1、1（Gene diagnosis and Gene Therapy）23概述概述 几乎所有的几乎所有的疾病疾病均在一定程度上均在一定程度上与基因与基因有某种有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基检测基因的改变因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。4 基因诊断主要内容基因诊断主要内容一、基因诊断概念一、基因诊断概念二、基因诊断常用技
2、术二、基因诊断常用技术三、基因诊断策略三、基因诊断策略四、基因诊断在临床的应用四、基因诊断在临床的应用 1. 在遗传性疾病诊断中的应用在遗传性疾病诊断中的应用 2.在传染性疾病诊断中的应用在传染性疾病诊断中的应用 3.在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用 4.在法医学上的应用在法医学上的应用五、基因诊断存在的问题和发展前景五、基因诊断存在的问题和发展前景5 基因诊断的出现：基因诊断的出现： 1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断。诊断。6 狭义狭义: :在基因（在基因（D
3、NADNA或或RNARNA) )水平，用水平，用PCRPCR、核酸杂、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态存在与否、结构变异和表达状态的的过程，对疾病作出诊断。过程，对疾病作出诊断。 基因诊断的概念基因诊断的概念7 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 PCR及其衍生技术及其衍生技术 限制性酶谱分析限制性酶谱分析 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交 DNA芯片技术芯片技术 DNA测序技术测序技术二、基因诊断中常用的几种技术二、基因诊断中常用的几种
4、技术8(一一)核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(1)(1)方法方法: : 以已知顺序核酸片段作为以已知顺序核酸片段作为探针探针, ,经放射性或非放射性物质经放射性或非放射性物质标记标记后后, ,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应再与未知的目的核酸片段进行杂交反应, ,分离已杂交分离已杂交和未杂交的标记核酸链和未杂交的标记核酸链, ,通过标记信号的检测通过标记信号的检测就可以对未知就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析的目的核酸链进行定性、定量分析. .9(2)2)几种不同形式的核酸分子杂交几种不同形式的核酸分子杂交 a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA
5、的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低 d.原位杂交（in situ hybridization): 是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断 分类: 玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片. 膜上原位杂交:
6、将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜) 10原原位位杂杂交交的的镜镜像像图图11(二)PCR技术在基因诊断中的应用（）等位基因特异性寡聚核苷酸（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO) )探针斑点杂交：探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是该方法是诊断已知点的突变：诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用因诊断时，只需用PCRPCR扩增受检者目的扩增受检者目的DNADNA片段，再分别与上述探针杂片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：交杂交的结果有如下几种情况：
7、 PCR PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交不存在这种突不存在这种突变；变； 只与突变探针杂交只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；突变基因为纯合子； 与正常探针和突变探针都可杂交与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；突变基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型突变基因不属于已发现的类型12ASO探针杂交检测已知点突变受检者受检者基因组基因组DNA或含或含突变位点的突变位点的PCR扩增产物扩增产物与标记的与标记的ASO 探针杂交探针杂交ASO1 ASO2NormalHet
8、eroHomo13（）（）PCR-PCR-单链构象多态性（单链构象多态性（PCR single strand PCR single strand conformation ploymorphism,PCR-SSCP) conformation ploymorphism,PCR-SSCP)分析分析 是一种基于单链是一种基于单链DNADNA构象差别来检测点突变的方法构象差别来检测点突变的方法DNADNA变性变性形形成单链，在中性条件下长度相同的单链成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,DNA,如果碱基组成和如果碱基组成和( (或或) )排列顺序不同排列顺序不同, ,形成的构象就不同形成的构象就
