1、米酒的检验技术及规范操作内容背背 景景1检验依据检验依据2检验项目检验项目3记录及报告记录及报告4背 景总批数总批数合格数合格数不合格数不合格数不合格项不合格项合格率合格率78780/100% 孝感市食品药品检验检测中心米酒检验概况孝感市食品药品检验检测中心米酒检验概况 表表1 2015年度米酒微生物检验汇总表年度米酒微生物检验汇总表米酒检验标准NY/T 1885-2010 NY/T 1885-2010 绿色食品绿色食品 米酒米酒1DB42/T 27-2009 DB42/T 27-2009 孝感米酒孝感米酒23四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编米酒检验
2、标准 NY/T 1885-2010 NY/T 1885-2010 绿色食品绿色食品 米酒米酒适用于各类绿色食品米酒适用于各类绿色食品米酒表表2 2 卫生指标卫生指标项项 目目指指 标标菌落总数菌落总数b，cfu/g50大肠菌群大肠菌群b，MPN/g3致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）球菌、溶血性链球菌）不得检出不得检出商业无菌商业无菌商业无菌商业无菌 a 仅适用于罐头包装产品。仅适用于罐头包装产品。 b 仅适用于非罐头包装产品。仅适用于非罐头包装产品。大肠菌群大肠菌群GB 4789.3-2010沙门氏菌沙门氏菌GB 4789.4-2
3、010溶血性链球菌溶血性链球菌GB 4789.11-2014金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌GB 4789.10-2010菌落总数菌落总数GB 4789.2-2010志贺氏菌志贺氏菌GB 4789.5-2012NY/T 1885-2010 绿色食品绿色食品 米酒米酒米酒检验标准米酒检验标准 DB42/T 27-2009 孝感米酒孝感米酒适用于孝感市孝南区生产的以孝感籼糯为主要原料，经特种酒曲适用于孝感市孝南区生产的以孝感籼糯为主要原料，经特种酒曲发酵，可添加白砂糖、木耳、桂花、红枣等辅料，加工制成的固发酵，可添加白砂糖、木耳、桂花、红枣等辅料，加工制成的固形物小于形物小于48%的孝感米酒饮品。的孝
4、感米酒饮品。米酒检验标准表3 微生物指标项项 目目要要 求求细菌总数细菌总数/（cfu/g） 100大肠菌群大肠菌群/（MPN/100g） 6致病菌（致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌菌、溶血性链球菌）不得检出不得检出大肠菌群大肠菌群GB/T 4789.3-2003沙门氏菌沙门氏菌GB 4789.4-2010溶血性链球菌溶血性链球菌GB 4789.11-2014金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌GB 4789.10-2010菌落总数菌落总数GB 4789.2-2010志贺氏菌志贺氏菌GB 4789.5-2012DB42/T 27-2009 孝感米
5、酒孝感米酒米酒检验标准米酒检验标准 四十九类食品产品生产许可证审查细四十九类食品产品生产许可证审查细则汇编则汇编附件附件34：其他酒生产许可证审查细则（：其他酒生产许可证审查细则（2006版）版）检验项目：检验项目：发证检验、监督检验、出厂检验分别按下表列出的相应检验项目发证检验、监督检验、出厂检验分别按下表列出的相应检验项目进行。出厂检验项目栏中注有进行。出厂检验项目栏中注有“*”标记的，企业应当每年检验标记的，企业应当每年检验2次。次。米酒检验标准序号序号项目名称项目名称发证发证监督监督出厂出厂备注备注9肠道致病菌肠道致病菌*仅对发酵酒仅对发酵酒表表4 产品质量检验项目表产品质量检验项目表
6、菌落总数菌落总数大肠菌群大肠菌群沙门氏菌沙门氏菌志贺氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌检验项目溶血性链球菌溶血性链球菌菌落总数 检验标准：检验标准： GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品安全国家标准 食品食品微生物学检验微生物学检验 菌落总数测定菌落总数测定 菌落总数：菌落总数： 食品检样经过处理，在一定条件下（如食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每后，所得每g检样中形成的微生物菌落总检样中形成的微生物菌落总数。数。菌落总数制备制备1:100样品匀液样品匀液制备制备1:10样品匀液样品匀液制备制备1
7、0倍样品匀液倍样品匀液取样并制备平板取样并制备平板称取称取 25 g 样品置盛有样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质均质 1 min2 min，或放，或放入盛有入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min，制成，制成 1:10 的样品匀液。的样品匀液。 用用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢，沿管壁缓慢注于盛有注于盛有 9 mL
8、 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。的样品匀液。按按 上一步上一步 操作程序，制备操作程序，制备 10 倍倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用换用 1 次次 1 mL 无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。选择选择 2 个个3 个个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释时，
