1、第二章 微生物农药 1微生物可分为：1 1、无细胞结构无细胞结构的：的：真病毒、亚病毒；2、具有原核细胞结构原核细胞结构的：真细菌（细菌、放线菌、蓝细菌、立克次氏体、支原体、衣原体）、古细菌；3、具有真核细胞结构真核细胞结构的：真菌（酵母菌、霉菌）、单细胞藻类、原生动物等。2微生物农药微生物农药是指应用生物活体（包括细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫或基因修饰的微生物）制成的防治作物病、虫、草、鼠等有害生物的制剂，也包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂。微生物农药是目前生物农药的一个最主要的组成部分，其基础研究和产业化研究均走在整个生物农药研究领域的前列。3按微生物种类分类：按微生物种类分类：
2、细菌类：苏云金杆菌、日本金龟子杆菌、球状芽孢杆菌细菌类：苏云金杆菌、日本金龟子杆菌、球状芽孢杆菌 真菌类：白僵菌、绿僵菌真菌类：白僵菌、绿僵菌 病毒：核多角体病毒、颗粒体病毒病毒：核多角体病毒、颗粒体病毒 寄生线虫：小杆线虫、斯氏线虫寄生线虫：小杆线虫、斯氏线虫 微孢子原虫类微孢子原虫类4用于制备生物农药的主要微生物类群用于制备生物农药的主要微生物类群 生物类别生物类别致病生活阶段及传播致病生活阶段及传播作用方式作用方式适用环境适用环境形成孢子的细菌杀虫剂晶体毒素，抗性强的孢子胃毒，侵染植物表面，水，土壤原生动物杀虫剂抗性强的孢子中肠侵染植物表面昆虫病毒抗性强的包涵体中肠侵染植物表面枝霉菌素杀
3、虫剂相对弱或抗性强的孢子接触侵染土壤、植物表面，水、昆虫表皮霉菌除草剂相对弱的孢子接触侵染土壤、植物表面细菌除草剂弱的细菌细胞，抵抗力强的孢子接触侵染土壤、植物表面拮抗植物病原菌的真菌、细菌抗性强的或弱的孢子接触侵染或抑制土壤、植物表面细菌真菌共生体细菌，传播能力弱接触侵染土壤嗜虫线虫传染阶段（相关的细菌），传播能力弱寻找寄主后侵染土壤、水5 第一节第一节 细菌农药细菌农药电子显微镜下的细菌三型球菌杆菌螺旋菌6细胞壁细胞壁细胞膜细胞膜夹膜夹膜细胞质细胞质DNA鞭毛鞭毛细菌的结构模式图细菌的结构模式图7染色法染色法 革兰氏染色革兰氏染色 Gram stainGram stain：由丹麦细菌学家革
4、兰：由丹麦细菌学家革兰(Hans Hans Christian Gram)Christian Gram)创建的一种鉴别染色法。采用创建的一种鉴别染色法。采用4 4 种试种试剂分剂分4 4 步：步：结晶紫结晶紫 碘液碘液 95%95%乙醇乙醇 复红复红 （初染）（初染）（媒染）（媒染）（脱色）（脱色）（复染）（复染）革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 （菌体为紫色（菌体为紫色 ）（菌体为红色）菌体为红色）8革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌9有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应
5、。10细菌农药按用途分细菌杀虫剂细菌杀菌剂细菌杀鼠剂微生态制剂芽孢杆菌类非芽孢杆菌类按是否产芽孢分细菌农药的分类细菌农药的分类细菌杀线虫剂11一、细菌性杀虫剂蜡状芽孢杆菌杆状菌假单孢菌链球菌12昆虫疾病：昆虫疾病：非传染源疾病：不良环境、创伤、营养、生理非传染源疾病：不良环境、创伤、营养、生理失调及先天性不足。失调及先天性不足。传染源疾病：细菌、真菌、病毒、原生动物、传染源疾病：细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫、立次克体。线虫、立次克体。13具有杀虫作用的昆虫病原细菌大多属于具有杀虫作用的昆虫病原细菌大多属于3个科：个科：芽孢杆菌科芽孢杆菌科（Bacillaceae）、）、肠杆菌科（肠杆菌科（
6、Enterobacillaceae）、）、假单胞菌科（假单胞菌科（Pseudomonodaceae）。）。其中能成为杀虫剂的主要分布在芽孢杆菌科的其中能成为杀虫剂的主要分布在芽孢杆菌科的2个属：个属：芽孢杆菌属芽孢杆菌属（Bacillus）梭状芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属（Clostridium）。）。141、细菌性杀虫剂的特性、细菌性杀虫剂的特性(1)细菌属于细菌属于原核生物原核生物，单细胞的有机体，个体较小，一般体，单细胞的有机体，个体较小，一般体长都在微米级，缺乏完整的细胞核，有的可以运动，有些长都在微米级，缺乏完整的细胞核，有的可以运动，有些种在有氧和无氧的条件下都能生存。多数以二分裂法进
