用性检查 19 2. 2.菌液制备菌液制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液生孢梭菌菌液生孢梭菌菌
11、液白色念珠菌菌液白色念珠菌菌液黑曲霉菌菌液黑曲霉菌菌液五、培养基的适用性检查五、培养基的适用性检查 3. 3.培养基接种培养基接种 取每管装量为取每管装量为12ml12ml的硫乙醇酸盐流体培养基的硫乙醇酸盐流体培养基9 9支，分别接种支，分别接种小于小于100cfu100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各生孢梭菌各2 2支，另支，另1 1支不接种作为空白对照，培养支不接种作为空白对照，培养3 3天；取每管天；取每管装量为装量为9ml9ml的改良马丁培养基的改良马丁培养基5 5支，分别接种小于支，分别接种小于100cfu1
12、00cfu的白色念的白色念珠菌、黑曲霉各珠菌、黑曲霉各2 2支，另支，另1 1支不接种作为空白对照，培养支不接种作为空白对照，培养5 5天。逐天。逐日观察结果。日观察结果。 五、培养基的适用性检查五、培养基的适用性检查 4. 4.结果判断结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 五、培养基的适用性检查五、培养基的适用性检查 灵敏度检查结果灵敏度检查结果 硫硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查试验乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查试验生孢梭菌生孢梭菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌
13、 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 六、稀释液以及冲洗液六、稀释液以及冲洗液0.1%0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 稀释液稀释液 如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤pH7.0pH7.0氯化钠氯化钠- -蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液 稀释液稀释液聚山梨酯聚山梨酯80-0.1%80-0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 非水溶液制剂非水溶液制剂供试品的冲洗供试品的冲洗十四烷酸异丙酯十四烷酸异丙酯 膏剂和粘性油剂的溶剂膏剂和粘性油剂的溶剂 七、方法学验证试验七、方法学验证试验何时须进行方法学验证何时须进行方法学验证 当供试品为新的产品时当供试品为新的产品时 当供试品
14、的组分、检验条件发生改变时当供试品的组分、检验条件发生改变时验证用菌株：验证用菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌种要求菌种要求：不得超过：不得超过5 5代代加菌量加菌量：100cfu100cfu取样量取样量：只需确定总检验量即可：只需确定总检验量即可课堂互动：培养基适课堂互动：培养基适用性检查中也用到了用性检查中也用到了6种标准菌株，和方种标准菌株，和方法学验证所要用到的法学验证所要用到的有何不用？有何不用？无菌检查方法无菌检查方法检查方法检查方法 薄膜薄膜过滤过滤法法 直接直接接
15、种接种法法 薄膜过滤法薄膜过滤法 取规定量供试品按薄膜过滤取规定量供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于冲洗液中加入小于100cfu100cfu的试的试验菌，过滤。取出滤膜接种至验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培菌，作为对照。置规定温度培养养3 35 5天。各试验菌同法操作天。各试验菌同法操作。七、方法学验证试验七、方法学验证
16、试验直接接种法直接接种法 取硫乙醇酸盐流体培养基取硫乙醇酸盐流体培养基8 8管，分别两两接入小于管，分别两两接入小于100cfu100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌；另取改良马丁培养基菌；另取改良马丁培养基4 4管，分别两两接入小于管，分别两两接入小于100cfu100cfu的的白色念珠菌、黑曲霉。两相同菌种管中，白色念珠菌、黑曲霉。两相同菌种管中，1 1管接入规定量的管接入规定量的供试品，另供试品，另1 1管作为对照，置规定温度培养管作为对照，置规定温度培养3 35 5天。天。 l培养基装量要求培养基装量要求 每个