9、吸取倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无空白稀释液加入两个无菌平皿内作菌平皿内作空白对照空白对照。及时将及时将 15 mL20 mL 冷却至冷却至 46 的平板计数琼脂培养基（可放置于的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1 恒温水浴箱中保恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。1 1、样品的稀释、样品的稀释菌落总数菌落总数2、培养、培养2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1
10、 培养培养 48 h2 h。2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖覆盖一薄层一薄层琼脂培养基（约琼脂培养基（约 4 mL），凝固后翻转平板，按），凝固后翻转平板，按 2.1 条件进行培养。条件进行培养。1选取菌落数在选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、之间、无蔓延菌落生长的平板无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌的平板记录具体菌落数，大于落数，大于 300 CFU 的可记录为的可记录为多不可计多不可计。每个稀释度的
11、菌落数应每个稀释度的菌落数应采用两个平板的采用两个平板的平均数平均数。3当平板上出现菌落间当平板上出现菌落间无明显界线的链状生无明显界线的链状生长时，则将长时，则将每条单链每条单链作为一个菌落计数。作为一个菌落计数。2其中一个平板有较大片其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜状菌落生长时，则不宜采用，而应以采用，而应以无片状菌无片状菌落生长落生长的平板作为该稀的平板作为该稀释度的菌落数；若片状释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半又很均匀，即可计算半个平板后乘以个平板后乘以2，代表，代表一个平板菌落数。一个平板
12、菌落数。菌落总数菌落总数3 3、菌落计数、菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。的菌落数量。 菌落计数以菌落形成单位（菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。）表示。菌落总数4、结果与报告、结果与报告4.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法4.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的板菌落数的平均值平均值，再将平均值乘以，再将平均值乘以相应稀释倍数相应稀释
13、倍数，作为每，作为每 g（ mL）样）样品中菌落总数结果。品中菌落总数结果。4.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算计算 N =C /(n1+ 0.1n2)d （1）式中：式中：N样品中菌落数；样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。稀释因子（第一稀释度）。菌落总数 4.2
14、 菌落总数的报告菌落总数的报告4.2.1 菌落数小于菌落数小于 100 CFU 时，按时，按“四舍五入四舍五入”原则修约，以整数原则修约，以整数报告。报告。4.2.2 菌落数大于或等于菌落数大于或等于 100 CFU 时，第时，第 3 位数字采用位数字采用“四舍五入四舍五入”原则修约后，取前原则修约后，取前 2 位数字，后面用位数字，后面用 0 代替位数；也可用代替位数；也可用 10 的指的指数形式来表示，按数形式来表示，按“四舍五入四舍五入”原则修约后，采用原则修约后，采用两位两位有效数字。有效数字。4.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若所有平板上为蔓延菌落而无法计
15、数，则报告菌落蔓延。4.2.4 若若空白对照空白对照上有菌落生长，则此次检测结果上有菌落生长，则此次检测结果无效无效。4.2.5 称重取样以称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位为单位报告。报告。大肠菌群计数 检验标准：检验标准： GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生食品卫生微生物学检验物学检验 大肠菌群测定大肠菌群测定 检验程序见下图检验程序见下图大肠菌群计数 GB 4789.3-2010 食品安全国家标准食品安全国家标准 食品食品微生物学检验微生物学检验 大肠菌群计数大肠菌群计数 大肠菌群大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳：在一
16、定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏革兰氏阴性无芽孢杆菌阴性无芽孢杆菌。包括肠杆菌科的埃希。包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属。雷伯氏菌属。 大肠菌群与肠道致病菌的来源相同，在大肠菌群与肠道致病菌的来源相同，在外界中的生存力接近，在检验方法上，外界中的生存力接近，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行，因也以大肠菌群的检验计数简便易行，因此可作为水、土壤、乳品、食品饮料等此可作为水、土壤、乳品、食品饮料等被粪便污染的被粪便污染的间接指标间接指标。大肠菌群计数 GB 4789.3-2
