1、1第二十六章 病毒感染的诊断v检测病毒颗粒v检测病毒成分（抗原、核酸）v检测病毒抗体2第一节 病毒的分离培养3 1、采集时间：用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本，应采集病人急性期急性期标本。血清学检查的标本最好取双份。2、标本种类：根据不同病毒感染采集不采集不同部位同部位标本(如鼻咽拭子、脑脊液、血液、粪便或疱疹液)。一、标本的采集41、标本运送：应立即送检，运送标本中注意冷藏冷藏。保存于含抗生素的运送液中。不能立即送检时应存放于-70低温冰箱或液氮内保存。2、标本处理：有杂菌标本应用高浓度抗生素抗生素处理（处理（44）并离心）并离心。二、标本的处理和运送5细胞培养动物接种 鸡胚接种 三、分
2、离培养6（一）细胞培养 是从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。7倒置显微镜观察细胞8细胞培养的优点：v 来源方便，容易选择易感细胞。v 无免疫力，利于病毒生长。v 培养条件易于控制：可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分。v 接种量大：细胞可以大量生产，而且还可较久地持续培养。动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制。v 加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速，早出结果。91、细胞类型v原代细胞 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长。（人胚肺细胞，鸡胚细胞、猴肾细胞、兔肾细胞等）10
3、v二倍体细胞 在体外连续培养5060代仍保持其二倍染色体数目的细胞。为生产人用疫苗的首选细胞株。为生产人用疫苗的首选细胞株。v传代细胞 能在体外连续传代，来自肿瘤细胞或发生自发转化、突变的原代细胞或二倍体细胞株。11 优优 点点 缺缺 点点 用用 途途原代细胞原代细胞 多种V敏感 来源困难 分离二倍体细胞二倍体细胞 多种V敏感 诊断/疫苗制备 来源易,50代传代细胞传代细胞 无限传代，来源易 致瘤性 分离/鉴定/研究V122、病毒在细胞内增殖的指征（1）细胞的变化p细胞病变效应细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)(cytopathic effect,CPE)：病毒在细胞内
4、增殖后，可引起细胞形态学改变，如细胞肿胀、变圆、皱缩、融合或细胞聚集成葡萄串状，甚至细胞溶解或脱落等，这种可在普通光镜下看到的由病毒增殖引起的细胞形态变化，称为CPE。13细胞病变效应（CPE）1415定义定义：有些病毒感染细胞，在普通显微镜下可见胞浆或胞核内出现嗜酸性或嗜碱性，圆形、椭圆形或不规则形的斑块结构，称为包涵体。本质本质：病毒颗粒聚集体、病毒增殖留下的痕迹、病毒感染引起的细胞反应物。p包涵体（包涵体（inclusion bodyinclusion body）形成）形成16 意义意义：不同的病毒形成的包涵体特征（大小、形态、嗜性等）各异，故可作为诊断依据。如狂犬病病毒在脑组织细胞内形
5、成的胞浆内嗜酸性的内基小体（Negri body），可辅助诊断狂犬病。17包涵体18包涵体形成19（2）红细胞吸附现象 某些病毒感染的宿主细胞能吸附脊椎动物的红细胞。（3）干扰现象 20最早的病毒培养方法；根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。（二）动物接种21（三）鸡胚培养22232425流感病毒分离培养的流感病毒分离培养的最好方法是鸡胚接种最好方法是鸡胚接种：初次分离初次分离羊膜腔羊膜腔，传代培养传代培养尿囊腔尿囊腔，然后取羊水或尿囊液做血凝和血凝抑制试验鉴定。26p初步鉴定初步鉴定血凝试验血凝试验：羊水羊水/尿囊液尿囊液+鸡鸡RBC 红细胞凝集红细胞凝集 表明可能有病毒存在和增殖
6、。表明可能有病毒存在和增殖。p确证确证血凝抑制试验血凝抑制试验：已知流感病毒抗体已知流感病毒抗体+羊水羊水/尿囊液尿囊液+鸡鸡RBC 无凝集无凝集凝凝 集集流感病毒增殖流感病毒增殖非流感病毒增殖非流感病毒增殖27正常鸡红细胞正常鸡红细胞凝集红细胞凝集红细胞28沉积沉积凝集凝集29四、病毒的鉴定1、病毒种类与型别鉴定v 初步鉴定：动物感染范围及潜伏期、对鸡胚的敏感性、细胞形态变化类型、红细胞吸附、病毒干扰现象、血凝性质、理化性质（核酸类型测定、大小形态、乙醚敏感试验、耐酸试验）等。v 最后鉴定：主要是血清学方法（中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、IFA和ELISA等）和分子生物学方法。302
