1、第六章第六章 昆虫基因工程昆虫基因工程 陈陈 伟伟 公用邮箱：公用邮箱：04b1- 密码：密码：2004bio2004bio 最近的研究表明，全世界的昆虫可能有1000万种，约占地球所有生物物种的一半。但目前有名有姓的昆虫种类仅100万种，占动物界已知种类的2/3-3/4。昆虫不仅种类多，而且同一种昆虫的个体数量也很多，有的个体数量大得惊人。一个蚂蚁群可多达50万个体。一棵树可拥有10万的蚜虫个体。蝗虫大发生时，个体数可达712亿之多，总重量约12503000吨，群飞覆盖面积可达5001200公顷，可以说是遮天盖日。大学城大学城1010所高校占地面积一览表所高校占地面积一览表高校名称高校名称计
2、划入城学生计划入城学生规模规模教学区用地面教学区用地面积积现有校园面积现有校园面积中山大学2万88.5公顷504公顷华南理工大学2万81.4公顷200公顷华南师范大学1.6万68.6公顷80公顷广东工业大学2.8万111.3公顷73.2公顷广东外语外贸大学1.2万51.9公顷60公顷广东药学院1.2万36.7公顷10.6公顷广州中医药大学0.8万47.4公顷24.7公顷星海音乐学院0.3万12.5公顷2.66公顷广州美术学院0.4万16.3公顷9.9公顷广州大学1.7万80.1公顷48.6公顷 昆虫基因工程的研究主要在三大物种 果蝇系统：P元件 蚊虫和农业害虫系统：转座子转化 家蚕系统：表达异
3、源功能蛋白及病毒转染为特征 6.1 果蝇的基因转化系统果蝇在生命科学研究中的地位：当今分子生物学尤其是发育生物学研究的重要模式生物模式生物：指人们在研究生命现象过程中长期、反复作为研究材料的物种，从这个物种研究中得出的许多生命规律往往代表了许多物种共同的规律。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。因为对这些生物的研究具有帮助我们理解生命世界一般规律的意义，所以它们被称为“模式生物”。目前应用最广的模式生物包括，大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、秀丽隐杆线虫、海胆、果蝇、斑马鱼、爪蟾和小鼠等 6.1.1 果蝇转座元件的结构及特征1951年Barbara Mclintock首先在玉米
4、中发现了控制元件，后来命名为转座元件或转座子(transposon)。转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。果蝇体内15%的DNA可以移动。近年来从黑腹果蝇体内鉴定的转座元件：Copia逆转座子、FB家族和P元件。同一种果蝇可分为P型（父本贡献，paternal contributing）和M型（母本贡献，matenal contributing），含有P元件的果蝇称为P型通读 6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育原因：P元件在染色体遗传位点的插入往往会导致不育，这是由于很多的P因子发生转座，造成插入突变 细胞型的作用
5、:取决于66KD蛋白抑制转座的能力。这个蛋白质是卵中母体因子产生的。在P品系中必须要有足够的蛋白来抑制转座的发生。含有P因子的雌果蝇与无论是否带有P因子的雄果蝇杂交，由于P细胞型的存在抑制了转座酶的合成或激活，表现出正常的生育能力。但当雌果蝇为M型时，在卵中无阻遏物，这样导致了来自雄果蝇中的P因子使生殖细胞中转座酶活化。P细胞型能对多代后代发挥作用，表明卵中必须要有足够的阻遏蛋白，而且也要相当稳定，通过成体传递到下一代的卵中。6.1.3 P元件介导的经典转化程序一、P元件介导的转化设想：基于P元件的转座能力，可用其做为基因转移的有用载体成功案例：1982年，A.C Spradling和 G.M
6、 Rubin，将含有P元件的质粒注射到M型雌性果蝇的胚胎中，可实现P元件介导的基因转移。为什么选择雌性果蝇的胚胎？注意：显微注射时只能用发育时间为090分钟的年轻胚胎，因为P元件转座作用只发生在生殖细胞中。二、具体操作程序 参考书P304的图64说明：标记基因rosy基因，编码黄嘌呤脱氢酶，是果蝇在含有高浓度嘌呤的培养基上生长所必需的；而ry-的胚胎不能在这样的培养基中存活。辅助质粒：含有缺陷型P元件序列（右末端重复序列缺失23bp）,它只能提供转座酶而不能转座自身序列思考：为什么不选择完整P元件序列和功能的质粒作为辅助元件一、用于非果蝇类昆虫转化的载体1.用于非果蝇类昆虫转化的转座元件不可用
7、P元件的原因：P元件系统的转化有效性依赖于黑腹果蝇及其相近种属体内几个特异性因子的存在常用转座元件：Minos，Hermes，Mosl，PiggyBac2.常见用于非果蝇类昆虫转染的病毒昆虫逆转录病毒，如gypsy第一个被发现的昆虫特异性逆转录病毒浓核病毒存在于蚊虫和蛀虫体内的DNA病毒新培斯RNA病毒被有效地应用在蛋白质的瞬时高效表 达及蝴蝶和甲虫和基因分析等领域3.农业害虫的基因工程史上最强悍的琢木鸟农业害虫转基因株的目标：控制农业害虫的繁殖规模战略：借助农业害虫的共生细菌或病毒 分子绝育术 基因转化技术 蚊虫的基因工程自学 宋张俞（蚕妇）昨日入城市 归来泪满襟 遍身罗绮者 不是养蚕人 家