17、010 第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPN计数法计数法 检验程序如下图检验程序如下图大肠菌群计数 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌革兰氏阴性短杆菌，大小，大小0.513微米。微米。周生鞭毛周生鞭毛，能运动，能运动，无芽孢无芽孢。能发酵多种糖类。能发酵多种糖类产产酸酸、产气产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3。大肠菌群计数液体样品：以无菌吸液体样品：以无菌吸管吸取管
18、吸取25mL25mL样品置盛样品置盛有有225mL225mL磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成中，充分混匀，制成1:101:10的样品匀液。的样品匀液。用用 1 mL 1 mL 无菌吸管或微无菌吸管或微量移液器吸取量移液器吸取 1:101:10 样样品匀液品匀液 1 mL1 mL，沿管壁，沿管壁缓缓注入缓缓注入 9 mL9 mL 磷酸盐磷酸盐缓冲液或生理盐水的无缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换
19、液面），振摇试管或换用用 1 1 支支 1 mL 1 mL 无菌吸无菌吸管反复吹打，使其混合管反复吹打，使其混合均匀，制成均匀，制成 1:1001:100 的的样品匀液。样品匀液。根据对样品污染状况的根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依估计，按上述操作，依次制成次制成十倍十倍递增系列稀递增系列稀释样品匀液。每递增稀释样品匀液。每递增稀释释1 1 次，换用次，换用 1 1 支支 1 1 mL mL 无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得接种完毕，全过程不得超过超过 15 min15 min。 1 1、样品的稀释、样品的稀释大肠菌群计数 2
20、 2、初发酵试验、初发酵试验每个样品，选择每个样品，选择3 3个个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种品可以选择原液），每个稀释度接种3 3管管月桂基硫酸盐胰蛋月桂基硫酸盐胰蛋白胨（白胨（LSTLST）肉汤，每管接种）肉汤，每管接种1mL1mL（如接种量超过（如接种量超过1 mL1 mL，则，则用用双料双料LSTLST肉汤），肉汤），36 36 1 1 培养培养24 h24 h2 h2 h，观察倒，观察倒管内是否有气泡产生，管内是否有气泡产生，24 h24 h2 h2 h产气者进行复发酵试验，产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培
21、养至如未产气则继续培养至48 h48 h2 h2 h，产气者进行复发酵试，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群验。未产气者为大肠菌群阴性阴性。大肠菌群计数 3 3、复发酵试验、复发酵试验用接种环从产气的用接种环从产气的LSTLST肉汤管中分别取培养物肉汤管中分别取培养物1 1环，环， 移种移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLBBGLB）管中，）管中， 36 36 1 1 培养培养48 h48 h2 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性阳性管。管。 4 4、报告、报告按按3 3确证的大肠菌群确证的大肠菌群LSTLST阳性管数，检索
22、阳性管数，检索MPNMPN表（见附录表（见附录B B），报告每），报告每g g（mLmL）样品中大肠菌群的）样品中大肠菌群的MPNMPN值。值。大肠菌群计数大肠菌群 检验标准：检验标准： GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学食品卫生微生物学检验检验 大肠菌群测定大肠菌群测定 检验程序见下图检验程序见下图大肠菌群制备制备1:100样品匀液样品匀液制备制备1:10样品匀液样品匀液制备制备10倍样品匀液倍样品匀液移取样品移取样品以无菌操作将检样以无菌操作将检样25g（mL）放于含有放于含有225mL灭菌生理盐水或其他灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭
23、菌乳钵内，稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以以8000 r/min10000 r/min 的速度处理的速度处理1min，做成，做成1:10的均匀稀释的均匀稀释液。液。 用用 1 mL 无菌吸管吸取无菌吸管吸取 1:10 稀释液稀释液 1 mL，注入含有，注入含有 9 mL 灭菌生理盐灭菌生理盐水或其他稀释液的试管中，振摇试管混合均匀，制成水或其他稀释液的试管中，振摇试管混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。的样品匀液。另取另取1mL灭菌吸管，按