7、行种在有氧和无氧的条件下都能生存。多数以二分裂法进行无性生殖，有些也可以进行有性生殖。无性生殖，有些也可以进行有性生殖。许多细菌具有质粒许多细菌具有质粒可以把基因导入菌体中可以把基因导入菌体中 。15(2)大多数的昆虫病原细菌是通过大多数的昆虫病原细菌是通过口和消化道感染口和消化道感染昆昆虫的虫的，只有少数通过卵、体壁和气管感染。细菌，只有少数通过卵、体壁和气管感染。细菌也可以通过寄生虫和捕食昆虫携带感染。也可以通过寄生虫和捕食昆虫携带感染。16(3)细菌细菌繁殖速度极快繁殖速度极快，种类繁多种类繁多，广泛分布在自然界中，因，广泛分布在自然界中，因此其与昆虫接触的机会很多，容易感染昆虫。此其与
8、昆虫接触的机会很多，容易感染昆虫。昆虫被细菌感染后都表现一些共同的特征，例如昆虫被细菌感染后都表现一些共同的特征，例如活动缓慢，活动缓慢，食欲减退，腹泻和呕吐食欲减退，腹泻和呕吐等。等。大多数的细菌侵入昆虫体腔后，常常先引起感染而最终引起大多数的细菌侵入昆虫体腔后，常常先引起感染而最终引起败血病败血病导致昆虫死亡。死亡的虫体颜色加深，迅速变成褐导致昆虫死亡。死亡的虫体颜色加深，迅速变成褐色和黑色，虫体软化腐烂，稍为触及，虫体破裂，流出带色和黑色，虫体软化腐烂，稍为触及，虫体破裂，流出带有臭味的黏稠液体有臭味的黏稠液体 。17(4)(4)在昆虫病原菌中，有寄主范围很窄的在昆虫病原菌中，有寄主范围
9、很窄的专性病原专性病原细菌细菌和寄主范围很宽的和寄主范围很宽的兼性病原细菌兼性病原细菌。专性细菌专性细菌一般在合成培养基上不能生长，一般在合成培养基上不能生长，对特对特定的昆虫具有很强的致病力定的昆虫具有很强的致病力；兼性细菌兼性细菌在培养基上能生长，具有在培养基上能生长，具有易繁殖、易易繁殖、易生产生产等特点，等特点，是微生物农药的主要病原菌是微生物农药的主要病原菌。目前应用较广的目前应用较广的专性病原细菌专性病原细菌有有日本金龟子芽日本金龟子芽孢杆菌孢杆菌和和缓病芽孢杆菌缓病芽孢杆菌，兼性病原细菌兼性病原细菌有有芽孢杆菌芽孢杆菌属属和和沙雷铁杆菌属沙雷铁杆菌属。18(5)细菌杀虫剂细菌杀虫
10、剂有独特的作用方式和杀虫机理有独特的作用方式和杀虫机理，通过营养体、芽孢在体内繁殖并产生通过营养体、芽孢在体内繁殖并产生生物活性蛋白生物活性蛋白、毒素毒素等杀死目标昆虫。具有等杀死目标昆虫。具有很高的选择性很高的选择性和和很少的很少的交互抗性交互抗性。19(6)实际应用的部分细菌农药的实际应用的部分细菌农药的缺点缺点 1)1)杀虫谱比较窄杀虫谱比较窄 2)2)不具内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫不具内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫 3)3)作用速度比较慢作用速度比较慢 4)4)生产工艺比较复杂生产工艺比较复杂 5)5)持效期比较短，受日光照射容易失效等，从而持效期比较短，受日光照射容易
11、失效等，从而影响了该类农药的发展。影响了该类农药的发展。2019011901年，石渡繁胤年，石渡繁胤 (Ishiwata)(Ishiwata)，生病的生病的蚕蛾。蚕蛾。19111911年，年，BerlinerBerliner在德国苏云金地区的面粉厂里的地中海粉螟中分离出在德国苏云金地区的面粉厂里的地中海粉螟中分离出Bt Bt，并于，并于19151915年首次对其命名。年首次对其命名。2020世纪世纪2020年代中期，才首次用年代中期，才首次用BtBt对鳞翅目幼虫对鳞翅目幼虫(欧洲玉米螟欧洲玉米螟)进行了田间进行了田间药效试验，引起了当时许多昆虫学家的注意。药效试验，引起了当时许多昆虫学家的注意
12、。19381938年年 法法 Sporeine Sporeine 第一个商品制剂。第一个商品制剂。1953.Hannay 伴孢晶体伴孢晶体 杀虫作用杀虫作用1971.日本农林省解除禁令，植保局成立日本农林省解除禁令，植保局成立Bt研究会研究会 相继发现了对鞘翅目，螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫，动植物相继发现了对鞘翅目，螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫，动植物寄生线虫，鞭毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的寄生线虫，鞭毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的BtBt菌株。菌株。1、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)21中国：中国：1
