1、第七第七章章 单元融合及创新单元融合及创新江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院第三篇第三篇 分离技术的融合与集成分离技术的融合与集成融合和创新融合和创新在基本分离技术的基础上产生为更高效的应用服务OR为新颖而创新？生物分离技术：技术和艺术的结合集成集成指为达到某一目标，组合分离技术，形成高效工艺有效设计、实验验证回顾回顾生物物料的预处理离心过滤细胞破碎沉淀技术萃取技术膜分离技术层析技术电泳技术蒸发和干燥技术上游设计催化转化变性复性检测和评价方法第七第七章章 单元融合及创新单元融合及创新概述概述亲和沉淀技术亲和沉淀技术膜层析技术膜层析技术与双水相集成的分离技术与双水相集成的分离技术混合模式吸
2、附层析混合模式吸附层析扩张床吸附扩张床吸附层析层析概述概述单元融合分离技术是指把两种或两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术目标：提升分离效率、提高产品收率、降低过程成本不经意间不经意间离心过滤离心过滤技术技术等电点下的盐析等电点下的盐析超临界超临界流体色谱技术流体色谱技术。亲和沉淀（Affinity precipitation）：是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。是蛋白质类生物大分子相互亲和作用与沉淀分离相结合的分离纯化技术。一一 亲和沉淀亲和沉淀技术技术常常用的亲和作用体系用的亲和作用体系体系类型体
3、系类型配基配基目标配体目标配体高特异性体系高特异性体系酶酶酶抑制剂、酶底物类似物、辅助因子酶抑制剂、酶底物类似物、辅助因子抗原抗原抗体抗体核酸核酸互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶荷尔蒙荷尔蒙受体、载体蛋白受体、载体蛋白群特异性体系群特异性体系凝集素凝集素多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞过渡金属离子过渡金属离子蛋白质酶蛋白质酶蛋白蛋白A、G抗体抗体肝素肝素脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、凝血蛋白、抗凝血酶酶、凝血蛋白、抗凝血酶三嗪类色素三嗪类色素脱氢酶激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸
4、酶、脱氢酶激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、糖解酶糖解酶回顾：亲和对回顾：亲和对可逆可逆溶解性溶解性聚合物（聚合物（SISSIS聚合物）聚合物）可逆溶解性聚合物:Reversibly Soluble Polymers(RS聚合物)；或称为Soluble and Insoluble Polymers(SIS聚合物)这类聚合物的溶解与非溶解状态可随环境参数如pH、温度等的变化而发生可逆变化，因此可被用于酶与蛋白质的亲和沉淀或可逆固定化分离过程分离过程一定条件下就可形成沉淀，通过过滤或离心的方式进行分离，然后将酶或蛋白从亲和配体一SIS聚合物上解离下来。混合-亲和吸附-改变条件沉淀-离心或过滤-解离
5、-离心1、带同种电荷的多聚电解质。通过静电亲和作用形成SIS聚合物一蛋白质共聚物。类型类型2、带亲和配基的多聚化合物。专一性更强的亲和 形成SIS聚合物一亲和配体一靶蛋白的共聚物。例例1：利用：利用聚合脂质体的沉淀可逆性固定聚合脂质体的沉淀可逆性固定STI及其及其PL-STI对胰蛋白酶的亲和作用对胰蛋白酶的亲和作用通过双功能试剂戊二醛、二甘醇二酸酐和1,4-丁二醇双缩水甘油醚等将大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）固定到由二十五-10,12-二炔-1-醇磷脂乙醇胺形成的聚合脂质体（PL）上 沉淀条件：0.14-0.25M的盐（NaCl、KCl、NH4SO4等）胰蛋白酶收率20%60%，PL-STI 可
6、作为酶的亲和沉淀吸附剂。亲和配基偶联到聚合物的过程例例2：壳：壳聚糖亲和沉淀聚糖亲和沉淀壳聚糖：酸溶、碱沉淀，离子交换作用pH6.5以下溶解态，pH6.9与杂蛋白形成沉淀壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25 柱层析三步法分离纯化藻蓝蛋白壳聚糖和活性炭结合使用，可使藻蓝蛋白纯度(A620/A280)由0.93提高至2.78。通过DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶柱层析后，可得到高纯度藻蓝蛋白，纯度达4.3。涉及到的基础技术：涉及到的基础技术：膜分离技术膜分离技术 层析技术层析技术二二 膜层析技术膜层析技术介质刚性不够、易被压缩，难以获得较高的处理速度，也不