9、不同, ,这样就形成了单链构象多态性这样就形成了单链构象多态性. .这些分子在这些分子在非变性非变性PAGEPAGE电泳电泳中表现出不同的迁移率中表现出不同的迁移率. . SSCPSSCP特别适于分析小于特别适于分析小于400400bp bp 的的 PCRPCR产物。据认为产物。据认为SSCPSSCP可以区可以区分分1 1bpbp的差异的差异PCR-SSCPPCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行后还需进行测序测序分析，确定变异性质分析，确定变异性质14PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意15(3)PCR-(
10、3)PCR-限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（ PCR restriction PCR restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLPfragment length polymorphisms,PCR-RFLP）分析分析 基因突变导致的基因碱基组成或基因突变导致的基因碱基组成或( (和和) )顺序发顺序发生改变生改变, ,会在基因结构中产生新的限制性内切酶会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失位点或使原有的位点消失. . 用用限制酶限制酶对不同个对不同个体基因组进行消化时，其体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和
11、大电泳条带的数目和大小小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在变是否存在. .16 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms)样品一样品二19871987年年, ,H.Donis-Keller等人以等人以RFLPRFLP为遗为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱传标记绘制了第一张人类遗传图谱17(4)PCR-(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术变性梯度凝胶电泳分析技术 双链双链DNADNA在一定浓度变性剂在一定浓度变性剂( (尿素尿素, ,甲酰胺甲酰
12、胺) )作用下作用下, ,会变性而解链会变性而解链, ,导致导致DNADNA分子电泳迁移率变化分子电泳迁移率变化. .当在不当在不同梯度浓度变性胶中电泳时同梯度浓度变性胶中电泳时, , DNADNA泳动到变性剂浓度泳动到变性剂浓度能使能使DNADNA发生变性，发生变性，DNADNA开始解链，从而不同的开始解链，从而不同的DNADNA片片段会形成不同的迁移率条带段会形成不同的迁移率条带优点优点：可靠，检出单碱基突变率可达：可靠，检出单碱基突变率可达缺点缺点：富含高熔点：富含高熔点GCGC区时，则难以检测出突变区时，则难以检测出突变18变性梯度凝胶电泳图变性梯度凝胶电泳图19荧光定量荧光定量PCR
13、(FQ-PCR)PCR(FQ-PCR)技术技术 是一种目前国内外应用较为广泛的定量是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCRPCR技术技术, ,是通过始点定量是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现, ,具有灵敏度高具有灵敏度高, ,特异性特异性强等优点强等优点. . FQ-PCR FQ-PCR技术的两种定量形式技术的两种定量形式: : 绝对定量绝对定量: :一般采用一般采用外标准品外标准品定量的制备来实现绝对定量定量的制备来实现绝对定量. . 如合成目如合成目的基因的基因; ;将将PCRPCR产物直接梯度稀释产物直接梯度稀释; ;或将或将P
14、CRPCR产物克隆到载体上产物克隆到载体上, ,抽取质粒抽取质粒, ,经过测量浓度和拷贝数可准确定量经过测量浓度和拷贝数可准确定量. .优点优点: :稳定稳定, ,准确准确. . 相对定量相对定量: :指在测定目的基因的同时测定一指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因内源性管家基因( (如如- -actin, rRNAactin, rRNA等等) ), ,该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较, ,反映反映反应体系内是否存在反应体系内是否存在PCRPCR扩增的影响因素扩增的影响因素. .(6)定量定量PCR(quantiative PCR, Q-P
15、CR) 20( (7 7）DNADNA序列测序序列测序1.1.19771977年年SangerSanger创建的链终止反应序列测序法创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸随机终随机终止止DNADNA链的延伸，产生长度不同的链的延伸，产生长度不同的DNADNA片段，再用聚丙烯片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。21222.2.自动测序法自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。 DNA DNA 测序测定是基因突
16、变检测的最直接，最准确的方法，测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质23（8 8）DNADNA芯片技术芯片技术 DNA DNA芯片（芯片（DNA chip)DNA chip)又称为基因芯片，又称为基因芯片，DNADNA微阵列（微阵列（DNA DNA microarray)microarray) 该技术的基础仍然是利用该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交核酸分子杂交原理：首先将一系列原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA)oligos or cDNA)有序
17、地，高密度地排有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNADNA微阵列。微阵列。用用荧光标记待测样品荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。因序列信息或表达信息。 24基因芯片技术基因芯片技术25 基因芯片按照用