8、蚕作为经济作物的地位中国古代最主要的经济昆虫之一。蚕的经济价值在于蚕丝。蚕丝是主要的纺织原料之一。中国是最早利用蚕丝的国家。古史上有伏羲“化蚕”，嫘祖“教民养蚕”的传说，又说黄帝元妃西陵氏为“先蚕”，即最早养蚕的人。秦汉以后，中国的养蚕技术通过举世著名的丝绸之路传入到中亚、南亚及西亚地区，六世纪世纪中叶，君士坦丁堡国王通过印度僧侣从中国私运蚕种至该国，是为西方有蚕业之始。家蚕是众所周知的食桑叶吐丝的经济昆虫,这种昆虫有独特的生物学特性。一条小蚕从蚕卵里破壳而出,似如蚂蚁,20多天内仅吃桑叶20多克。却以惊人的速度生长,体积增加6000倍,体重增加1万倍,绢丝腺增加4万倍。蚕合成蛋白质效率很高,
9、1天内就可以合成几毫克的特种蛋白,比人肝细胞分泌蛋白速度快50倍。有人把蚕比作生产与贮存多肽的一座微型工厂,确实很形象。.3.1 我国科学家对家蚕的分子生物学研究03年完成了高质量的家蚕基因组框架图，找到了16948个基因及7285个基因片段，同时鉴定出一批与家蚕性别调控、激素调节、发育变态及茧丝蛋白高效合成相关的功能基因1，杆状病毒载体应用最初：美国学者，Smith 和Summers用AcMNPV，在秋黏虫中表达干扰素1984年，日本学者Maeda用家蚕核型多角体病毒（BmNPV）在家蚕中表达干扰素，其表达量比当时其它真核表达系统高出个数量级杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600 多种
10、杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20 种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子,大小为80160kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。2,杆状病毒的生物学特征特点：含有包膜的大型dsDNA病毒，宿主仅限于无脊椎动物杆状病毒科 分类杆状病毒科包涵体杆状病毒非包涵体杆状病毒核型多角体病毒颗粒体病毒包埋单粒病毒包埋多粒病毒（如BmNPV）（如AcMNPV）杆状病毒发育循环包含的两个独特时期.产生出芽型病毒BV：宿主核内，杆状病毒衣壳装配病毒基因组所形成的装配粒子在跨越宿主质膜时获取包膜。它可继发感染宿主同一组织其它细胞或不同组织.产生包埋型病毒OV：核内获取包膜的病毒粒子被包埋进呈多
11、角状的蛋白质晶体中。当宿主死亡或细胞裂解时，多角体被释放进土壤或植物表面。l第一时相：时间：感染后的0-24小时结果：产生大量的BV，出芽释放，在虫体内传播l第二时相：时间：感染24小时以后结果：形成大量的OV，被多角体蛋白包裹，最终 形成多角体，经口感染其它宿主包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即Mr 为29 000 的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活 保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染 目前已有六种昆虫核型多角体病毒DNA 全序列被发表,包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、黄杉毒娥核型多角体病毒(
12、OpMNPV)、舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)、甜菜行军虫核型多角体病毒(SeNPV)和棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV),并对其中60 多个基因的性状进行了研究昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高,对外源基因克隆容量大,重组病毒易于筛选,具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,现已成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。杆状病毒作为载体的特性1，病毒基因组较大,可以插入相当大的外源DNA 节片2，病毒对脊椎动物细胞无致病性3，病毒基因组中多角体蛋白基因是一种非必需区，它受控于一个孢启动子,这种启动子活动晚,当病毒其它多数基因和宿主