7、易进行线性放大；床层内易产生沟流，传质效果较差；配基价格昂贵却不能充分利用，只有1%-2%的配基与蛋白质结合；吸附柱易堵塞和污染，往往只适用于间歇操作，处理量相对较低，操作时间较长。传统传统的液相层析的液相层析的的缺点缺点传统的膜分离技术传统的膜分离技术的的优缺点优缺点分离速度快、操作压力低、无相变、能耗低、易于放大和连续操作、基质来源广泛且价格相对较低等优点靠筛分机理分离，对目标产物与杂质大小相近的混合物分离显得无能为力膜膜层析层析技术技术将对生物大分子有特异性和选择性的功能基团连接到膜的表面及孔壁中去，从而制备一种新型的层析介质，称为膜层析介质（或称为膜吸附剂），利用膜对物料的筛分和功能基
8、团的作用进行的分离技术称为膜层析技术膜层析技术是液相层析和膜分离相结合的一种新技术，融合了二者之长具有快速、高效、高选择性、易于放大等特点满足一般情况或者特殊情况下生物大分子高效分离与纯化的需要采用具有一定孔径的膜作为介质，连接配基，利用膜配基与蛋白质等目标分子之间的相互作用进行分离纯化当料液以一定流速流过膜的时候，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍原理原理与普通的膜技术相比：不仅利用膜孔径的大小，更主要的是利用其特异性和选择性，不受相对分子质量大小的限制特点特点与液相层析技术相比：由于在膜
9、孔基质上配基与液流之间扩散路径极短，传质极快，分离时间显著缩短，分离效率提高；由于膜的空隙率大，其孔表面积很高，膜的厚度很薄就能满足分离要求，造成液流通过膜的压力降低；由于膜的元件都是标准的，膜层析等集成技术易于放大，便于实现大规模连续分离和自动操作。特点特点（1 1）亲和膜亲和膜分离分离两个分支：两个分支：亲和膜分离技术，制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；亲和错流膜过滤，将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。亲和膜分离亲和膜分离技术（一般意义）技术（一般意义）亲和膜分离亲和膜分离(Afinity Membrane Separation)是将亲和层
10、析与膜分离技术结合将亲和层析与膜分离技术结合起来以提高过程选择性的一项新型分离技术。起来以提高过程选择性的一项新型分离技术。亲和膜技术的研究始于亲和膜技术的研究始于20世纪中期，自世纪中期，自1991年年Klein的亲和膜的亲和膜(Affinity Membrane)专著出版以来，促进了对亲和膜专著出版以来，促进了对亲和膜技术的研究，在基膜材料改性、亲和配基偶联、技术的研究，在基膜材料改性、亲和配基偶联、亲和膜组件设计、过程动力学以及亲和膜应用亲和膜组件设计、过程动力学以及亲和膜应用方面都有了较大的发展，但还有许多问题有待方面都有了较大的发展，但还有许多问题有待进一步深人研究。进一步深人研究。
11、亲和膜分离示意亲和膜分离示意亲和膜亲和膜制备制备即通过适当的化学反应，在膜表面接上可反应的官能团或者是一定长度的“间隔臂”选用一个适合的亲和配基(Ligand)，在一定条件下让其与间隔臂分子产生共价结合，生成带有亲和配基的膜分离介质。常用的亲和膜载体材料常用的亲和膜载体材料脂族烃类(聚乙烯、聚丙烯)芳香族共聚物(聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜)脂族聚酰胺(尼龙6、尼龙66)以及一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇、纤维素。亲和配基亲和配基（1）特异性配基：只与其对应的分子发生特异性结合，如抗原、抗体、抑制剂、激素、激素受体等;（2）通用型配基：能与某一类物质结合，如三嗪类染料活性染料（辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
12、(NAD+)类似物）能与许多需要这种辅酶的酶结合亲和分离需解决的几个关键问题亲和分离需解决的几个关键问题 膜表面要有足够多并可利用的化学基团(一般为一OH基)，使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基。要有足够数量可利用的化学基团则必需有足够高的表面积，以便于让生物大分子自由地出入膜，必需有足够大的孔径。孔分布应窄而均匀，以获得高的通适量和分离效能。为了实现快速分离，常要加压操作，因此要求膜有一定的机械强度，能承受力，长期使用不变形。亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度的缓冲浪和有机溶剂。操作方式操作方式亲和亲和超滤超滤亲和亲和微滤微滤亲和超滤亲和超滤分离目标物的同时，浓缩其他成分亲和微滤亲和微滤仅分离