18、途分为：表达芯片，诊断芯片，基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。 该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。传制图等。26 基基因因表表达达的的分分析析27三、遗传病的基因诊断一. 遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆. 2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.28二、人类基因组上的二、人类基因组上的DNADNA遗传标记遗传标记 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态
19、性(RFLPs )1985 短串联重复序列短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites )1990s 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs)29短串联重复序列短串联重复序列STRs (short tendem repeats, Microsatellites )STRSTR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%5%，基本单位是，基本单位是1bp-8bp1bp-8bp的的串联串联重复，重复次数重复，重复次数 n=15-60n=15-60，已知，已知80
20、008000多个多个主要形式为：主要形式为： (CA)(CA)n n ， (GA)(GA)n n ， (AA)(AA)n n ， (GG)(GG)n n ， (CAA)(CAA)n n， (CGG)(CGG)n n ，其中以其中以 (CA)(CA)n n ， (GT)(GT)n n 为多见。为多见。19921992年，年，WelssenbanchWelssenbanch等以等以STRSTR为标记的第二代连锁图取代了为标记的第二代连锁图取代了RFLPRFLP连锁图连锁图。30 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNADNA序序列多态性
21、。与列多态性。与RFLPRFLP与与STRSTR不同不同, ,它是直接以它是直接以序列的变异序列的变异作为标记作为标记, ,而不是以而不是以片段的长度差异片段的长度差异作为标记作为标记. . 人类基因组图谱的初步分析表明，共有人类基因组图谱的初步分析表明，共有3 3万至万至3.53.5万个基因。万个基因。有有300300多万个单核苷酸多态性多万个单核苷酸多态性,SNP,SNP在人类基因组中广泛存在，平在人类基因组中广泛存在，平均每均每50050010001000个碱基对中就有个碱基对中就有1 1个，个，3-43-4个相邻的标记构成的单个相邻的标记构成的单倍型（倍型（haplotypehaplo
22、type）就可有）就可有8-168-16种。种。 19961996年，年，LanderLander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。传连锁图的遗传标记。单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）31SNPSNP用作遗传标记具有以下优点：用作遗传标记具有以下优点： SNP SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。频率都可估计出来。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。它在基因组中的分布较微卫星标记广
23、泛得多。与串联重复的微卫星位点与串联重复的微卫星位点(STR)(STR)相比，相比，SNPSNP是高度稳定的是高度稳定的. .尤尤其是处于编码区的其是处于编码区的SNP(cSNP),SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。人群的遗传分析出现困难。部分位于基因内部的部分位于基因内部的SNPSNP可能会直接影响产物蛋白质的结构可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。候选改变位点。易于进行自动化分析，缩短了研究时间易于进行自动化分析，缩短
24、了研究时间 . .32四、基因诊断技术在临床的应用四、基因诊断技术在临床的应用3233血红蛋白病的基因诊断血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血分为异常血红蛋白病和地中海贫血, ,前者是由于珠蛋白的基因突变；前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，后者是由于珠蛋白合成速率降低，a a链和链和b b链合成不平衡。链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断：（一）异常血红蛋白病的基因诊断： 如镰状红细胞贫血病如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸链第六位氨基酸:GAA(:GAA(谷谷)GUA()GUA(缬缬) )代替代替. . 对该病的基因诊断应采用对该病的基因诊断应
25、采用: : 1)PCR-1)PCR-限制酶切限制酶切, ,即用即用PCRPCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段因片段, ,再选适当的内切酶消化再选适当的内切酶消化PCRPCR产物产物, ,根据电泳图谱上片段数量和根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断大小做出判断 2)Southern 2)Southern 印迹杂交分析印迹杂交分析34 HbA、HbS和和HbC的密码子及蛋白质区别的密码子及蛋白质区别 珠蛋白基因的第珠蛋白基因的第6位密码子有三种形式：正常红细胞的基因位密码子有三种形式：正常红细胞的基因A、镰、镰状红细胞的基因状红细胞的基因S和另一种相