13、940年代：用苏云金杆菌防治菜粉蝶（中大蒲蛰龙）1950年代：从法国引进苏云金杆菌 1964年，湖北和湖南两省设厂生产 1970年代初，大规模群众性生产 1980年代后：“七五”“九五”“十五”攻关，863，2010年中长期规划年中长期规划:资源调查、生产工艺改进、质量标准化、蛋白基因克隆、转BT基因植物。22(1)Bt形态特征及生理生化形态特征及生理生化1)形态特征：形态特征：3个阶段个阶段 营养体营养体：杆状，横裂生殖、革兰氏阳性。杆状，横裂生殖、革兰氏阳性。芽孢囊芽孢囊：菌体老熟时，一端斜生一个椭圆形芽孢，另一端菌体老熟时，一端斜生一个椭圆形芽孢，另一端同时出现伴孢晶体。晶体典型为菱形、
14、也有圆形、方形、椭圆同时出现伴孢晶体。晶体典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、不规则形，通常形、不规则形，通常1 1个，也有几个毒素主成分，但亦有发现个，也有几个毒素主成分，但亦有发现对昆虫无毒。对昆虫无毒。芽孢和伴孢晶体的释放芽孢和伴孢晶体的释放：芽孢囊破裂，释放出游离的芽孢芽孢囊破裂，释放出游离的芽孢和伴孢晶体。和伴孢晶体。23苏云金芽孢杆菌的特征24Vegetative cell of Bacillus thuringiensis25细菌的芽孢类型细菌的芽孢类型苏云金芽孢杆菌芽孢及伴孢晶体苏云金芽孢杆菌芽孢及伴孢晶体26Crystal diversity of B.thuringiens
15、is27晶体毒素蛋白晶体毒素蛋白晶体蛋白空间结构28Spore and parasporal crystal sporeCrystal292)生理生化生理生化 Bt对营养条件要求不高。所需主要营养物质属动植物蛋白质衍生物。能在多种N源，碳源和无机盐中正常发育。通常所利用的营养:u 碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖、直接为Bt吸收利用u N源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆等。30u 无机盐无机盐：K K2 2HPOHPO4 4、MgSOMgSO4 4、CaCOCaCO3 3。主要元素主要元素有有磷、磷、硫、镁、钾、钠、钙硫、镁、钾、钠、钙6 6种种，微量元素的锰、锌、硅
16、、，微量元素的锰、锌、硅、铁等，微量元素所需甚微，水中含的微量无素即可满铁等，微量元素所需甚微，水中含的微量无素即可满足，多了有毒。足，多了有毒。u 温度温度：10-4010-40都能生长都能生长，以，以28-3228-32较适较适。35-4035-40生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。因此在一定范围内提高温度会缩短生长期，但菌数量因此在一定范围内提高温度会缩短生长期，但菌数量会降低；而温度低则生长慢，生长期延长，菌数相对会降低；而温度低则生长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。来说则增高。31u pH：与其他细菌类似，该菌适于与其他细菌类似，该菌适于
17、微碱性条件，微碱性条件，最适最适pHpH是是7.57.5，当，当pHpH达达8.58.5时还能形成芽孢，如时还能形成芽孢，如pHpH降至降至5 5以下则不能形成芽孢。以下则不能形成芽孢。u 氧氧:是一种是一种好氧细菌好氧细菌，需要充足的空气才能生，需要充足的空气才能生长发育良好。尤其当芽孢形成时，若缺乏足够的空气长发育良好。尤其当芽孢形成时，若缺乏足够的空气时会延迟芽孢的形成或不能形成。它还影响到生长速时会延迟芽孢的形成或不能形成。它还影响到生长速度、菌数和晶体。在深层培养时通气不良会造成细菌度、菌数和晶体。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。溶解，使菌数降低。32u 紫外线紫外线
18、:阳光对芽孢有致死作用阳光对芽孢有致死作用。芽孢暴露在紫。芽孢暴露在紫外光下很快失活外光下很快失活:1:1分钟失活分钟失活12%12%、2 2分钟分钟50%50%失活、失活、1010分钟分钟99%99%失活。在自然阳光下，失活。在自然阳光下，3030分钟分钟50%50%失活，失活，6060分分钟钟80%80%失活。在失活。在290-400nm290-400nm处死亡率最高。处死亡率最高。u 抗生素及化学物抗生素及化学物:放线菌素、氯霉素、红霉素放线菌素、氯霉素、红霉素及及一些化学物质都有影响。一些化学物质都有影响。乳化剂乳化剂对芽孢萌发有抑制作对芽孢萌发有抑制作用，用，TritonX-100T