17、容器中接种的供试品体积不得大于培养基体积的每个容器中接种的供试品体积不得大于培养基体积的1010 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基15ml/15ml/管管 改良马丁培养基改良马丁培养基10ml/10ml/管管七、方法学验证试验七、方法学验证试验结果判断结果判断若含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则该检验条件下有抑菌作用。与对照管比较,若含供试品各容器中的试验菌生长良好， 则该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，照此检查方法进行供试品的无菌检查；七、方法学验证试验七、方法学验证试验八、供试品的无菌检查八、供试品的无菌检查 明确检验数量与检验量明确检验数量与检验量
18、检验数量是指一次试验所用供试品最小包装检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。容器的数量。 检验量检验量 是指一次试验所用的供试品总量（是指一次试验所用的供试品总量（g g 或或mlml）。）。根据供试品的情况，确定检样数量根据供试品的情况，确定检样数量 批出厂批出厂oror上市抽检；（出厂产品表上市抽检；（出厂产品表1 1；上市；上市产品表产品表2 2、表、表3 3） 液体制剂液体制剂oror固体制剂；（液体表固体制剂；（液体表2 2；固体表；固体表3 3） 直接接种法直接接种法oror薄膜过滤法薄膜过滤法（一）检验量与检验数量（一）检验量与检验数量表表1 1 批出厂产品最少检验数
19、量批出厂产品最少检验数量 供试品供试品批产量批产量N N（个）（个）最少检验数量最少检验数量注射剂注射剂1001001010或或4 4个（取较多者）个（取较多者）100100N N5005001010个个5005002 2或或2020个（取较少者）个（取较少者）大体积注射液（大体积注射液（100ml100ml）2 2或或1010个（取较少者）个（取较少者）眼用及其他非注射产品眼用及其他非注射产品2002005 5或或2 2个（取较多者）个（取较多者）2002001010个个桶装固体原料桶装固体原料4 4每个容器每个容器4 4N N50502020或或4 4个容器（取较多者）个容器（取较多者）5
20、0502 2或或1010个容器（取较多者）个容器（取较多者）抗生素原料药（抗生素原料药（5g5g）6 6个容器个容器医疗器具医疗器具1001001010或或4 4件（取较多者）件（取较多者）100100N N5005001010件件5005002 2或或2020件（取较少者）件（取较少者）表表2 液体制剂最少检验用量及上市抽验样品的最少检验数量液体制剂最少检验用量及上市抽验样品的最少检验数量 供试品装量供试品装量V V（mlml）每支供试品接入每每支供试品接入每种培养基的最少量种培养基的最少量供试品最少检验数量供试品最少检验数量（瓶或支）（瓶或支）1 1全量全量1010* *1 1V V5 5
21、半量半量10105V5V20202ml2ml101020V20V50505ml5ml101050V50V10010010ml10ml101050V50V100100（静脉给药（静脉给药）半量半量1010100V500100V500半量半量6 6500500500ml500ml6 6* *表表3 固体制剂最少检验用量及上市抽验样品的最少检验数量固体制剂最少检验用量及上市抽验样品的最少检验数量 供试品装量供试品装量M M每支供试品接入每每支供试品接入每种培养基的最少量种培养基的最少量供试品最少检供试品最少检验数量（瓶或验数量（瓶或支）支）M M50mg50mg全量全量101050mgM50mgM3
22、00mg300mg半量半量1010300mgM300mgM5g5g150mg150mg1010M5gM5g500mg500mg1010外科用敷料棉花及纱布外科用敷料棉花及纱布取取100mg100mg或或1cm1cm3cm3cm1010缝合线缝合线整个材料整个材料1010带导管的一次性医疗器具（如输液带导管的一次性医疗器具（如输液袋）袋）1010其他医疗器具其他医疗器具整个器具整个器具（切碎（切碎或拆散开）或拆散开）1010八、供试品的无菌检查八、供试品的无菌检查阳性对照阳性对照 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品 金金黄色葡萄球菌为对照菌黄色葡萄球菌为对照
