1、C o m p a n yLOGO干细胞与组织工程干细胞与组织工程(间充质干间充质干细胞及其应用细胞及其应用)6一一.概述概述v何谓间充质干细胞？何谓间充质干细胞？间充质干细胞（间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）具有亚全能分化潜能，在特）具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，具有向多种类型细胞定的体内外环境下，具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为骨、软骨、肌腱、分化的能力，可以分化为骨、软骨、肌腱、脂肪、心脏、肝脏、神经、上皮等多种细脂肪、心脏、肝脏、神经、上皮等多种细胞。胞。由于能由于能分化分化为多种中胚层来源的为多种中胚层来源的间质间质细胞细胞而得名
2、。而得名。vMSC应用广泛应用广泛二二.间充质干细胞的来源间充质干细胞的来源v骨髓骨髓来源的来源的MSCv肌肉来源的肌肉来源的MSC v骨来源的骨来源的MSC v软骨来源的软骨来源的MSC v腱来源的腱来源的MSC v脂肪来源的脂肪来源的MSC v脐带血脐带血来源的来源的MSC 二二.间充质干细胞的来源间充质干细胞的来源 间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨膜、间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中。脐带血中。v骨髓骨髓来源的来源的MSCv 仅占骨髓细胞的仅占骨髓细胞的0.0010.1v 二二
3、.间充质干细胞的来源间充质干细胞的来源v骨髓骨髓来源的来源的MSC二二.间充质干细胞的来源间充质干细胞的来源v脐带血脐带血来源的来源的MSC 三三.间充质干细胞的生物学特性间充质干细胞的生物学特性（一）（一）MSC形态特征及生长特性形态特征及生长特性三三.间充质干细胞的生物学特性间充质干细胞的生物学特性（二）（二）MSC分化潜能分化潜能 具有强大的增殖能力和多向分化潜具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细肝细胞、成骨细胞、软骨细胞
4、、基质细胞等多种细胞的能力。胞等多种细胞的能力。过氧化物酶体增殖激活受体过氧化物酶体增殖激活受体-2-2三三.间充质干细胞的生物学特性间充质干细胞的生物学特性(三三)MSC的表面标志及鉴定的表面标志及鉴定vMSC没有一个独特的已知表面标志物。没有一个独特的已知表面标志物。目前比较公认的鉴定方法是：目前比较公认的鉴定方法是：MSC缺乏：造血干细胞标志缺乏：造血干细胞标志CD34,CD45,CD11b MSC表达：表达：CD90，CD71，CD44三三.间充质干细胞的生物学特性间充质干细胞的生物学特性（四）（四）MSC免疫学特性免疫学特性 1.1.MSC低免疫原性低免疫原性 不表达不表达MHC-I
5、I类分子和类分子和Fas-L;也不表达也不表达B7-1,B7-2.2.MSC具有免疫调节功能具有免疫调节功能 通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T T细胞细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。正正是由于间充质干细胞所具备的是由于间充质干细胞所具备的上述上述免疫学特性免疫学特性:*MSC在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。广阔的临床应用前景。*通过自体移植通过自体移植MSC可以重建组织器官的结构和功能，可以重建组织器官的结构和功能，并
6、且可避免免疫排斥反应。并且可避免免疫排斥反应。三三.间充质干细胞的生物学特性间充质干细胞的生物学特性（五）（五）MSC具有来源方便，易于分离、培养、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。胞特性。四四.间充质干细胞的分离培养间充质干细胞的分离培养（一）间充质干细胞的分离（一）间充质干细胞的分离v1.1.贴壁分离法（全骨髓法或一步法）：贴壁分离法（全骨髓法或一步法）：例：小鼠骨髓间充质干细胞的分离例：小鼠骨髓间充质干细胞的分离 1)取取46周龄正常昆明鼠周龄正常昆明鼠2只的股骨和胫骨，用只的股骨和胫骨，用PBS洗净，去掉干骺端