19、ritonX-100在在100g/ml100g/ml时，全部抑制了芽孢萌时，全部抑制了芽孢萌发。发。33(2)分类、命名及来源分类、命名及来源1)分类分类 苏云金杆菌亚种苏云金杆菌亚种在在生物化学、血清学、孢子体、抗原、生物化学、血清学、孢子体、抗原、抗生素的合成、酶、噬菌体和外原凝集素组成抗生素的合成、酶、噬菌体和外原凝集素组成等方面都有差等方面都有差异。异。Krieg等人在等人在1983年提出了一种非常简单的年提出了一种非常简单的利用致病类型利用致病类型对细菌类微生物杀虫剂进行分类对细菌类微生物杀虫剂进行分类的方法，虽然这种方法不太的方法，虽然这种方法不太适合适合Bt（例如，许多亚种产生的
20、毒素涵盖了多种不同致病（例如，许多亚种产生的毒素涵盖了多种不同致病型），但是对于型），但是对于Bt商品化产品来说是一种比较适合的分类方商品化产品来说是一种比较适合的分类方式。式。34 致病型致病型A:包括对包括对鳞翅目鳞翅目的致病菌（的致病菌（BTSBTS在美国已注册应在美国已注册应用于用于5050多种蔬菜、多种蔬菜、3030多种水果、多种水果、3030种田间谷物、种田间谷物、1515种牧草种牧草及香料、草垫植物、观赏植物、景观植物和多种热带植物。及香料、草垫植物、观赏植物、景观植物和多种热带植物。这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，
21、如黏虫、地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉如黏虫、地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉食心虫和烟草食心虫等）食心虫和烟草食心虫等）另外有些公司利用遗传工程技术使得另外有些公司利用遗传工程技术使得BtBt菌寄主范围扩大，菌寄主范围扩大，并且延长了其在田并且延长了其在田间的存活时间。同时利用融合两个不同间的存活时间。同时利用融合两个不同株系发展出一些新产品，甚至新的株系。株系发展出一些新产品，甚至新的株系。35致病型致病型B:包括对包括对双翅目双翅目的致病菌（以色列亚种，首先的致病菌（以色列亚种，首先在美国注册，已在全球范围内作为控制蚊虫和蚋的人工在美国注册，已在全球范围内作为控制蚊
22、虫和蚋的人工合成有机杀虫剂的替代品使用。在德国广泛用于控制当合成有机杀虫剂的替代品使用。在德国广泛用于控制当地的顽固性公共卫生害虫地的顽固性公共卫生害虫伊蚊，该菌同时也被伊蚊，该菌同时也被WHOWHO和和UNUN纳入到其蚊虫控制计划中。作用机理都为芽孢中的纳入到其蚊虫控制计划中。作用机理都为芽孢中的四个主要活性蛋白起作用）四个主要活性蛋白起作用）36致病型致病型C:则主要包括对则主要包括对鞘翅目鞘翅目的致病菌（日本金龟子芽的致病菌（日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌是美国注册的最早的微生物杀虫剂，孢杆菌和缓病芽孢杆菌是美国注册的最早的微生物杀虫剂，对鞘翅目害虫的活性均来自于外毒素和内毒素的混合或
23、单对鞘翅目害虫的活性均来自于外毒素和内毒素的混合或单独的作用）。独的作用）。372)鉴定鉴定 种以下可按鞭毛抗原、生理生化，酯酶电泳分为变种(var.)或亚种(subsp.)，现在已有60多个血清型80多个亚种。38生理生化生理生化:细菌、病毒常用对生理生化反应的正负细菌、病毒常用对生理生化反应的正负和强弱来区分。和强弱来区分。BtBt可利用各亚种间生理生化上的差可利用各亚种间生理生化上的差异，如对碳源和氮源的利用及某些酶类和代谢产物异，如对碳源和氮源的利用及某些酶类和代谢产物的有无来区分。这种方法简便易行常用，但亲缘较的有无来区分。这种方法简便易行常用，但亲缘较近的变种之间差别往往很小，容易
24、导致错误。近的变种之间差别往往很小，容易导致错误。39 酯酶电泳酯酶电泳:比一般生化反应具有较高的特异性，比一般生化反应具有较高的特异性，实验条件要求较严格，应有对照酯酶型菌种。实验条件要求较严格，应有对照酯酶型菌种。PCR技术用于技术用于Bt基因分类基因分类 40H抗原抗原:H H为德语为德语Hauch(Hauch(扩散扩散)之意，不同亚种抗原分析的血之意，不同亚种抗原分析的血清学反应则具有较高的鉴别能力，是清学反应则具有较高的鉴别能力，是利用细菌或其某一部分利用细菌或其某一部分构造具有的特异性抗原注射动物体内，促使动物血清中产生构造具有的特异性抗原注射动物体内，促使动物血清中产生和抗原起作