24、上条操作依次做灭菌吸管，按上条操作依次做10倍倍递增稀释液，每递增稀释一次，递增稀释液，每递增稀释一次，换用换用1支支1mL灭菌吸管。灭菌吸管。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个三个稀释度，每个稀释度，接种稀释度，每个稀释度，接种三管三管。 1 1、样品的稀释、样品的稀释大肠菌群 2、乳糖发酵试验、乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上以上者，用者，用双料双料乳糖乳糖胆盐发酵管，胆盐发酵管，1mL及以下及以下者，用者，用单料单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三乳
25、糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置管，置36 1 培养培养 24 h2 h，如所有乳糖胆盐发酵管都，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气不产气，则，则可报告为大肠菌群可报告为大肠菌群阴性阴性，如有，如有产气产气者，则按下列程序进行。者，则按下列程序进行。 3、分离培养、分离培养将产气的发酵管分别转种在将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂平板上，置平板上，置36 1 温箱内，温箱内，培养培养18 h 24 h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。伊红美蓝伊红美蓝琼脂：伊红伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳和美蓝抑制绝大部分革兰
26、氏阳性菌的生长。伊红性菌的生长。伊红Y为酸性染料，美蓝为碱性染料，为酸性染料，美蓝为碱性染料，琼脂是凝固剂。大肠菌群发酵乳糖产酸时，细菌带正琼脂是凝固剂。大肠菌群发酵乳糖产酸时，细菌带正电荷，所以染上伊红电荷，所以染上伊红(红色红色)，再与美蓝结合形成紫黑，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，大部分有金属光泽。色菌落，大部分有金属光泽。大肠菌群 4、证实试验、证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个个进行进行革兰氏染色革兰氏染色，同时接种同时接种乳糖发乳糖发酵管酵管，置，置36 1 培养培养 24 h2 h，观察，观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为产气情
27、况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。阳性。 5、报告、报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的）大肠菌群的MPN值。值。沙门氏菌 沙门氏菌是一种食源性致病菌沙门氏菌是一种食源性致病菌 94%沙门氏菌感染是由于摄食受污染的食品沙门氏菌感染是由于摄食受污染的食品 在养殖动物中广泛存在在养殖动物中广泛存在 常通过动物源性食品传递给人常通过动物源性食品传递给人 是引起食物中毒爆发的主要病原菌之一是引起食物中毒爆发的主要病原菌之一 革兰氏阴性杆菌
28、，通常有鞭毛，不形成芽孢革兰氏阴性杆菌，通常有鞭毛，不形成芽孢沙门氏菌 检验标准：检验标准： GB 4789.4-2010 食品安全国家标准食品安全国家标准 食品微生物学检验食品微生物学检验 沙门氏菌检验沙门氏菌检验 检验程序如下图检验程序如下图沙门氏菌 操作步骤操作步骤1、前增菌、前增菌称取称取 25 g（mL）样品放入盛有样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以的无菌均质杯中，以 8000 r/min10000 r/min 均质均质1 min2 min，或置于盛有，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 mi
29、n2 min。若样品为液态，不需要。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用值，用 1 mol/mL 无菌无菌 NaOH 或或 HCl 调调 pH 至至 6.80.2。无菌操作将样品转至。无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于直接进行培养，于 36 1 培养培养 8 h18 h。如为冷冻产品如为冷冻产品,应在应在 45 以下不超过以下不超过 15 min,或或 2 5 不超过不超过 18 h 解解冻。冻。2、增菌、增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 m
30、L，转种于，转种于 10 mL TTB 内，于内，于 42 1 培养培养 18 h24 h。同时，另取。同时，另取 1 mL，转种于，转种于 10 mL SC 内，于内，于 36 1 培养培养 18 h24 h。沙门氏菌3、分离、分离分别用接种环取增菌液分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 1 分别培养分别培养 18 h24 h （ XLD 琼脂平板、琼脂平板、 HE 琼脂平板、沙琼脂平板、沙门氏菌属显色培
31、养基平板）门氏菌属显色培养基平板） 或或 40 h48 h （ BS 琼脂平板），观察琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见下表各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见下表 。沙门氏菌沙门氏菌分别在沙门氏菌分别在BS、XLD、HE、显色培养基平板上的菌落特征图显色培养基平板上的菌落特征图沙门氏菌 4、生化试验、生化试验 5、血清学鉴定、血清学鉴定 6、结果与报告、结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（ mL）样品）样品中中检出或未检出检出或未检出沙门氏菌。沙门氏菌。志贺氏菌志贺氏菌(Shigella)，也称