26、对常见的血红蛋白和另一种相对常见的血红蛋白C的基因的基因C。 35 设计一对引物进行设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密码子，扩增后用密码子，扩增后用Mst限制性内切酶限制性内切酶对扩增产物进对扩增产物进行水解，通过对水解片段的行水解，通过对水解片段的电泳分析电泳分析或进行或进行Southern杂杂交分析交分析可以做出正确的诊断。可以做出正确的诊断。 限制性内切酶限制性内切酶Mst识别序列为识别序列为CCTNAGG，N可以是任可以是任意核苷酸。因此意核苷酸。因此珠蛋白基因的第珠蛋白基因的第5、6密码子和第密码子和第7密码密码子的第一个核苷酸序列
27、是该内切酶的识别位点。但是在子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在发发生镰状突变后该酶切位点消失生镰状突变后该酶切位点消失。 36Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析370.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者酶切产物电泳分析酶切产物电泳分析38酶切产物酶切产物Southern印迹杂交分析印迹杂交分析 用寡核苷酸用寡核苷酸探针探针和和PCRPCR产物产物进行杂交检测点突变进行杂交检测点突变 被检靶
28、片段经被检靶片段经PCRPCR扩增、酶切，并经电泳分离后转扩增、酶切，并经电泳分离后转移到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交移到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交 探针为探针为珠蛋白基因珠蛋白基因5端的基因片断端的基因片断 39图示图示珠蛋白基因纯合子珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子）、纯合子S(SS)和杂合子和杂合子AS个体的个体的DNA杂交结果杂交结果40 PCRPCR产物仅与完全互补的探针进行杂交产物仅与完全互补的探针进行杂交 含含突变序列突变序列的产物仅与的产物仅与突变探针突变探针杂交杂交 PCRPCR产物分别与经标记的产物分别与经标记的野生型和突变型野生型和突变型靶基因序列的寡核靶基因序列
29、的寡核苷酸探针杂交，根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否苷酸探针杂交，根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点带有突变点41 b-b-珠蛋白基因珠蛋白基因点突变点突变 GAG(Glu)-GTG(Val) bA bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC b bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC HeterobA bA probeb bS probeHomoNormal42（二）（二） 地贫的基因诊断：地贫的基因诊断： 1 1. . 定性分析定性分析：PCRPCR法直接扩增法直接扩增11和和22，基因，基因的的33端有差别，针对此可设计引物进行
30、端有差别，针对此可设计引物进行PCRPCR，如有缺失，则不能扩增出产物。如有缺失，则不能扩增出产物。 2 2. . 定量分析定量分析:地贫的共同特点是地贫的共同特点是珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA的量减少，因此可用的量减少，因此可用RT-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊断。的量以助诊断。43重型重型 地贫地贫: :胎儿水肿综胎儿水肿综合征合征 早产死胎或出生早产死胎或出生前后死亡前后死亡 可导致严重产科可导致严重产科并发症并发症 无理想治疗方法无理想治疗方法44基因不同程度的基因不同程度的缺失引起不同类型缺失引起不同类型的的地贫，地贫，基因基因缺失缺失1 14 4个。
31、正常个。正常GeneGene组用组用BamHIBamHI切割，切割，可得到可得到14kb14kb的片段，的片段，而缺失一个而缺失一个 Gene Gene时可得到时可得到10kb10kb片段片段。BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe地贫的地贫的GeneGene诊断诊断45 / /- /- - - /- - - - / - - 正常正常 缺缺1 缺缺2 缺缺3 缺缺414kb10kb46 （三）三） -地贫的基因诊断地贫的基因诊断 1 1. DNA. DNA检测与分析检测与分析 ： PCR-ASO PCR-ASO 探针法为主要方法：根据探针法为主要方法：根据
32、 -珠蛋白主要突变位珠蛋白主要突变位点，设计点，设计2 2对引物，扩增可能发生突变的对引物，扩增可能发生突变的2 2个片段个片段, ,再分别与相应再分别与相应野生型探针和突变探针进行斑点杂交。野生型探针和突变探针进行斑点杂交。 PCR-RFLP PCR-RFLP连锁分析法：检测与连锁分析法：检测与-珠蛋白基因连锁的遗传标珠蛋白基因连锁的遗传标记进行基因诊断记进行基因诊断, ,如如-珠蛋白珠蛋白55端有一限制内切酶端有一限制内切酶HgiAIHgiAI的多的多态性位点态性位点, ,在中国人群的频率为在中国人群的频率为0.5 0.5 DNA DNA芯片技术芯片技术 2 2.RNA.RNA检测与分析：
33、检测与分析：RT-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊断的量以助诊断47杜氏肌营养不良症的基因诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断( (Duchenne muscular dystrophy,DMD) ) DMDDMD：是性连锁隐性遗传病是性连锁隐性遗传病, ,是由是由抗肌萎缩蛋白抗肌萎缩蛋白( (dystrophin) )基因突变基因突变( (突变或缺失突变或缺失) )。 其突出其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMDDMD患儿在患儿在5 5岁前发病，岁前发病，2020岁左右由于心力衰竭岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，