25、用的抗体，抗体存在于动物血清中，利用已知的和抗原起作用的抗体，抗体存在于动物血清中，利用已知的抗血清可以检定未知的菌种。抗血清可以检定未知的菌种。抗原和抗体可以发生多种不同抗原和抗体可以发生多种不同的作用，常用凝集反应。根据未知菌种和已知抗血清在试管的作用，常用凝集反应。根据未知菌种和已知抗血清在试管中有无凝集现象便可判别此菌是否为与抗血清相应的菌种。中有无凝集现象便可判别此菌是否为与抗血清相应的菌种。BtBt鞭毛具有这种特异抗原性，能用血清方法加以鉴别。鞭毛具有这种特异抗原性，能用血清方法加以鉴别。41苏云金杆菌的分类方式423)命名命名 苏云金芽胞杆菌新亚种的命名主要是根据四条苏云金芽胞杆
26、菌新亚种的命名主要是根据四条:根据根据采集地采集地:如苏云金亚种、肯尼亚亚种、加拿大亚种、如苏云金亚种、肯尼亚亚种、加拿大亚种、以色列亚种、九州亚种、东北亚种以色列亚种、九州亚种、东北亚种(九州和东北为日本省名九州和东北为日本省名)、云南亚种、武汉亚种、华中亚种、山东亚种等。云南亚种、武汉亚种、华中亚种、山东亚种等。根据根据寄主虫名寄主虫名:如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。根据根据分离者分离者名字：名字：如如Kurstak、Thompson、Morrison等。等。根据根据病症病症进行命名：进行命名：如猝倒亚种、亚毒亚种、杀虫亚种如猝倒亚种、亚毒亚种
27、、杀虫亚种等。等。434)苏云金芽胞杆菌的来源与分离苏云金芽胞杆菌的来源与分离 MartinMartin等等19901990年在澳洲年在澳洲AdelaideAdelaide举行的第五届举行的第五届ICIPICIP会议上，统计了会议上，统计了BtBt菌株的分离情况：菌株的分离情况：22%22%来于来于昆虫体、昆虫体、44%44%来源于土壤，来源于土壤，18%18%来自贮藏物，其他来自贮藏物，其他(粉尘、植物等粉尘、植物等)占占16%16%。地理区域地理区域：目前目前除南极洲除南极洲未见报道外，其他地区均有发现未见报道外，其他地区均有发现BTBT。在。在海拔近海拔近4 4英里的高处英里的高处几乎没
28、有昆虫生存，而在那里科学家仍几乎没有昆虫生存，而在那里科学家仍发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的BtBt菌种。菌种。44存在环境：存在环境：昆虫：昆虫：许多许多BtBt分离自蚕分离自蚕(场场)等饲养昆虫体上。等饲养昆虫体上。贮藏产品：贮藏产品：第一株正式命名的第一株正式命名的BtBt分离于德国苏云分离于德国苏云金地区面粉厂的地中海粉螟上。金地区面粉厂的地中海粉螟上。植物体表面：植物体表面：近年来随着研究的不断深入，发现近年来随着研究的不断深入，发现植物体表面亦存在植物体表面亦存在BtBt。45 土壤：土壤：土壤是微生物的大本营，土壤是微生物的大本营，苏云金芽胞杆苏云金
29、芽胞杆菌是一种土壤习居菌菌是一种土壤习居菌。MartinMartin和和TraversTravers从土壤中从土壤中找到新的找到新的BtBt菌种，这一事实改变了菌种，这一事实改变了BtBt菌的历史。因菌的历史。因为起初科学家们认为，只有找到死昆虫才能找到这为起初科学家们认为，只有找到死昆虫才能找到这些细菌。本来以为它是一种昆虫病，但些细菌。本来以为它是一种昆虫病，但实践证明，实践证明，BtBt实际上是多种土壤中的正常组份实际上是多种土壤中的正常组份。46(3)苏云金芽胞杆菌的菌种保藏苏云金芽胞杆菌的菌种保藏 1)原理和要求原理和要求 BtBt芽孢具有芽孢具有高度的抗逆性高度的抗逆性，经几十年后
30、仍保持，经几十年后仍保持萌发能力，并能正常发育成营养细胞。萌发能力，并能正常发育成营养细胞。菌种保藏要求的总菌种保藏要求的总原则是代谢速度尽量低，同时原则是代谢速度尽量低，同时又不失活。又不失活。主要有采用主要有采用液氮、冷冻液氮、冷冻等的等的低温保藏低温保藏、石蜡油石蜡油的的隔氧保藏隔氧保藏和和砂土管的砂土管的干燥保藏干燥保藏等方法。等方法。472)保存方法保存方法砂土管保藏：砂土管保藏：取干净河沙，用取干净河沙，用0.1N0.1N盐酸和盐酸和0.1N0.1N氢氧化钠溶液交替处理后，氢氧化钠溶液交替处理后，用自来水冲洗至中性，烘干后用磁铁吸去其中铁屑，用自来水冲洗至中性，烘干后用磁铁吸去其中