23、菌 抗革兰阴性菌为主的供试品抗革兰阴性菌为主的供试品 大肠埃希菌为对大肠埃希菌为对照菌照菌 抗厌氧菌的供试品抗厌氧菌的供试品 生孢梭菌为对照菌生孢梭菌为对照菌 抗真菌的供试品抗真菌的供试品 白色念珠菌为对照菌。白色念珠菌为对照菌。阴性对照阴性对照 取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作。取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作。（二）阳性对照和阴性对照（二）阳性对照和阴性对照1.1.薄膜过滤法薄膜过滤法（1 1）供试品的处理）供试品的处理水溶液供试品水溶液供试品可溶于水的固体制剂供试品可溶于水的固体制剂供试品非水溶性制剂供试品非水溶性制剂供试品可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品可溶于十四烷酸异丙
24、酯的膏剂和粘性油剂供试品内酰胺类抗生素供试品内酰胺类抗生素供试品无菌气（喷）雾剂供试品无菌气（喷）雾剂供试品装有药物的注射器供试品装有药物的注射器供试品具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法 （2 2） 仪器仪器 薄膜过滤法应优先采用薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器封闭式薄膜过滤器，也可采，也可采用一般薄膜过滤器。用一般薄膜过滤器。（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法滤膜孔径应不大于滤膜孔径应不大于 0.45m0.45m，直径约为，直径约为50mm50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。根据供试品及其
25、溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。前应充分干燥。（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为每张滤膜每次冲洗
26、量一般为100ml100ml，总冲洗量不得，总冲洗量不得超过超过1000ml1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。，以避免滤膜上的微生物受损伤。（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（3 3）操作过程）操作过程Selling margin ContributionSales改良马丁培养基改良马丁培养基EffectivenessContribution Available selling time 薄膜过滤薄膜过滤法法三联集菌器三联集菌器供试品供试品+ +硫乙醇酸硫乙醇酸盐培养基盐培养基供试品供试品+ +硫乙醇酸硫乙醇酸盐培养基盐培养基+ +阳性菌阳性菌供试
27、品供试品+ +改良马改良马丁培养基丁培养基硫乙醇酸盐培养硫乙醇酸盐培养基基二联集菌器二联集菌器改良马丁培养基改良马丁培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基阳性对照阳性对照培养培养观察结果，观察结果，写检验记录写检验记录取规定量取规定量供试品供试品预处理预处理滤膜滤膜过滤过滤冲洗冲洗滤膜滤膜（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（3 3）操作流程）操作流程阴性对照阴性对照 （4 4）培养及观察）培养及观察 接规定的温度培养接规定的温度培养1414天。培养期间应逐日观察并记录天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊如在加入供试品后
28、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养，培养1414天后，不能从外观上判断有无微生物生长，天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养养2 2天、真菌培养天、真菌培养3 3天，观察接种的同种新鲜培养基是天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。是否有菌。 （三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（1 1）供试品的处理与接种）供试品的处理与接种混悬液等非澄清水溶液供试品混悬液等非澄清水溶液供试品固体制剂供试品固体制剂供试品非水
29、溶性供试品非水溶性供试品敷料供试品敷料供试品肠线、缝合线等供试品肠线、缝合线等供试品灭菌医用器具供试品灭菌医用器具供试品放射性药品放射性药品2.2.直接接种法直接接种法（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法 接种量接种量 培养基培养基项目项目好氧、厌氧菌培养好氧、厌氧菌培养真菌培养真菌培养硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基改良马丁培养基供试品：供试品：每种培养基各若干支每种培养基各若干支（与检查数量有关）（与检查数量有关）若干若干mlml（与装量有关）（与装量有关）若干若干mlml（与装量有关）（与装量有关）阳性对照：阳性对照：供试品阳性对照菌菌液供试品阳性对照菌菌液若干若干