34、发病率在男性活婴中约和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500 1/3500 。48DMDDMD是一种严重致死性疾病（是一种严重致死性疾病（XRXR），临床症状表现肌），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。肉进行性萎缩和乏力。BMDBMD临床症状与临床症状与DMDDMD相似，但症相似，但症状较轻。状较轻。Gene Gene 定位定位Xp21 Xp21 ， Gene 2300kb,79 Gene 2300kb,79 个个Exon Exon ，cDNAcDNA全长全长13974bp 13974bp 编码编码3685 Aa3685 Aa，分子量，分子量427kD427kD。DMD/BMD 70
35、%DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用生在不同的部位。应用多重多重PCRPCR扩增检测，判断缺失扩增检测，判断缺失状态。状态。49杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断 多重多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）对引物）P1 除外显子除外显子1 外其余均缺失；外其余均缺失； P2 外显子外显子819 有小的缺失；有小的缺失；P3 外显子外显子44-50 缺失；缺失； P4 外显子外显子4552 有小的缺失；有小的缺失；B1 空白对照；空白对照；C1、C2 正常对照。
36、正常对照。50 临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 APKDGeneAPKDGene定位定位16p1316p13，但致病基因尚未克隆，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实但已证实APKD GeneAPKD Gene与与珠蛋白基因珠蛋白基因33端附近的一端附近的一段小卫星段小卫星DNADNA序列（序列（3HVR3HVR）紧密连锁，因此，可）紧密连锁，因此，可以通过以通过RFLPRF
37、LP连锁分析进行诊断。连锁分析进行诊断。成年型多囊肾病的基因诊断成年型多囊肾病的基因诊断APKDAPKD，AD AD 51 以以33HVR为为probe与与PvuII酶切后的家系有关酶切后的家系有关成员的成员的Gene组组DNADNA杂交杂交Southern Blot杂交杂交 Gene组组DNA probe （3HVR） DNA片段片段 杂交杂交 结果结果 52结结 果果 1 2 1 2 3 4 5 57kb 34kb 23kb 53 患者（患者（I1、II1和和II2）有）有3.4kb3.4kb片段片段, ,说明说明致病基因与致病基因与3.4kb3.4kb片段连锁片段连锁, ,并按孟德尔方并
38、按孟德尔方式遗传式遗传. .II5不含不含3.4kb3.4kb片段片段, ,产前诊断正常产前诊断正常. .54甲型血友病的基因诊断甲型血友病的基因诊断血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/50001/500001/50001/50000。为。为甲型血友病
39、和乙型血友病。甲型血友病和乙型血友病。 55已知甲型血友病已知甲型血友病XRXR，获得家系成员基因组，获得家系成员基因组DNA DNA 。 PCR 142 bpPCR 142 bp 142bp+99 bp+43bp 142bp+99 bp+43bp 电泳电泳 结果分析结果分析p1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I -Bcl I +56问问:1：2、1诊断；诊断；2： 1是男或是女发病？是男或是女发病？142bp99bp1 2123III 157结果分析结果分析1 1）先症者）先症者II2具有具有99bp99bp片段而发病，该片段来自母亲。片段而发病，该片段来自母亲。2 2）II
40、2有有142bp/99bp142bp/99bp杂合子。杂合子。142bp142bp来自父亲，为正来自父亲，为正常片段，常片段，99bp99bp片段是来自母亲而成为携带者。片段是来自母亲而成为携带者。3 3）1为为99bp99bp片段片段 如果是男性为患者（如果是男性为患者（99bp99bp片段来自母亲）；女性片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）。为携带者（来自父母双方）。58肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂, ,因此对因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊
41、断策略不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略. .59 一一. .通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤淋巴造血系统肿瘤: : 染色体易位及基因融合是较普遍的现象染色体易位及基因融合是较普遍的现象. . 如如: :淋巴瘤和淋巴结反应性增生淋巴瘤和淋巴结反应性增生. .它是由于它是由于T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)基基因和因和IgHIgH基因重排基因重排, ,使原来相隔数百个碱基的使原来相隔数百个碱基的IgHIgH和和TCRTCR基因的基因的V V区和区和J J区靠近在一起区靠近在一起. .用用PCRPCR扩增该区域片段扩增该区域
42、片段, ,通过长度分析通过长度分析就能判断是否发生了基因重排就能判断是否发生了基因重排. . 60二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关. .大多人类肿瘤组织或大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和细胞中都能检测到癌基因和( (或或) )抑癌基因的突变抑癌基因的突变1.1.癌基因癌基因-ras-ras与肿瘤与肿瘤: : ras ras是肿瘤中最常被激活的癌基因是肿瘤中最常被激活的癌基因. .激活的分子机制主要是点突变激活的分子机制主要是点突变, ,高发区是第高发区是第12 12 、1313和和6