7、洗净，去掉干骺端 2)用用1ml无菌注射器，吸取无菌注射器，吸取1ml含含9%FBS的的RPMI-1640，12M的的L-谷氨酰胺、谷氨酰胺、1%青霉素青霉素和和1%链霉素的筛选培养基（链霉素的筛选培养基（CIM），冲出骨髓），冲出骨髓 （一）间充质干细胞的分离（一）间充质干细胞的分离 1.1.贴壁分离法：贴壁分离法：3)将骨髓吹打均匀后，静置将骨髓吹打均匀后，静置5分钟，以分钟，以2106/ml接种接种到到25cm2培养瓶内，于培养瓶内，于37、5%CO2培养箱中培养培养箱中培养.4）2448h后，换液，弃去未贴壁细胞，后，换液，弃去未贴壁细胞，PBS洗洗3次，次，每每34天换一次液天换一次
8、液.5）待细胞）待细胞90%融合后传代（大约融合后传代（大约1014天），用天），用0.05%的胰酶和的胰酶和0.02%EDTA消化消化3分钟，含血清的培分钟，含血清的培养基终止消化，养基终止消化，1000rpm，5min离心，收集细胞离心，收集细胞,1：2传代。传代。四四.间充质干细胞的分离培养间充质干细胞的分离培养（一）间充质干细胞的分离（一）间充质干细胞的分离 单纯上述贴壁分离法难以获得纯的单纯上述贴壁分离法难以获得纯的MSCMSC。v2.2.密度梯度离心法：密度梯度离心法：人骨髓间充质干细胞的培养常用此法。根据各人骨髓间充质干细胞的培养常用此法。根据各种骨髓细胞比重不同获取单个核细胞进
9、行种骨髓细胞比重不同获取单个核细胞进行贴壁培养。贴壁培养。v3.3.差速贴壁差速贴壁v4.4.FCMv5.5.免疫磁珠法免疫磁珠法四四.间充质干细胞的分离培养间充质干细胞的分离培养四四.间充质干细胞的分离培养间充质干细胞的分离培养（二（二)间充质干细胞的二维培养间充质干细胞的二维培养v1.1.低氧张力下的培养低氧张力下的培养v2.2.极低密度传代培养极低密度传代培养v3.3.基因转染的基因转染的MSC培养培养四四.间充质干细胞的分离培养间充质干细胞的分离培养(三）间充质干细胞的三维培养三）间充质干细胞的三维培养 由于二维培养存在着如下缺点：由于二维培养存在着如下缺点：1.1.贴壁的表面积有限，
10、细胞产量低；贴壁的表面积有限，细胞产量低；2.2.无菌操作过程繁琐，容易污染；无菌操作过程繁琐，容易污染；3.3.代谢产物排除不及时，细胞生长不良；代谢产物排除不及时，细胞生长不良；4.4.细胞离开体内三维结构，生物学行为受影响细胞离开体内三维结构，生物学行为受影响v有学者有学者采用胶原海绵进行三维灌注培养，较好。采用胶原海绵进行三维灌注培养，较好。但尚有诸多问题待解决。但尚有诸多问题待解决。五五.间充质干细胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化 1.1.向骨组织的诱导分化向骨组织的诱导分化 地塞米松地塞米松 甘油磷酸甘油磷酸 抗坏血
11、酸抗坏血酸 1,25-（OH）2-D3 TGF-IL-6 BMP-2 透明质酸透明质酸诱导因素诱导因素鉴定标志鉴定标志碱性磷酸酶；骨桥蛋白；骨钙蛋白；碱性磷酸酶；骨桥蛋白；骨钙蛋白；碱性磷酸酶染色显示成骨作用碱性磷酸酶染色显示成骨作用Von Kossa 染色显示含钙组织细胞染色显示含钙组织细胞五五.间充质干细胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化 2.2.向软骨组织的诱导分化向软骨组织的诱导分化 分离得到的分离得到的MSC先经低速离心形成细胞微团，先经低速离心形成细胞微团，之后加入无血清培养体系。之后加入无血清培养体系。诱导因素诱导因
12、素TGF-3Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1integrin鉴定标志鉴定标志Collagen IICollagen IXCartilage oligomeric matrix protein,COMP五五.间充质干细胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化 3.3.向脂肪组织的诱导分化向脂肪组织的诱导分化诱导因素诱导因素地塞米松地塞米松胰岛素胰岛素吲哚美辛吲哚美辛(消炎痛消炎痛)鉴定标志鉴定标志脂肪染色脂肪染色过氧化物酶体增殖激活受体过氧化物酶体增殖激活受体-2脂蛋白脂蛋白