13、基因关闭之后才开始启动,因此可以大量表达外来基因。表达的产物分泌到细胞外面不致引起病毒或细胞的早日破裂,也有利于产物的分离提取。4，外源DNA 插入多角体蛋白基因内,使此基因缺失功能失活,不能再合成多角体蛋白。而野生型病毒多角体蛋白基因表达出大量产物形成包涵体。筛选时极易将之与载体病毒区别开来。5，昆虫细胞是一种真核细胞,杆状病毒昆虫细胞系统能够完成翻译后蛋白质的加工修饰,使外源产物具有生物学活性。l杆状病毒转移载体的发展杆状病毒转移载体根据表达外源基因的能力可分为单一表达载体和多元表达载体.目前最常用的转移载体是在polh启动子下游插入一个多克隆位点,可以导入不同的外源基因。一些转移载体已经
14、商品化，如pBacPAK8和pBacPAK9l多元表达载体可同时表达两个或多个外源基因。这类载体中含有两个或多个相同或不同的启动子，如p10基因启动子和polh基因启动子以相反的方向插入基础质粒构建的转移载体p2Bac 昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒表达表达外源基因外源基因的方法的方法杆状病毒载体表达系统采用一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子后,获得重组病毒,这种重组病毒在昆虫细胞或虫体内复制的同时,使外源基因得到表达。常用启动子：多角体蛋白编码基因启动子P10蛋白编码基因启动子整合或修饰启动子家蚕丝心蛋白编码基因启动子（自然界最强的启动子）80160kb，常规的酶切，连接的方法难
15、以将外源基因重组如病毒基因组。那么通过什么方法进行重组？l由于杆状病毒基因组很大,所以需要通过转移载体与病毒DNA 在细胞内的同源重组构建重组杆状病毒。l经过多年的努力,已构建出用于不同目的和需要的转移载体;即在基础质粒(如PUC)上插入多角体蛋白基因及其两端侧翼,并去除在多角体蛋白基因编码区,而插入多克隆位点,用于外源基因的克隆+重组 重组杆状病毒的构建过程大致可分为三步进行:将目的基因插入到含有Ampr、复制起始点ori 及多克隆位点的转移载体中构建重组转移载体,重组转移载体带有多角体蛋白基因启动子及用于同源重组的杆状病毒多角体蛋白基因两端的侧翼序列;通过细胞内同源重组将目的基因转移到杆状
16、病毒基因组的多角体蛋白基因部位,取代多角体蛋白基因;筛选重组病毒并在昆虫培养细胞或虫体内扩增与表达。昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒表达载体系统（表达载体系统（BVES）的应）的应用用功能基因组的研究功能基因组的主要内容是确定基因组内各种蛋白质的结构和功能、蛋白质之间及蛋白质与核酸的相互关系。生产几万种蛋白质以供研究的前提是蛋白表达技术的简便化、高效化。集诸多特点于一身的BVES不失为解决这一问题的良好途径。日本已有公司进行了这方面的大胆尝试利用近几年的进展如BacTOBac系统，直接在昆虫蛹体内表达。不需筛选纯化就能在短期内获得大量目的蛋白。二、生产医用蛋白及疫苗 BVES自从问世以来，由于其不具有
17、任何对哺乳动物有潜在的致病性的动物病毒片段，其生物安全性已被广泛认可。20世纪80年代，第1个被美国FDA批准进行人体实验，拟用于艾滋病预防的工程疫苗就是用BVES生产的。其中,HIV疫苗和疟疾疫苗己进入临床。这亦证明BVES来源的重组蛋白对人是安全的病毒基因组中插入一些干扰昆虫正常生理反应的基因,从而引起幼虫进食的减少或死亡.最早进行这种尝试的是前田进（1989）现有的研究结果表明，杆状病毒能够进入哺乳动物细胞，但并不在其中复制。如果以NPV作载体，置于哺乳动物启动子之下的外源基因却可以有效的传递并正确表达。Hofmann等首次报道了用BVES作载体，在巨细胞病毒（CMV）极早期基因iel启
18、动子的启动下,外源基因在肝细胞的成功表达。昆虫杆状病毒系统本身及其相关技术尚需进一步完善和提高。一、该系统无法进行连续性表达。二、糖基化方式与哺乳动物细胞存在一定差异,糖侧链甘露糖的成分较高,而复合寡糖缺乏。三、目前杆状病毒的基因组学,特别是功能基因组学的研究相对薄弱,有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等仍不明了。四、杆状病毒可能的其它宿主还不十分清楚,表达产物的纯化和多元表达等方面的技术还不够理想等。从重组DNA 试验的安全性考虑,家蚕很好的宿主,因为它已被驯化只有在室内才能生长发育、繁衍继代。家蚕的生理学、遗传学、生化学知识已有大量的积累,用家蚕作生物反应器表达外源基因的产物,具有下列独特
19、的优点:1、家蚕易于饲养、成本低廉2、外源基因表达效率不仅高于哺乳动物、大肠杆菌或酵母菌,而且表达产物能向胞外分泌,进入蚕体液,易于收集和分离。3、表达产品后加工容易,蛋白易酰胺化、糖基化，无大肠杆菌内毒素之虑4、安全、可靠、对人畜无毒性5、表达产物有生物学活性。在大肠杆菌表达系统内,某些蛋白质曾被高水平合成,但处于一种不溶解的生物学上无活性状态。以BmN PV 为载体,用家蚕作生物反应器表达外源基因产物,从1984年起仅仅15年时间,其硕果累累,前景十分诱人。目前世界上已有数百家大学或研究单位都在尝试用家蚕杆状病毒(BmNPV-Bm)系统生产各种有用蛋白。预计许多对人类有用蛋白用家蚕系统表达,将很快成为极有吸引力的商品。