30、mlml（供试品）（供试品）+ +1.0ml1.0ml（菌液）（菌液）或：若干或：若干ml (ml (供试品供试品) )+ 1.0ml+ 1.0ml（菌液）（菌液）阴性对照阴性对照若干若干mlml稀释液稀释液若干若干mlml稀释液稀释液培养温度培养温度3030353523232828培养时间培养时间1414天（阳性对照天（阳性对照48487272小时）小时）（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法2.2.直接接种法直接接种法（2 2）培养与观察）培养与观察（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（3 3）注意点：）注意点：接种量不得大于培养基体积的接种量不得大于培养基体积的10%10%；硫乙醇酸盐液体
31、培养基不得少于硫乙醇酸盐液体培养基不得少于15ml15ml改良马丁培养基不得少于改良马丁培养基不得少于10ml10ml若有抑菌作用，加中和剂或灭活剂若有抑菌作用，加中和剂或灭活剂硫乙醇酸盐流体培养基于硫乙醇酸盐流体培养基于30303535培养培养1414天天 改良马丁培养基于改良马丁培养基于23232828均培养均培养1414天天 2.2.直接接种法直接接种法（三）无菌检查方法（三）无菌检查方法（四）结果判断（四）结果判断供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。生长，判供试品符合规定。 供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，供试品管
32、中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。判供试品不符合规定。 当符合下列至少一个条件时，可判试验结果当符合下列至少一个条件时，可判试验结果无效。并取同量供试品重试。无效。并取同量供试品重试。 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：果无效： 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；无菌检查法的要求；回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；阴性对照管有菌生长；阴性对照管有菌生长；供试品管中生长的微生物经鉴
33、定后，确证是因无菌试验中供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。（四）结果判断（四）结果判断 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。定；若有菌生长，判供试品不符合规定。（四）结果判断（四）结果判断1.1.所有阳性菌的操作均不得在无菌区域进行，以防所有阳性菌的操作均不得在无菌区域进行，以防止交叉污染；止交叉污染；2.2.培养基应
34、每批进行灵敏度检查，合格后方可使用培养基应每批进行灵敏度检查，合格后方可使用。培养基应进行适用性检查，包括灵敏度和无菌性。培养基应进行适用性检查，包括灵敏度和无菌性检查。检查。3.3.无菌检查所用的菌株应符合相关规定，并应采用无菌检查所用的菌株应符合相关规定，并应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。生物学特性。（五）注意事项（五）注意事项4.4.无菌检查法应进行方法学的验证，以证明所采用的方无菌检查法应进行方法学的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检
35、验条件发生改变时，检查方法应重新验证。件发生改变时，检查方法应重新验证。5.5.进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。微生物带入无菌检验室。6.6.用集菌仪进行薄膜过滤时，注意培养器的针头部分不用集菌仪进行薄膜过滤时，注意培养器的针头部分不要污染。要污染。（五）注意事项（五）注意事项7.7.供试品的抽验数量和接种量应符合规定。供试品的抽验数量和接种量应符合规定。8.8.应正确判断检查结果。应正确判断检查结果。9.9.对不同种