7、、病毒感染性测定v50%组织培养感染量（50%tissue culture infective dose，TCID5050）：引起半数培养细胞发生病变（CPE）的病毒量。v蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：在细胞培养表面覆盖一层半固体物质使细胞病变形成蚀斑。病毒标本（充分稀释）单层细胞 37，60min，吸附，洗涤覆盖琼脂 37，35d观察蚀斑（中性红/结晶紫染色）PFU/mlPFU/ml：定量测定病毒感染性定量测定病毒感染性321、光学显微镜检查：检查包涵体2、电子显微镜检查：如轮状病毒、冠状病毒等 五、形态学检查33轮状病毒34第二节 检测病毒抗原v免疫荧光检
8、测（IFA）v放射免疫测定（RIA）v酶免疫技术（EIA）等35第三节 检测病毒抗体1、中和试验：中和试验是指病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。可用来检查患病后或人工免疫后机体血清中抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒或研究其抗原结构。中和抗体特异性高，维持时间较长，因此流行病学常用此法。36 2血凝抑制试验：许多病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称为血凝现象。这种现象能被相应抗体所抑制，称血凝抑制试验。常用于含血凝素的病毒（如流感病毒、乙脑病毒）的辅助诊断和流行病学调查。3补体结合试验：可作为近期感染的指标。4ELISA：可检测多种病毒抗体，应用广泛。37第四节 检
9、测病毒核酸v核酸分子杂交技术vPCR 如HBV、HCV、HSV、CMV等的检测。38标本采集分离培养鉴定分离培养鉴定快速诊断快速诊断鸡胚培养鸡胚培养血凝试验血凝抑制试验细胞培养细胞培养CPE电镜检测中和试验免疫荧光TCID50测定Pfu测定动物接种动物接种发病情况中和试验免疫学检测ID50测定LD50测定形态学形态学电镜观察病毒颗粒光学显微镜观察包涵体病毒成分检测病毒成分检测抗原检测抗原检测ELISAIFARIAWB核酸检测核酸检测核酸电泳核酸杂交PCR基因芯片基因测序抗体检测抗体检测中和试验ELISAIFARIAWB病毒感染的检查程序病毒感染的检查程序39本章学习重点内容v病毒感染的检查标本
10、采集和送检原则v病毒分离培养的方法v用于培养病毒的三类细胞的优缺点及主要用途v病毒在细胞内增殖的主要指标v病毒感染的常用诊断方法40第27章 病毒感染的治疗和预防41第一节 病毒感染的治疗一、抗病毒药物1、核苷类药物：是最早用于抗病毒治疗的药物。v 无环鸟苷(acyclovir，ACV)及丙氧鸟苷(ganciclovir，DHPG)，是新一代的核苷类药物。v 碘尿苷(IDU，商品名疱疹净)；v 3氮唑核苷（病毒唑）422、非核苷类：如DNA多聚酶抑制物、逆转录酶抑制物。3、病毒蛋白酶的抑制物4、免疫制剂：现有病毒的特异性免疫球蛋白（抗-HBs）、人免疫球蛋白、单克隆抗体等。干扰素干扰素或干扰素
11、诱生剂以及细胞因子IL-12，TNF等。435、其他：一批中草药等天然药物如黄芪、板蓝根、大青叶等具有抑制病毒复制作用。金刚烷胺可抑制流感病毒脱衣壳。44吸附吸附受体抑制剂受体抑制剂配体抑制剂配体抑制剂中和抗体中和抗体穿入穿入金刚烷胺金刚烷胺脱壳脱壳生物合成生物合成装配、释放装配、释放核苷类似物核苷类似物干扰素干扰素酶抑制剂酶抑制剂45Fig A)HIV attach to a CD4 receptor.B)A soluble synthetic version of the receptor can prevent attachment of the virus.46二、治疗性疫苗三、基因治
12、疗vRNA干扰（RNA interference，RNAi）v反义寡核苷酸47第二节 免疫预防人工免疫对于预防病毒性感染有重要意义。48一、被动免疫v天然被动免疫：通过胎盘及哺乳。v人工被动免疫：常用的制剂有丙种球蛋白、免疫血清丙种球蛋白、免疫血清等。注射入丙种球蛋白对肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等可紧急预防。含有高滴度抗-HBs的乙型肝炎特异性免疫球蛋白可预防乙型肝炎。49传统疫苗 1）灭活疫苗 2）减毒活疫苗Fig Edward Jenner vaccinating(inoculating)James Phipps with cowpox material.二、人工主动免疫50 目前常用的灭活疫