43、161位密码子位密码子. .如如90%90%的胰腺癌的胰腺癌,50%,50%的结直肠癌和的结直肠癌和1/31/3的肺腺癌都在是的肺腺癌都在是K-rasK-ras基因第基因第1212位密码子突变位密码子突变. . ras ras癌基因点突变检测方法癌基因点突变检测方法: : a.PCR-ASOa.PCR-ASO法法: :检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。 b.PCR-SSCPb.PCR-SSCP法：法：根据根据PCRPCR扩增的目标扩增的目
44、标DNADNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；变基因检测出来。该法检测点突变更方便； 缺点：不能检测出突变的具体位缺点：不能检测出突变的具体位点和具体类型。点和具体类型。61 2 .2 .P53P53基因与肿瘤基因与肿瘤： p53 p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子机制主基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基因表达异常而使要是基因突变，也有因为基因表达异常而使p53p53失活，约失活，约50%50%以上的恶性肿瘤有以上的恶性肿瘤有p53p53基因突变。基因突变。 突变类型：突变类型
45、：130130290290密码子间常发生点突变，也有少量的密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。插入或缺失突变。 基因检测方法：基因检测方法： PCR-SSCP:PCR-SSCP:可检出有无突变可检出有无突变 PCR-RFLP:PCR-RFLP:通过内切酶位点的消失或增加通过内切酶位点的消失或增加 检测检测p53p53的基因突变的基因突变。62三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤 已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也病毒，也有有RNA病毒病毒,其中逆转录病毒其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤对动物细胞的致瘤作
46、用已得到公认作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如: Burkitt 淋巴瘤人类乳头瘤病毒(HPV)宫颈癌通过检测这些病毒的基因就可以帮助诊断相应的肿瘤.EB病毒63四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物肿瘤标志物（tumor marker)tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。 类型类型：基因标志基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反
47、映癌前启动阶段的变：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。化。基因表型标志基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。 基因诊断方法基因诊断方法： 基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，测序，PCR-SSCPPCR-SSCP等技术。等技术。 导致肿瘤标记物产生导致肿瘤标记物产生或含量改变分子
48、机制不清楚，可用或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCRRT-PCR技术检测肿瘤标记物技术检测肿瘤标记物mRNAmRNA的存在的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。中该酶的活性增高。64感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断 每种病原体都有各自特异的遗传物质每种病原体都有各自特异的遗传物质, ,可以是可以是DNA,DNA,也可以是也可以是RNA.RNA.每种病原生物都有各自种属特异的基因每种病原生物都有各自种属特异的基因. . 一一. .病毒感染性疾病的诊断病毒感染性疾病的诊断
49、 a.a.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒: : 目前采用免疫法检测血清中病毒抗原目前采用免疫法检测血清中病毒抗原. . HBV HBV基因组包含基因组包含4 4个开放阅读框个开放阅读框,S,S、C C 、P P和和X X区区,C,C区变异性区变异性小小, ,是基因诊断采用的目标部位是基因诊断采用的目标部位. .在用在用PCRPCR检测时可扩增检测时可扩增HBVHBV的特异核苷酸序列的特异核苷酸序列, ,通过通过PCRPCR产物的直接电泳分析、或内切产物的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或酶谱分析、或点杂交、或SouthernSouthern印迹等结果作出判断印迹等结果作出判断. .也可采用基
50、因芯片技术也可采用基因芯片技术. . 65PCR 检测检测HIV 病毒携带者病毒携带者66 b.b.传染性非典型肺炎传染性非典型肺炎(SARS):(SARS): 是由新型变异冠状病毒是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)(SARS-CoV)感染引起感染引起. SARS-CoV. SARS-CoV基因组基因组为正链单股为正链单股RNA,RNA,有有1111个开放阅读框个开放阅读框, ,基因组的特异保守序列为基因组的特异保守序列为编码编码RNARNA聚合酶的序列聚合酶的序列. . 基因诊断方法基因诊断方法: : 采用采用RT-PCRRT-PCR技术扩增保守序列技术扩增保守序列 DNADNA芯片芯