36、类和不同批次的产品，在拆包装及夹取样对不同种类和不同批次的产品，在拆包装及夹取样品时，应更换实验用具，以避免交叉污染。品时，应更换实验用具，以避免交叉污染。10.10.出具实验结果后，所有培养物须经出具实验结果后，所有培养物须经121121高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌3030分钟的处理。分钟的处理。 （五）注意事项（五）注意事项学习小结学习小结1234培养基应适培养基应适合需氧菌、合需氧菌、厌氧菌或真厌氧菌或真菌的生长，菌的生长，其配方和制其配方和制备方法应严备方法应严格按照格按照中中国药典国药典来来执行。执行。培养基的培养基的适用性检适用性检查包括无查包括无菌性检查菌性检查及灵敏度及灵敏度检查。
37、检查。 供试品的供试品的抽验数量抽验数量和接种量和接种量必须符合必须符合2010年版年版中国药中国药典典的规的规定。定。供试品供试品的无菌的无菌检查包检查包括薄膜括薄膜过滤法过滤法和直接和直接接种法。接种法。4供试品供试品的无菌的无菌检查包检查包括薄膜括薄膜过滤法过滤法和直接和直接接种法。接种法。5无菌检查的结无菌检查的结果应为空白对果应为空白对照管无菌生长，照管无菌生长，加菌的培养基加菌的培养基管生长良好，管生长良好，阳性对照管生阳性对照管生长良好，阴性长良好，阴性对照管不得有对照管不得有菌生长，供试菌生长，供试品管澄清或证品管澄清或证明无菌生长。明无菌生长。无菌检查标准操作视频实训实训 葡
38、萄糖注射剂的无菌检查葡萄糖注射剂的无菌检查（一）实训目的（一）实训目的1 1掌握常用注射用药的无菌检查法及其掌握常用注射用药的无菌检查法及其结果的判定与分析；结果的判定与分析；2 2熟悉不同类型的药物应采取的微生物熟悉不同类型的药物应采取的微生物学检查方法；学检查方法；3 3了解无菌制剂进行无菌检查的几种常了解无菌制剂进行无菌检查的几种常用培养基。用培养基。 （二）实训原理（二）实训原理 无菌检查法无菌检查法是指检查药物制剂是否含有活的微是指检查药物制剂是否含有活的微生物的一种方法。生物的一种方法。 各种注射剂各种注射剂( (如针剂、输液等如针剂、输液等) )、手术眼科制剂都必须保、手术眼科制
39、剂都必须保证不含有任何活的微生物，证不含有任何活的微生物，应绝对无菌应绝对无菌才算合格。才算合格。 无菌检查是利用无菌操作的方法，将被检查的药品分别无菌检查是利用无菌操作的方法，将被检查的药品分别加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体培养基中，置于加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体培养基中，置于适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断药品是否合格。药品是否合格。（三）材料和用具（三）材料和用具 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003 为阳性对照菌。为阳性对照菌。 硫乙醇酸盐流体培养基，改良
40、马丁培养基。硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基。 无菌注射剂、移液管、滴管、注射器、试管、消毒剂无菌注射剂、移液管、滴管、注射器、试管、消毒剂( ( 碘酒、酒精棉球碘酒、酒精棉球) )、酒精灯等。、酒精灯等。 （四）操作步骤（四）操作步骤 本品采用直接接种法。本品采用直接接种法。 1 1供试品处理供试品处理 取规定量供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养取规定量供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。每个容器中培养基的用基和改良马丁培养基的容器中。每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%10%，同
41、时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml15ml，改，改良马丁培养基每管装量不少于良马丁培养基每管装量不少于10ml10ml。 2 2无菌检查实训操作无菌检查实训操作（1 1）取样）取样 待测药品的抽样方法及不同类型供试品的制备待测药品的抽样方法及不同类型供试品的制备方法，应按照方法，应按照中国药典中国药典的规定进行。本试验药的规定进行。本试验药品为注射剂，可任意抽取品为注射剂，可任意抽取4 4支，用砂轮在安瓿颈部支，用砂轮在安瓿颈部划一环形线，用碘酒、酒精棉球消毒安瓿外表面，划一环形线，用碘酒、酒精棉球消毒安瓿外表面，待干后将其打开。待干后将其打