31、铁屑，6060目过筛后待目过筛后待用。同时取有机质少的砂壤土烘干、研碎、用。同时取有机质少的砂壤土烘干、研碎、120120目过筛。按目过筛。按2:12:1混合混合砂和土，砂和土，2-3g/2-3g/管装入管装入1 110cm10cm厚壁指形管，用棉塞塞好，湿热灭菌厚壁指形管，用棉塞塞好，湿热灭菌2 2次，干热灭菌次，干热灭菌1 1次，用次，用LBLB液体培养基检查无菌后使用。液体培养基检查无菌后使用。在无菌条件下，在每支砂土管吸入在无菌条件下，在每支砂土管吸入0.3ml0.3ml左右芽孢悬液，塞上左右芽孢悬液，塞上棉塞。置真空干燥器内用真空泵抽干。棉塞。置真空干燥器内用真空泵抽干。48冷冻干燥
32、法：冷冻干燥法：美国农业部美国农业部Brownsville LabBrownsville Lab常采用此法。它的原理是首先使常采用此法。它的原理是首先使微生物冷冻，然后减压升华其中的水分，最后达到干燥的目的。微生物冷冻，然后减压升华其中的水分，最后达到干燥的目的。滤纸条保藏法：滤纸条保藏法：法国法国PasteurPasteur研究所采用此法。将研究所采用此法。将BtBt芽孢悬液吸附到滤纸条上，芽孢悬液吸附到滤纸条上，干燥后加以保存。干燥后加以保存。将滤纸剪成长条，每支安瓿管内放将滤纸剪成长条，每支安瓿管内放1-31-3条，湿热灭菌后烘干备条，湿热灭菌后烘干备用。用脱脂牛奶制成浓的菌悬液后，再用
33、灭菌注射器或长的毛细管用。用脱脂牛奶制成浓的菌悬液后，再用灭菌注射器或长的毛细管把悬液滴在滤纸条上，以滤纸条完全湿润为止。将安瓿管置于真空把悬液滴在滤纸条上，以滤纸条完全湿润为止。将安瓿管置于真空干燥器内抽真空使其干燥再封口保存。干燥器内抽真空使其干燥再封口保存。49液体石蜡斜面保藏法：液体石蜡斜面保藏法：日本九州大学常用斜面橡皮塞法保存，此法主要是利用低湿日本九州大学常用斜面橡皮塞法保存，此法主要是利用低湿和缺氧来保藏菌种。当菌种接种于和缺氧来保藏菌种。当菌种接种于LBLB斜面斜面3030培养培养7272小时后，倾小时后，倾入已灭菌的液体石蜡至完全淹没斜面为止。入已灭菌的液体石蜡至完全淹没斜
34、面为止。菌膜保藏法：菌膜保藏法：该法存活力高，便于邮寄，使菌种保藏微型化。把菌种膜片该法存活力高，便于邮寄，使菌种保藏微型化。把菌种膜片干燥后装入无菌乙烯薄膜，菌种袋封口后即可邮寄。干燥后装入无菌乙烯薄膜，菌种袋封口后即可邮寄。503)研究和保存机构研究和保存机构 目前国内外许多研究和生产单位均保藏有大量目前国内外许多研究和生产单位均保藏有大量BtBt菌种。菌种。美国美国EcogenEcogen公司保存公司保存90009000株左右株左右BtBt菌，美国农业部菌，美国农业部Brownsville LabBrownsville Lab保存了保存了HD-XHD-X系列，俄亥俄州州立大学保系列，俄亥
35、俄州州立大学保存的大量的突变株。存的大量的突变株。法国法国巴斯德研究所昆虫病原研究中心亦是巴斯德研究所昆虫病原研究中心亦是WHOWHO昆虫病昆虫病原细菌参考中心，保藏有原细菌参考中心，保藏有35003500株芽孢杆菌。株芽孢杆菌。51 英国英国温室作物研究所温室作物研究所H.BurgesH.Burges博士以博士以HB-XHB-X系列编系列编号保藏。号保藏。日本日本九州大学九州大学AizawaAizawa和和OhhaOhha博士及北海道大学博士及北海道大学IIZUKAIIZUKA教授均保存有较多的教授均保存有较多的BtBt资源。资源。国内国内的的华中农大华中农大农业部微生物重点实验室芽孢杆农业
36、部微生物重点实验室芽孢杆菌研究室、菌研究室、中国林业科学院中国林业科学院、湖北农科院湖北农科院BtBt研究及开研究及开发中心、发中心、中国科学院武汉病毒所中国科学院武汉病毒所、福建农林大学福建农林大学生物生物中心均保存有一定数量的中心均保存有一定数量的BtBt菌株。菌株。52(4)(4)作用机制作用机制主要是毒素发挥作用主要是毒素发挥作用 伴孢晶体伴孢晶体（最早发现）（最早发现）随后发现的：苏云金素、营养期杀随后发现的：苏云金素、营养期杀虫蛋白（虫蛋白（VIPsVIPs）、几丁质酶、卵磷脂）、几丁质酶、卵磷脂酶、肠毒素等。酶、肠毒素等。53生物活性物质生物活性物质苏云金芽胞杆苏云金芽胞杆菌活性
37、因子菌活性因子胞内胞内胞外胞外苏云金素苏云金素双效菌素双效菌素营养期杀虫蛋白营养期杀虫蛋白活芽胞活芽胞死芽胞死芽胞芽胞衣芽胞衣芽胞芽胞杀虫晶体蛋白杀虫晶体蛋白免疫抑制因子免疫抑制因子A肠毒素肠毒素辅助蛋白辅助蛋白自身诱导物抑制蛋白自身诱导物抑制蛋白蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质核苷类核苷类多元醇类多元醇类酶类酶类几丁质酶几丁质酶卵磷酯酶卵磷酯酶C溶血素溶血素54原生动物原始后生动物海绵动物 扁形动物门轮虫纲 腹毛纲 线虫动物门软体动物门环节动物门节肢动物门鳞翅目双翅目鞘翅目膜翅目螨类 等9个目纽形动物门 棘皮动物门苔藓动物门腕足动物门半索动物门脊椎动物门癌细胞植物线虫动物线虫丝虫 活活 性性 谱谱疟
