1、分子诊断分子诊断在临床检验中的应用在临床检验中的应用内内 容容 概概 览览概 述12目前常用的分子生物学技术3 分子诊断在感染性疾病中的应用4分子诊断在肿瘤疾病中的应用5 分子诊断在遗传性疾病中的应用1.概概 述述p 20 20世纪末及世纪末及2121世纪初，分子生物学出现了众世纪初，分子生物学出现了众多突破，特别是人类基因组测序计划的完成，为多突破，特别是人类基因组测序计划的完成，为分子生物学在医学临床的应用提供了更广阔的发分子生物学在医学临床的应用提供了更广阔的发展前景展前景p 20012001年年2 2月，人类基因组月，人类基因组DNADNA全序列数据公布全序列数据公布表明现代医学已经步
2、入表明现代医学已经步入“基因组医学基因组医学”时代，分时代，分子诊断应运而生子诊断应运而生p分子诊断分子诊断是以是以DNADNA和和RNARNA为诊断材料，利用分子为诊断材料，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程病的方法和过程p临床意义在于通过检测临床意义在于通过检测DNADNA或或RNARNA的结构变动与的结构变动与否，量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否否，量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。行基因治疗的
3、依据。1.概概 述述p不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能确定个不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并对疾体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断p分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分成为一门新的学科成为一门新的学科 Molecular diagnosis Molecular diagnostics 2.目前临床常用的分子生物学技术目前临床常用的分子生物学技术（1 1）PCRPCR技术技术n原理：变性、退火、延伸原理：变性、退火
4、、延伸n技术扩展：技术扩展：l反转录反转录PCRPCRl荧光定量荧光定量PCRPCRl巢式巢式PCRPCR（2 2）分子杂交技术）分子杂交技术n荧光原位杂交荧光原位杂交 19861986年创建的荧光原位杂交（年创建的荧光原位杂交（FISHFISH）是将荧光素标记）是将荧光素标记的探针与染色体或细胞间期染色质杂交，可用于基因的探针与染色体或细胞间期染色质杂交，可用于基因定位和检测基因片断是否有缺失、扩增或重排。定位和检测基因片断是否有缺失、扩增或重排。在产前诊断中常用来诊断染色体非整倍体疾病在产前诊断中常用来诊断染色体非整倍体疾病2.目前临床常用的分子生物学技术目前临床常用的分子生物学技术5计算
5、机计算机判读判读15 min后后2DNA-RNA杂交杂交60 min3抗体抗体捕获捕获60 min4化学发化学发光检测光检测30 min1DNA分解分解45 minn杂交捕获技术杂交捕获技术原理原理:利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测2.目前临床常用的分子生物学技术目前临床常用的分子生物学技术（3 3）DNADNA测序技术测序技术nDNADNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。但耗时费方法，可以确定突变的部位的突变的性质。但耗时费力且费用昂贵。力且费
6、用昂贵。n焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术亲子鉴定亲子鉴定n二代测序技术二代测序技术肿瘤易感基因、遗传病基因检测肿瘤易感基因、遗传病基因检测新一代高通量测序仪新一代高通量测序仪A,T,C,G碱基试剂芯片一次产出10G数据量实验原理实验原理半导体测序半导体测序测序时，聚合反应释放出H+（4 4）DNADNA芯片技术芯片技术 通过计算机控制点样和图像分析的支持，可通过计算机控制点样和图像分析的支持，可以在小面积的硅片或其他支持材料上固定多种探以在小面积的硅片或其他支持材料上固定多种探针，对样品中大量的杂交信号进行快速分析针，对样品中大量的杂交信号进行快速分析 可用于基因组单核苷酸多态性分析，细胞中可用
7、于基因组单核苷酸多态性分析，细胞中基因表达谱分析，遗传性疾病分析及病原微生物基因表达谱分析，遗传性疾病分析及病原微生物的大规模检测的大规模检测染色体微阵列染色体微阵列（Chromasome MicroArray Analysis，CMA）p原理：通过高通量特异性核酸探针对染色体全基原理：通过高通量特异性核酸探针对染色体全基因组进行高分辨率检测，检测常规核型分析技术无因组进行高分辨率检测，检测常规核型分析技术无法检测的基因组微小缺失和重复。法检测的基因组微小缺失和重复。“染色体芯片染色体芯片”、“基因芯片基因芯片”、“分子核型分析分子核型分析”基于微阵列的比较基因组杂交基于微阵列的比较基因组杂交