42、开。 表表 待检无菌制剂接种量和培养基用量待检无菌制剂接种量和培养基用量 无菌药品类型无菌药品类型/ml/ml每支取量每支取量/ml/ml培养基用量培养基用量/ml/ml2 2以下以下0.50.515152 220201.01.015152020以上以上5.05.01515（2 2）接种）接种 用无菌注射器取处理后的供试品，分别加入用无菌注射器取处理后的供试品，分别加入需氧菌、厌氧菌、真菌培养基中，混匀。每种培需氧菌、厌氧菌、真菌培养基中，混匀。每种培养基各接种两管。养基各接种两管。 Your Title Here（3）阳性对照）阳性对照 用用1支无菌移液管分别取上述阳性对照菌菌支无菌移液管分
43、别取上述阳性对照菌菌液液lml，接种于培养基试管中，作为阳性对照。，接种于培养基试管中，作为阳性对照。（4）阴性对照）阴性对照 不加任何菌或加入与供试液相等量的稀释剂不加任何菌或加入与供试液相等量的稀释剂的培养基试管为阴性对照。的培养基试管为阴性对照。 （5 5）培养）培养 将上述试验管、阳性对照管、阴性对照将上述试验管、阳性对照管、阴性对照管按中国药典规定的温度及时间进行培养。管按中国药典规定的温度及时间进行培养。 表表 检查用培养基类型、数量、培养温度及培养时间检查用培养基类型、数量、培养温度及培养时间 培养基类型培养基类型 培养温度培养温度() 培养时间培养时间(天天) 培养基数量培养基
44、数量(个个) 试验管试验管 对照管对照管 需氧菌培养基需氧菌培养基 3035 14 2 2 厌氧菌培养基厌氧菌培养基 3035 14 2 2 真菌培养基真菌培养基 2328 14 2 2 （6 6）结果判定）结果判定阴性对照管：应无菌生长，培养基液体澄清无变阴性对照管：应无菌生长，培养基液体澄清无变化。化。阳性对照管：阳性对照管培养阳性对照管：阳性对照管培养48-7248-72小时应生长良小时应生长良好，各管应变混浊，表明有菌生长。且可涂片、染好，各管应变混浊，表明有菌生长。且可涂片、染色、镜检证实为阳性对照菌。色、镜检证实为阳性对照菌。 试验管：试验管： (1)(1)若三种培养基各管均澄清，
45、或虽混浊，但经证若三种培养基各管均澄清，或虽混浊，但经证实无菌生长，判为供试品符合规定；实无菌生长，判为供试品符合规定； (2)(2)若任何一培养基试管混浊，并经证实有菌生长若任何一培养基试管混浊，并经证实有菌生长，判为供试品不符合规定。除非能充分证明试，判为供试品不符合规定。除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。试验若经确认无效则需重试，重试时重新取同试验若经确认无效则需重试，重试时重新取同量供试品依法检查，若无菌生长，判供试品符量供试品依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。合规定；若有菌生长，判供试
46、品不符合规定。 注意：试验中要与样品管同时注意：试验中要与样品管同时平行做平行做阳性对照和阴性对照。阳性对照和阴性对照。 （五）实训结果（五）实训结果 无菌试验结果记录无菌试验结果记录品名： 注射液 批 号： 规格： 检验日期： 检定依据：检定依据：2010年版中国药典检测环境：检测环境：温度： 湿度： 培养箱（）： 培养箱（）： 培养基种类、温度及装量：培养基种类、温度及装量：液体硫乙醇酸盐培养基（批号： ）：培养需养菌、厌养菌、阳性菌及阴性对照，温度3035，装量100ml。改良马丁培养基（批号： ）：培养真菌，温度2328，装量100ml。营养肉汤培养基（批号： ）：培养对照菌，温度30
47、35，装量10ml。对照菌：对照菌：菌液制备：菌液制备：取对照菌一白金耳，接种于10ml（）培养基内，经3035培养1824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至每毫升小于100个菌，备用。样品处理：样品处理：取样 ，全量通过全封闭式薄膜过滤器过滤后，再分别注入上述培养基，置3035（）及2328（）培养。观察结果如下：（五）实训结果（五）实训结果 培养天数12345678910111213 14硫乙醇酸盐培养基（3035）供试品阴性对照阳性对照改良马丁培 养 基（2328）供试品阴性对照阳性对照结论：结论：检验人： 复核人： 1.1.直接接种法适用于无抗菌作用的供试品的无菌直接接种
48、法适用于无抗菌作用的供试品的无菌检查。检查。2.2.操作中做了供试品接种、阳性对照和阴性对照操作中做了供试品接种、阳性对照和阴性对照实验，同学们都学会了判断试验结果。实验，同学们都学会了判断试验结果。3.3.试验结束后请大家注意，所有的培养物都需经试验结束后请大家注意，所有的培养物都需经过灭菌。过灭菌。（六）实训小结（六）实训小结 （七）思考题（七）思考题 哪些药品制剂需作无菌检验，怎样正确判断实训哪些药品制剂需作无菌检验，怎样正确判断实训结果结果? ? 油剂、抗菌类药物应怎样进行无菌检验油剂、抗菌类药物应怎样进行无菌检验? ? 无菌检验中为什么要作阳性对照试验无菌检验中为什么要作阳性对照试验? ?阳性对照试阳性对照试验出现阴性结果应如何处理验出现阴性结果应如何处理? ?说明原因说明原因? ? 结语