38、原虫血吸虫,肺吸虫55主要的活性因子：主要的活性因子：杀虫晶体蛋白（ICPs，主要杀虫毒素）：包括晶体蛋白（Cry）和溶细胞蛋白（Cyt）苏云金素 营养期杀虫蛋白（VIPs）56杀虫晶体蛋白的作用机制杀虫晶体蛋白的作用机制 五个环节五个环节：昆虫肠道溶解、酶解活化、与受体结昆虫肠道溶解、酶解活化、与受体结合、膜孔形成、细胞裂解。合、膜孔形成、细胞裂解。昆虫取食后，内毒素首先在昆虫中肠昆虫取食后，内毒素首先在昆虫中肠水解为具有活性的小水解为具有活性的小分子肽分子肽，通过围食膜与中肠上皮细胞上的，通过围食膜与中肠上皮细胞上的受体结合受体结合。昆虫中。昆虫中肠被麻痹，停止取食。肠被麻痹，停止取食。毒
39、素毒素插入膜内并引起损伤或穿孔插入膜内并引起损伤或穿孔。这种穿孔。这种穿孔破坏了钾离破坏了钾离子梯度平衡子梯度平衡，从而，从而导致细胞表面突起膨胀，坏死导致细胞表面突起膨胀，坏死，使昆虫中，使昆虫中肠的完整性受到破坏，其中的内含物渗漏到体腔中。肠的完整性受到破坏，其中的内含物渗漏到体腔中。57作用机制作用机制伴孢晶体伴孢晶体鳞翅目幼虫口服鳞翅目幼虫口服伴孢晶体在肠道迅速溶解伴孢晶体在肠道迅速溶解（中肠（中肠pHpH为为9.0-10.59.0-10.5）吸附于上皮细胞，引起渗透性丧失，肠道穿孔吸附于上皮细胞，引起渗透性丧失，肠道穿孔昆虫不再进食，昆虫不再进食，1 13 3天后饿死天后饿死 58(
40、5)安全性安全性 国内外进行了一系列大量而细致的试验，证明对脊椎动物是安全的，故WHO和FAO极力推荐生产应用。使用使用Bt制剂仍需慎重：制剂仍需慎重：产-外毒素（苏云金素）菌株对哺乳动物有害。BtBt近缘种近缘种有能产生食物毒素、引起腹泻、呕吐、恶心的蜡螟芽孢杆菌蜡螟芽孢杆菌和引起人、畜炭疽病和肺损伤和肠道感染的炭疽芽孢杆菌；以色列亚种溶液炭疽芽孢杆菌；以色列亚种溶液的的伴孢晶体毒素对动物有毒。对于Bt制剂的开发，从长期的眼光来考虑仍需注意安全性问题。59(6)毒力评价标准与质量标准毒力评价标准与质量标准 早先，早先，BtBt质量是以芽孢含量为标准的。但不同制剂的毒力并不质量是以芽孢含量为标
41、准的。但不同制剂的毒力并不与芽孢的含量成正相关。与芽孢的含量成正相关。一些芽孢含量相等的制剂其毒力并不相同，一些芽孢含量相等的制剂其毒力并不相同，有时芽孢含量高的制剂毒力反不如芽孢含量低的制剂。有时芽孢含量高的制剂毒力反不如芽孢含量低的制剂。产生这种情况的原因是因为产生这种情况的原因是因为BtBt杀虫活性是由晶体毒素、芽孢杀虫活性是由晶体毒素、芽孢及其他因素共同决定的，而且晶体是主要的杀虫因素，芽孢是较次及其他因素共同决定的，而且晶体是主要的杀虫因素，芽孢是较次要的杀虫因素，单是芽孢含量高并不能决定毒力也高。要的杀虫因素，单是芽孢含量高并不能决定毒力也高。另外，芽孢数随产品贮存时间延长而降低，
42、特别是液剂下降另外，芽孢数随产品贮存时间延长而降低，特别是液剂下降速度更快。所以发展了速度更快。所以发展了用生物测定的方法来检测制剂的毒力（用生物测定的方法来检测制剂的毒力（IUIU单单位，国际标准单位）。位，国际标准单位）。60 1966年国际昆虫病理和微生物防治学会建议：年国际昆虫病理和微生物防治学会建议：法国巴斯德研究所生产的法国巴斯德研究所生产的E-61E-61作为国际标准制剂作为国际标准制剂，该剂的毒，该剂的毒力效价定为力效价定为1000IU(1000IU(国际单位国际单位)，试虫试虫为为地中海粉螟地中海粉螟。其它其它BTBT制剂用生测方法与制剂用生测方法与E-61E-61比较毒力，
43、用比较毒力，用IU/mgIU/mg来毒力效价。来毒力效价。样品的毒力效价样品的毒力效价=(=(标准品的标准品的LCLC5050/样品的样品的LCLC5050)*标准品的毒效标准品的毒效(IU/mg)(IU/mg)61(7)生产生产 自自19381938年法国第一个产品年法国第一个产品SporeineSporeine面世以来，面世以来，6060年代后，美国、年代后，美国、前苏联、加拿大、捷克、比利时、法国、德国、罗马尼亚、朝鲜、前苏联、加拿大、捷克、比利时、法国、德国、罗马尼亚、朝鲜、芬兰、泰国等国均相继办厂。芬兰、泰国等国均相继办厂。中国中国在农业部的注册厂家已在农业部的注册厂家已超过超过76