32、志贺菌或者痢疾，也称志贺菌或者痢疾杆菌，是一类革兰氏阴性、不活动、不产杆菌，是一类革兰氏阴性、不活动、不产生孢子的生孢子的杆状杆状细菌，可引起人和其他哺乳细菌，可引起人和其他哺乳类动物的细菌性痢疾。类动物的细菌性痢疾。大小为大小为0.50.723m，无芽胞，无荚，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛，膜，无鞭毛，多数有菌毛，革兰氏阴性杆革兰氏阴性杆菌菌。细菌性痢疾简称菌痢。是志贺菌属引起的细菌性痢疾简称菌痢。是志贺菌属引起的肠道传染病。临床表现主要有发冷、发热、肠道传染病。临床表现主要有发冷、发热、腹痛、腹泻、里急后重、排粘液脓血样大腹痛、腹泻、里急后重、排粘液脓血样大便。菌痢常年散发，夏秋多见
33、，是我国的便。菌痢常年散发，夏秋多见，是我国的常见病、多发病。常见病、多发病。志贺氏菌志贺氏菌 检验标准：检验标准： GB 4789.5-2012 食品安全国家标准食品安全国家标准 食品微生物学检验食品微生物学检验 志贺氏菌检验志贺氏菌检验 检验程序如下图检验程序如下图志贺氏菌 操作步骤：操作步骤：1、增菌、增菌以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌，加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min10000r/min均质；均质；或加入装有或加入装有225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用
34、拍击式均质器志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均连续均1min2min，液体样品振荡混匀即可。于，液体样品振荡混匀即可。于 41.5 ，厌厌氧氧培养培养16h20h。志贺氏菌 2、分离、分离取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和琼脂平板和MAC琼琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于361培养培养20h24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现
35、的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表琼脂平板上的菌落特征见表1。志贺氏菌志贺氏菌志贺氏菌在志贺氏菌在XLD、MAC培养基平板上的菌落特征图培养基平板上的菌落特征图志贺氏菌 3、生化试验生化试验 4、血清学鉴定、血清学鉴定 5、结果与报告、结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中）样品中检出或未检出检出或未检出志贺氏菌。志贺氏菌。金黄色葡萄球菌 检验标准：检验标准： GB 4789.10-2010 食品安
36、全国家标准食品安全国家标准 食食品微生物学检验品微生物学检验 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 检验程序如下图检验程序如下图金黄色葡萄球菌 操作步骤操作步骤1、样品的处理、样品的处理称取称取 25 g 样品至盛有样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质均质 1 min2 min，或放入盛有或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打无菌均质袋中，用拍
37、击式均质器拍打 1min2 min。若样品为液态，吸。若样品为液态，吸取取 25 mL 样品至盛有样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。中，振荡混匀。金黄色葡萄球菌 2、增菌和分离培养、增菌和分离培养2.1 将上述样品匀液于将上述样品匀液于 36 1 培养培养 18 h24 h。金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌在在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨氯化钠胰酪胨
38、大豆肉汤内呈混浊生长。大豆肉汤内呈混浊生长。2.2 将上述培养物，分别划线接种到将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker 平板和血平板，血平平板和血平板，血平板板 36 1 培养培养 18 h24 h。Baird-Parker 平板平板 36 1 培养培养 18 h24 h 或或 45 h48 h。金黄色葡萄球菌2.3 金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，平板上，菌落直径为菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈，颜色呈灰色到灰色到黑色黑色，边缘为，边缘为淡色淡色，周围为一，周围为一混浊带混浊带，在，在其外层有一其外层有一透明圈透明圈。用接种针接触菌落