13、苗有流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、流感灭活疫苗等。目前常用的减毒活疫苗有脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹疫苗、流感疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、甲型肝炎疫苗等。511）基因工程疫苗2）核酸疫苗3）其他类型的疫苗新型疫苗新型疫苗52 表25-1 我国常用的病毒疫苗 疫苗名称 疫苗种类(培养细胞种类)毒株来源脊髓灰质炎疫苗 减毒活疫苗(人二倍体，Vero细胞)美国Sabin，型 中17，中2株 麻疹疫苗 减毒活疫苗(鸡胚细胞)沪191，长47 株 流行性腮腺炎疫苗 减毒活疫苗(鸡胚细胞)上海S79株 风疹疫苗 减毒活疫苗(人二倍体细胞)北京BRD体 甲型肝炎疫苗 减毒活疫苗(人二倍体细胞)杭州H2株
14、，上海-长春L-A-1株 人用狂犬病疫苗 灭活疫苗(地鼠肾细胞)北京aG株 乙型脑炎疫苗 灭活疫苗(地鼠肾细胞)北京P3株 森林脑炎疫苗 灭活疫苗(地鼠肾细胞)森长株 乙型肝炎疫苗 基因工程疫苗(酵母菌表达)由美国Merck公司引进 11醉翁亭记 1反复朗读并背诵课文，培养文言语感。2结合注释疏通文义，了解文本内容，掌握文本写作思路。3把握文章的艺术特色，理解虚词在文中的作用。4体会作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、导入新课范仲淹因参与改革被贬，于庆历六年写下岳阳楼记，寄托自己“先天下之忧而忧，后天下之乐而乐”的政治理想。实际上，这次改革，受到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革
15、的另一位支持者北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊于岳阳楼记的千古名篇醉翁亭记。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导学一：认识作者，了解作品背景作者简介：欧阳修(10071072)，字永叔，自号醉翁，晚年又号“六一居士”。吉州永丰(今属江西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“唐宋八大家”。后人
16、又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。关于“醉翁”与“六一居士”：初谪滁山，自号醉翁。既老而衰且病，将退休于颍水之上，则又更号六一居士。客有问曰：“六一何谓也？”居士曰：“吾家藏书一万卷，集录三代以来金石遗文一千卷，有琴一张，有棋一局，而常置酒一壶。”客曰：“是为五一尔，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之间，岂不为六一乎？”写作背景：宋仁宗庆历五年(1045年)，参知政事范仲淹等人遭谗离职，欧阳修上书替他们分辩，被贬到滁州做了两年知州。到任以后，他内心抑郁，但还能发挥“宽简而不扰”的作风，取得了某些政绩。醉翁亭记就是在这个时期写就的。目标导学二：朗读文章，通文顺字1初读文章，
17、结合工具书梳理文章字词。2朗读文章，划分文章节奏，标出节奏划分有疑难的语句。节奏划分示例环滁/皆山也。其/西南诸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，琅琊也。山行/六七里，渐闻/水声潺潺，而泻出于/两峰之间者，酿泉也。峰回/路转，有亭/翼然临于泉上者，醉翁亭也。作亭者/谁？山之僧/曰/智仙也。名之者/谁？太守/自谓也。太守与客来饮/于此，饮少/辄醉，而/年又最高，故/自号曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之间也。山水之乐，得之心/而寓之酒也。节奏划分思考“山行/六七里”为什么不能划分为“山/行六七里”？明确：“山行”意指“沿着山路走”，“山行”是个状中短语，不能将其割裂。“望之/蔚然而深秀
18、者”为什么不能划分为“望之蔚然/而深秀者”？明确：“蔚然而深秀”是两个并列的词，不宜割裂，“望之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，翻译训练1学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节奏划分。2以四人小组为单位，组内互助解疑，并尝试用“直译”与“意译”两种方法译读文章。3教师选择疑难句或值得翻译的句子，请学生用两种翻译方法进行翻
19、译。翻译示例：若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝，晦明变化者，山间之朝暮也。野芳发而幽香，佳木秀而繁阴，风霜高洁，水落而石出者，山间之四时也。直译法：那太阳一出来，树林里的雾气散开，云雾聚拢，山谷就显得昏暗了，朝则自暗而明，暮则自明而暗，或暗或明，变化不一，这是山间早晚的景色。野花开放，有一股清幽的香味，好的树木枝叶繁茂，形成浓郁的绿荫。天高气爽，霜色洁白，泉水浅了，石底露出水面，这是山中四季的景色。意译法：太阳升起，山林里雾气开始消散，烟云聚拢，山谷又开始显得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明变化的，就是山中的朝暮。春天野花绽开并散发出阵阵幽香，夏日佳树繁茂并形成一片浓荫，秋天风高气爽