44、76家家(2010(2010年年)，年产量达，年产量达20-20-3030万吨，在国内的东西南北地区均有建厂。万吨，在国内的东西南北地区均有建厂。目前目前BtBt生产主要有生产主要有液体深层发酵液体深层发酵和和半固体发酵半固体发酵两种。生产工两种。生产工艺主要牵涉到菌种、培养基和培养条件，后处理工艺、防止噬菌体艺主要牵涉到菌种、培养基和培养条件，后处理工艺、防止噬菌体污染等几方面。污染等几方面。62产品登记要求：产品登记要求：综合综合WHOWHO、Burges(1982)Burges(1982)、SIPSIP协议、协议、EPAEPA（美国环保署）、（美国环保署）、EECEEC（欧洲经济共同体）
45、等方面法规，在（欧洲经济共同体）等方面法规，在产品登记时应提供以产品登记时应提供以下下1010个方面的材料个方面的材料:产品资料产品资料:名称、类型、含菌数、稀释剂、惰性成份、保护剂名称、类型、含菌数、稀释剂、惰性成份、保护剂 细菌鉴定细菌鉴定:学名学名、俗名、鉴定标准及程序、俗名、鉴定标准及程序 细菌生物学特性细菌生物学特性:目标寄主种类、病原性、应用历史、最高、适目标寄主种类、病原性、应用历史、最高、适宜温度、天然发生、地理分布、寄主范围、稳定性宜温度、天然发生、地理分布、寄主范围、稳定性63 质量检验质量检验:标准化方法等 应用和应用方法应用和应用方法:农业、园林、森林保护种类、控制害虫
46、阶段、应用时间、方法和比例 有效性的实验数据有效性的实验数据:室内、野外、田间、抗性资料 残留残留 对哺乳动物感染和毒性对哺乳动物感染和毒性 对人的影响对人的影响 对环境和野生动物的危险64(8)剂型剂型1)液剂：包括液剂：包括悬浮剂悬浮剂、乳剂乳剂、水剂水剂和和油剂油剂等等 使用普遍和方便的剂型，是经发酵后收获到的使用普遍和方便的剂型，是经发酵后收获到的芽孢和晶体以水悬液保存，再加适当的展着剂，粘芽孢和晶体以水悬液保存，再加适当的展着剂，粘着剂及防腐剂而成。除水剂外，尚有乳剂。乳剂是着剂及防腐剂而成。除水剂外，尚有乳剂。乳剂是将离心收集到的芽孢、晶体加入乳化剂中均匀混合将离心收集到的芽孢、晶
47、体加入乳化剂中均匀混合而成。此外，还有以油类作为载体的油剂，它多用而成。此外，还有以油类作为载体的油剂，它多用于空中喷雾防治森林害虫。于空中喷雾防治森林害虫。液剂保存时间不太长，一般液剂保存时间不太长，一般3-63-6个月内不会沉淀个月内不会沉淀失效。失效。652)可湿性粉剂：可湿性粉剂：100亿个芽孢亿个芽孢/克可湿性粉、克可湿性粉、16000国际单位国际单位WP 其用途是制成悬液喷雾用，为此，产品中加入其用途是制成悬液喷雾用，为此，产品中加入了湿润剂。其作用在于使菌剂的微小颗粒有亲水性，了湿润剂。其作用在于使菌剂的微小颗粒有亲水性，能在水中很好地溶化和分散，并使菌悬液能在植物表能在水中很好
48、地溶化和分散，并使菌悬液能在植物表面展着和附着。面展着和附着。该产品是目前主要产品，保存两年质量不变，该产品是目前主要产品，保存两年质量不变，包装、运输方便，杀虫效果稳定，用于低矮作物包装、运输方便，杀虫效果稳定，用于低矮作物(如蔬如蔬菜类菜类)或潮湿地区效果很好。或潮湿地区效果很好。663)胶囊剂胶囊剂 可湿性粉剂赋形后的颗粒外边包以易溶于水的胶囊，可湿性粉剂赋形后的颗粒外边包以易溶于水的胶囊，这样既可防止阳光、高温和干燥对芽孢和晶体的伤害和破这样既可防止阳光、高温和干燥对芽孢和晶体的伤害和破坏，又可使毒性成分在较长时间内逐渐释放出来，在较长坏，又可使毒性成分在较长时间内逐渐释放出来，在较长
49、时间内保持毒效。保护剂可防止紫外辐射的伤害作用。时间内保持毒效。保护剂可防止紫外辐射的伤害作用。676869(9)应用应用 1)蔬菜 2)棉花 3)水稻 4)玉米、高梁、小麦 5)果树、茶叶、花卉 6)烟草和油料害虫 7)森林害虫 8)仓贮害虫 9)卫生昆虫70(10)注意事项注意事项 1)药效缓慢，提前23天用药，第二次施药 2)不能与内吸性有机磷农药或杀菌剂混用 3)对家蚕毒力强，养蚕地区慎用 4)防潮、防晒，贮于阴凉干燥处 5)菌液随配随用，以免孢子荫发712、青虫菌、青虫菌蜡螟杆菌三号蜡螟杆菌三号 由苏云金杆菌蜡螟变种发酵、加工成的制剂由苏云金杆菌蜡螟变种发酵、加工成的制剂 1 1）作
50、用特点：）作用特点：胃毒作用胃毒作用。昆虫食入后很快停止进食。芽孢在虫体内发芽，进入体腔，利用昆虫体液大量繁殖，使虫得败血症而死。病虫粪便和死虫再传染其他害虫，引起流行病，从而控制害虫危害。杀虫范围：杀虫范围：主要对鳞翅目害虫有效。杀虫速度慢，施药后一般23天见效，有时要45天。因是活芽孢起杀虫作用，故药效受环境影响大。722)制剂制剂 100亿活芽孢/克青虫菌粉剂 辽宁生物农药厂3)毒性毒性 对家蚕有毒 对人畜无毒 对蜜蜂安全 对植物安全 不污染环境734)使用方法使用方法 可防治菜青虫、大豆造桥虫、烟青虫、玉米螟、松毛可防治菜青虫、大豆造桥虫、烟青虫、玉米螟、松毛虫、刺蛾、舟形毛虫、稻纵卷