13、脂肪酶脂肪酶脂肪酶结合蛋白脂肪酶结合蛋白aP2油红油红O染色鉴定成脂作用染色鉴定成脂作用油红油红O染色鉴定成脂作用染色鉴定成脂作用五五.间充质干细胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化 4.4.向肌肉组织的诱导分化向肌肉组织的诱导分化 诱导因素诱导因素鉴定标志鉴定标志两性霉素两性霉素B B5-5-氮杂胞苷氮杂胞苷 5-5-氮氮-2-2脱氧胞苷脱氧胞苷多核细胞（形态）多核细胞（形态）肌球蛋白肌球蛋白肌细胞生成素等肌细胞生成素等五五.间充质干细胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分
14、化 5.5.向其他中胚层组织的分化向其他中胚层组织的分化 6.6.检测细胞分化的其他方法检测细胞分化的其他方法 上述组织化学上述组织化学.分子生物学分子生物学.五五.间充质干细胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（二）间充质干细胞与相关因子（二）间充质干细胞与相关因子v1.1.TGF-家族对家族对MSC的作用的作用 TGF-促进促进MSC分化（成骨）分化（成骨）TGF-与其他因子的协同作用，如与与其他因子的协同作用，如与IGF-I的协同作用（成软骨）的协同作用（成软骨）v2.2.BMP对对MSC的作用的作用 BMP-2可诱导可诱导MSC向成骨和成脂肪方向分化向成骨和成脂肪方向分化五五.间充质干细
15、胞的诱导分化间充质干细胞的诱导分化（二）间充质干细胞与相关因子（二）间充质干细胞与相关因子v3.3.FGF对对MSC的作用的作用 MSC 表面有表面有FGF1和和FGF2的受体（促增殖的受体（促增殖)*bFGF单独作用具有有丝分裂原作用单独作用具有有丝分裂原作用 *bFGF与与BMP-2协同作用可促进协同作用可促进MSC的成骨的成骨能力能力六六.间充质干细胞的临床应用研究间充质干细胞的临床应用研究（一）MSC在软骨组织修复中的应用在软骨组织修复中的应用 （1 1）软骨表型的诱导分化）软骨表型的诱导分化 前述前述 （2 2）工程化软骨组织的体外构建）工程化软骨组织的体外构建 （3 3）细胞细胞-
16、支架复合物植入组织缺损处支架复合物植入组织缺损处 分离得到的分离得到的MSC先经低速离心形成细胞微团，先经低速离心形成细胞微团，之后加入无血清培养体系。之后加入无血清培养体系。诱导因素诱导因素TGF-3Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1integrin鉴定标志鉴定标志Collagen IICollegen IXCartilage oligomeric matrix protein,COMP软骨表型的诱导分化软骨表型的诱导分化软骨组织工程软骨组织工程基本方法示意图基本方法示意图A A 获取骨髓组织获取骨髓组织 B B 分离、培养分离、
17、培养MSCMSCC C 制备三维支架制备三维支架D D 将种子细胞种植于支架将种子细胞种植于支架 E E 将细胞将细胞-支架复合物植支架复合物植 入组织缺损处入组织缺损处六六.间充质干细胞的临床应用研究间充质干细胞的临床应用研究v（二）（二）MSC在骨组织修复中的应用在骨组织修复中的应用v1.骨组织工程种子细胞的来源骨组织工程种子细胞的来源 骨髓来源的骨髓来源的MSC最有优势。最有优势。v2.MSC的激活、增殖和分化的激活、增殖和分化 文献报道各种生长因子文献报道各种生长因子v3.年龄对年龄对MSC成骨的影响成骨的影响 问题和展望问题和展望vMSC与软骨组织修复方面：与软骨组织修复方面：1.MSC体外扩增后如何保持干细胞生物学特性体外扩增后如何保持干细胞生物学特性2.作为种子细胞是否优于软骨细胞？作为种子细胞是否优于软骨细胞？MSC是否是否需要体外诱导过程？需要体外诱导过程？3.MSC分化成软骨是否是终末分化阶段？分化成软骨是否是终末分化阶段？4.MSC分化成软骨表型的关键刺激信号及传导分化成软骨表型的关键刺激信号及传导途径途径