8、(aCGH)CNV单核苷酸多态性微阵列（单核苷酸多态性微阵列（SNP array）CNV 单亲二倍体单亲二倍体 三倍体三倍体 部分嵌合体部分嵌合体 p优势：分辨率高、全基因组扫描、快速优势：分辨率高、全基因组扫描、快速p局限：局限：n不能检测染色体的平衡重排不能检测染色体的平衡重排(如染色体倒位和平衡的染如染色体倒位和平衡的染色体易位、插入色体易位、插入)n不能检测基因的点突变、单基因病不能检测基因的点突变、单基因病n不能检测遗传代谢病和一些基因组嵌合不能检测遗传代谢病和一些基因组嵌合n对大量的微小片段的致病性的解释存在困扰对大量的微小片段的致病性的解释存在困扰重复重复缺失缺失p检测流程示意图
9、检测流程示意图以以affymatrix平台为例平台为例p结果的判读结果的判读DGV 提供和收集关于正常人类人类基因组的结构变异的信息，主要提供 1 kb 的DNA片段的遗传改变。http:/projects.tcag.ca/variation/cgi-bin/OMIM 为“0nline Mendelian Inheritance in Man”的简称，全面，权威，持续更新关于人类基因和相关遗传表型信息。主要着眼于可遗传的或遗传性的基因型和表型的关系，表明明确的致病基因、未明确意义的致病基因http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/omimDECIPHER 数据库收集了临床上有关亚微
10、观染色体异常的案例，如染色体微缺失/重复/插入，易位和倒位。http:/decipher.sanger.ac.uk/ISCA 来自于国际标准细胞遗传学芯片学会，该学会为一个非营利性国际性团体，致力于共享包括生物芯片技术在内的先进的分子细胞遗致力于共享包括生物芯片技术在内的先进的分子细胞遗传学技术来进行临床检测传学技术来进行临床检测。目前会员已多达百个，建立了共享的临床症状及芯片分析资料库，包含了近15000多例异常的个案和10000多例正常的个案。目前ISCA的临床CNV数据由NCBI 的dbGaP(database of Genotypes and Phenotypes)和dbVar(dat
11、abase of genomic structural Variation)提供 常用数据库常用数据库p适用的标本类型适用的标本类型二、在产前临床中的应用二、在产前临床中的应用对于临床显示异常但是核型分析正常的病例中，利用CMA可发现6%的胎儿结构异常和1.7%高龄和早期筛查高危的孕妇中存在染色体的缺失和重复2013年美国妇产科协会应用指南年美国妇产科协会应用指南l 超声检查胎儿存在一个或多个结构异常的孕妇推荐进行CMA检测。这种检测可以替代胎儿的核型分析l胎儿未发现异常并接受有创性产前检查的孕妇，胎儿核型分析和CMA检测均可实施l大多数确认的遗传突变和母亲的年龄无关，因此CMA检测不应只限制
12、在35岁以上的孕妇l如果发生胎死宫内或死产需要进一步细胞遗传学分析时，推荐使用CMA检测，因为可提高异常结果的检出率l孕早期和孕中期胎儿丢失的数据有限，因此不推荐在此时进行CMA检测l患者在检测前和检测后向有资格的遗传咨询医师和遗传学家咨询此项检测的优势和局限时，应当签署知情同意书，包括对于发现的未明确意义的、血缘关系的和出生后疾病发病年龄的解释p 染色体微阵列技术在产前诊断中的应用协作组染色体微阵列技术在产前诊断中的应用协作组 2014 2014年年中华妇产科杂志中华妇产科杂志第第4949卷第卷第8 8期刊登了期刊登了染色染色体微阵列技术在产前诊断中的应用体微阵列技术在产前诊断中的应用专家共
13、识专家共识 CMA CMA在产前诊断临床应用在产前诊断临床应用适应症和禁忌症适应症和禁忌症为：为：1.1.产前超声检查发现胎儿结构异常是进行产前超声检查发现胎儿结构异常是进行CMACMA的适的适应症，建议在胎儿染色体核型分析和其他快速诊断的基础应症，建议在胎儿染色体核型分析和其他快速诊断的基础上进行，如核型分析或快速上进行，如核型分析或快速FISHFISH检测正常，则建议进一步检测正常，则建议进一步行行CMACMA检查检查2.2.对胎死宫内或死产、需行遗传学分析者，建议对胎儿组织对胎死宫内或死产、需行遗传学分析者，建议对胎儿组织行行CMACMA检测，以提高病因的检出率检测，以提高病因的检出率3
14、.3.对胎儿核型分析结果不能确定染色体畸形情况时，建议采对胎儿核型分析结果不能确定染色体畸形情况时，建议采用用CMACMA技术进行进一步分析以明确诊断技术进行进一步分析以明确诊断4.CMA4.CMA应用于评估早、中孕期胎儿丢失原因的研究数据不足，应用于评估早、中孕期胎儿丢失原因的研究数据不足，暂不推荐使用暂不推荐使用5.CMA5.CMA技术（特指具有技术（特指具有SNPSNP探针的平台）对于异常细胞比例探针的平台）对于异常细胞比例30%30%的嵌合体检测结果比较可靠，反之，对异常细胞比的嵌合体检测结果比较可靠，反之，对异常细胞比例例30%30%的嵌合体结果不可靠的嵌合体结果不可靠总结总结p中美
15、公认的中美公认的CMACMA适应症是：产前胎儿超声检测异适应症是：产前胎儿超声检测异常、胎死宫内和死产原因的排查常、胎死宫内和死产原因的排查p产前应用中是否进行核型分析和产前应用中是否进行核型分析和FISHFISH检测意见不检测意见不同，我国建议先行核型分析或同，我国建议先行核型分析或FISHFISH检测，无异常检测，无异常后在进行后在进行CMACMA检测检测p孕早期和孕中期的胚胎流产不是孕早期和孕中期的胚胎流产不是CMACMA的适应症的适应症思考题思考题1.1.临床上常用的分子生物学技术有哪些？临床上常用的分子生物学技术有哪些？2.2.简述染色体微阵列技术的检测原理和临床应用简述染色体微阵列技术的检测原理和临床应用