20、，霜色洁白，冬日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季。【教学提示】翻译有直译与意译两种方式，直译锻炼学生用语的准确性，但可能会降低译文的美感；意译可加强译文的美感，培养学生的翻译兴趣，但可能会降低译文的准确性。因此，需两种翻译方式都做必要引导。全文直译内容见我的积累本。目标导学四：解读文段，把握文本内容1赏析第一段，说说本文是如何引出“醉翁亭”的位置的，作者在此运用了怎样的艺术手法。明确：首先以“环滁皆山也”五字领起，将滁州的地理环境一笔勾出，点出醉翁亭坐落在群山之中，并纵观滁州全貌，鸟瞰群山环抱之景。接着作者将“镜头”全景移向局部，先写“西南诸峰，林壑尤美”，醉翁亭坐落在有最美的林壑的西南诸
21、峰之中，视野集中到最佳处。再写琅琊山“蔚然而深秀”，点山“秀”，照应上文的“美”。又写酿泉，其名字透出了泉与酒的关系，好泉酿好酒，好酒叫人醉。“醉翁亭”的名字便暗中透出，然后引出“醉翁亭”来。作者利用空间变幻的手法，移步换景，由远及近，为我们描绘了一幅幅山水特写。2第二段主要写了什么？它和第一段有什么联系？明确：第二段利用时间推移，抓住朝暮及四季特点，描绘了对比鲜明的晦明变化图及四季风光图，写出了其中的“乐亦无穷”。第二段是第一段“山水之乐”的具体化。3第三段同样是写“乐”，但却是写的游人之乐，作者是如何写游人之乐的？明确：“滁人游”，前呼后应，扶老携幼，自由自在，热闹非凡；“太守宴”，溪深鱼
22、肥，泉香酒洌，美味佳肴，应有尽有；“众宾欢”，投壶下棋，觥筹交错，说说笑笑，无拘无束。如此勾画了游人之乐。4作者为什么要在第三段写游人之乐？明确：写滁人之游，描绘出一幅太平祥和的百姓游乐图。游乐场景映在太守的眼里，便多了一层政治清明的意味。太守在游人之乐中酒酣而醉，此醉是为山水之乐而醉，更是为能与百姓同乐而醉。体现太守与百姓关系融洽，“政通人和”才能有这样的乐。5第四段主要写了什么？明确：写宴会散、众人归的情景。目标导学五：深入解读，把握作者思想感情思考探究：作者以一个“乐”字贯穿全篇，却有两个句子别出深意，不单单是在写乐，而是另有所指，表达出另外一种情绪，请你找出这两个句子，说说这种情绪是什
23、么。明确：醉翁之意不在酒，在乎山水之间也。醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。这种情绪是作者遭贬谪后的抑郁，作者并未在文中袒露胸怀，只含蓄地说：“醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。”此句与醉翁亭的名称、“醉翁之意不在酒，在乎山水之间也”前后呼应，并与“滁人游”“太守宴”“众宾欢”“太守醉”连成一条抒情的线索，曲折地表达了作者内心复杂的思想感情。目标导学六：赏析文本，感受文本艺术特色1在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳
24、发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形成回环往复的韵律，使读者在诵读中获得美的享受。(3)文章写景优美，又多韵律，使人读来不仅能感受到绘画美，也能感受到韵律美。目标导学七：探索文本虚词，把握文言现象虚词“而”的用法用法文本举例表并列1.蔚然而深秀者；2.溪深而鱼肥；3.泉香而酒洌；4.起坐而喧哗者表递进1.而年又最高；2.得之心而寓之酒也表承接1.渐闻水声潺潺，而泻出于两峰之间者；2.若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝；3.野芳发而幽香，佳木秀而繁阴；4.水落而石出者；5.临溪而渔；6.太
25、守归而宾客从也；7.人知从太守游而乐表修饰1.朝而往，暮而归；2.杂然而前陈者表转折1.而不知人之乐；2.而不知太守之乐其乐也虚词“之”的用法用法文本举例表助词“的”1.泻出于两峰之间者；2.醉翁之意不在酒；3.山水之乐；4.山间之朝暮也；5.宴酣之乐位于主谓之间，取消句子独立性而不知太守之乐其乐也表代词1.望之蔚然而深秀者；2.名之者谁(指醉翁亭)；3.得之心而寓之酒也(指山水之乐)【教学提示】更多文言现象请参见我的积累本。三、板书设计路线：环滁琅琊山酿泉醉翁亭风景：朝暮之景四时之景山水之乐(醉景)风俗：滁人游太守宴众宾欢 太守醉宴游之乐(醉人)心情：禽鸟乐人之乐乐其乐与民同乐(醉情)可取之处重视朗读，有利于培养学生的文言语感，并通过节奏划分引导学生理解文意，突破了仅按注释疏通文义的桎梏，有利于引导学生自主思考；不单纯关注“直译”原则，同时培养学生的“意译”能力，引导学生关注文言文的美感，在一定程度上有助于培养学生的核心素养。不足之处文章难度相对较高，基础能力低的学生难以适应该教学。会员免费下载