39、有。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。在血平板上，形成菌落较大，在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑圆形、光滑凸起、湿润、金黄色凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。金黄色葡萄球菌3 鉴定鉴定3.1 染色镜检：染色镜检： 金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌，排列呈，排列呈葡萄球
40、状葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 m1 m。3.2 血浆凝固酶试验：挑取、血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落 1 个个或以上，分别接种到或以上，分别接种到 5 mL BHI和营养琼脂小斜面，和营养琼脂小斜面，361 培养培养 18 h24 h。取新鲜配置兔血浆。取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入，放入小试管中，再加入 BHI 培养培养物物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置 361 温箱或水浴箱内，每半小温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察时观察一次，观察 6 h，
41、如呈现，如呈现凝固凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性阳性结果。同时以血浆结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，361 培养培养 18 h48 h，重复试验。，重复试验。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌革兰氏染色镜检图革兰氏染色镜检图金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验图血浆凝固酶实验图
42、4、结果与报告、结果与报告4.1 结果判定结果判定符合符合2.3、3，可判定为金黄色葡萄球菌，可判定为金黄色葡萄球菌4.2 结果报告结果报告在在25g（mL）样品中）样品中检出或未检出检出或未检出金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌溶血性链球菌 溶血性链球菌又称沙培林溶血性链球菌又称沙培林,对对热热和和化学化学清毒剂清毒剂均敏感，常引起扁桃体、咽部、均敏感，常引起扁桃体、咽部、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、猩红热的病原体。猩红热的病原体。 链球菌呈链球菌呈球形或椭圆形球形或椭圆形，直径，直径0.6-1.0m，呈，呈链状链状排列，长短不一，从排列，
43、长短不一，从4-8个至个至20-30个菌细胞组成不等，链的个菌细胞组成不等，链的长短与细菌的种类及生长环境有关。长短与细菌的种类及生长环境有关。该菌不形成芽胞，无鞭毛，易被普通该菌不形成芽胞，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，的碱性染料着色，革兰氏阳性革兰氏阳性，老龄，老龄培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。兰氏阴性。 检验标准检验标准 GB 4789.11-2014 食品安全国家标准食品安全国家标准 食品微生物学检验食品微生物学检验 型溶血性链球菌型溶血性链球菌检验检验 型溶血：在菌落周围形成型溶血：在菌落周围形成完全透明完全透明的的溶血环溶血环，红细胞完
44、全溶解。，红细胞完全溶解。 型溶血性链球菌：能够产生型溶血性链球菌：能够产生型溶血型溶血的化脓（或的化脓（或A群）链球菌群）链球菌（Streptococcus pyogenes）和无乳）和无乳（或（或B群）链球菌（群）链球菌（Streptococcus agalactiae）。）。溶血性链球菌 检验程序如下图检验程序如下图溶血性链球菌 操作步骤操作步骤 1、样品处理及增菌、样品处理及增菌按无菌操作称取检样按无菌操作称取检样 25 g（mL），加入盛有，加入盛有 225 mL mTSB 的均质袋中，用拍击式均质器均质的均质袋中，用拍击式均质器均质 1 min2 min；或加入盛；或加入盛有有 2
45、25 mL mTSB 的均质杯中，以的均质杯中，以 8000 r/min10000 r/min 均质均质 1 min2 min。若样品为液态，振荡均匀即可。若样品为液态，振荡均匀即可。 36 1 培养培养 18 h24 h。溶血性链球菌 2、分离、分离将增菌液划线接种于哥伦比亚将增菌液划线接种于哥伦比亚 CNA 血琼脂平板，血琼脂平板， 36 1 厌氧厌氧培养培养 18 h24 h，观察菌落形态。，观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚溶血性链球菌在哥伦比亚 CNA 血琼血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约脂平板上的典型菌落形态为直径约 2 mm3 mm， 灰白色、半透明、光灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生并产生 型溶血型溶血。溶血性链球菌 6、鉴定、鉴定 7、结果与报告、结果与报告 综合以上试验结果，报告每综合以上试验结果，报告每 25 g（mL）检样中检样中检出或未检出检出或未检出溶血性链球菌。溶血性链球菌。溶血性链球菌米酒原始记录