13、目标物仅分离目标物亲和-膜过滤(Affinity filtration)，是1981年由Hedda等人首先提出并得到迅速发展的一种新型大规模分离纯处技术。既充分利用了载体上的配基对目标组分的专一的可逆的亲和吸附作用和超滤膜分离易于实现大规模生产的优点，又克服了超滤膜分离技术对分子质量相近的大分子无法实现分离的缺点亲和亲和-膜过滤（狭义上）膜过滤（狭义上）示意图示意图1 1示意图示意图2 2亲和亲和-膜过滤过程及其关键问题膜过滤过程及其关键问题亲和载体：亲和载体：亲和载体的结构包括一个由对生物分子亲和载体的结构包括一个由对生物分子无特异吸附性的物质组成的内核无特异吸附性的物质组成的内核以及内核表
14、面上连以及内核表面上连接的接的某些特定基团某些特定基团，这些基团必须对所，这些基团必须对所提取的蛋白提取的蛋白质有一定的特异吸附性。质有一定的特异吸附性。分类：分类：水溶性大分子载体水溶性大分子载体水不溶性微载体水不溶性微载体水溶性水溶性大分子大分子载体载体 优点:亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速率快,达到吸附或洗脱平衡的时间极短,吸附容量大水水不溶性微载体不溶性微载体 非水溶性载体的种类较多,据报道可用的非水溶性基质有各种菌类的完整细胞(酵母、芽孢杆菌、链球菌等细胞)、纳米硅石微粒、琼脂糖、凝胶、脂质体等也均被作为基质使用过。亲和载体与目标分子的结合亲和载体与目标分子的结合在亲和-膜过滤
15、过程中,亲和载体与目标分子之间的结合可能存在弱的共价键、离子键、分子键和配位键的作用。亲和亲和-膜过滤应用膜过滤应用亲和亲和-膜过滤技术应用在分离和纯化蛋白质、酶膜过滤技术应用在分离和纯化蛋白质、酶方面已经有很多成功的例子。方面已经有很多成功的例子。朱家文等用朱家文等用DextranT2000，经环氧氯丙烷交，经环氧氯丙烷交联并氧化产生部分羧基，偶联对氨基苯甲脒制得联并氧化产生部分羧基，偶联对氨基苯甲脒制得水溶性亲和载体，来纯化的尿激酶。水溶性亲和载体，来纯化的尿激酶。孙彦等研究了脂质体的制备，并利用对氨基苯甲孙彦等研究了脂质体的制备，并利用对氨基苯甲脒修饰的脂质体有效地纯化了胰蛋白酶。脒修饰
16、的脂质体有效地纯化了胰蛋白酶。亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白A A的实验装置的实验装置热杀死酵母热杀死酵母细胞作为载体细胞作为载体截断相对分子量截断相对分子量 106随着生物医药工业的发展随着生物医药工业的发展,生物医药的分离纯化成生物医药的分离纯化成为一个研究热点为一个研究热点,亲和亲和-超滤膜分离技术在手性药超滤膜分离技术在手性药物、抗生素等的分离与纯化方面得到了一定程度物、抗生素等的分离与纯化方面得到了一定程度的应用。的应用。例如：以例如：以D-丙氨酰丙氨酰-丙胺酸为配基连接到水溶性丙胺酸为配基连接到水溶性的聚合物葡聚糖上的聚合物葡聚糖上,将其作为亲和载体来分离糖肽将其
17、作为亲和载体来分离糖肽抗生素抗生素-万古霉素。万古霉素。离子交换膜离子交换膜是膜状的离子交换树脂。离子交换膜离子交换膜包括三个基本组成部分：高分子骨架，高分子骨架，固定基团固定基团可交换离子（反离子）可交换离子（反离子）counterioncoionfixedionpolymermatrix（2 2）离子交换膜层析离子交换膜层析（IMCIMC）原理原理离子交换膜层析主要是利用膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的离子交换作用进行分离的。根据离子交换基团的性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴离子型、弱阴离子型。由商用膜改性制得的膜介质，其成本相对较低。在流速较慢的情况下，还可通过梯度洗脱分
18、离蛋白质的混合物。离子交换膜层析由于操作条件较温和，可以有效地保持蛋白质的活性，并可延长膜的使用寿命，其缺点是选择性较差。与电渗析相与电渗析相区别区别共性：均使用离子交换膜区别：离子交换膜层析：超滤或者微滤方式 电渗析：离子选择透过离子交换膜为主要特征，纳滤或者反渗透膜为主按电荷分按电荷分:阳离子交换膜：活性基团：磺酸基磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基羧酸基（-COOH）砷酸基（AsO32-）等；阴离子交换膜：活性基团：伯、仲、叔、季胺基季胺基（脂肪胺与芳香胺）-NH3+、-RNH2+、-R2NH+、-R3N+按膜结构划分按膜结构划分:异相膜异相膜半均相膜均相膜均相膜目标分子目
19、标分子膜介质膜介质配基配基人尿激肽释放酶人尿激肽释放酶纤维素膜纤维素膜N（CH3）3人肿瘤坏死因子人肿瘤坏死因子GMA季胺基季胺基寡聚核苷酸寡聚核苷酸GMA-EDMADEAE免疫毒素免疫毒素改性纤维素改性纤维素CM溶菌酶溶菌酶GMASO3H-Mg凝血酶原凝血酶原纤维素膜纤维素膜DEAE卵白蛋白、人血清白蛋白、卵白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素抑制剂胰岛素抑制剂甲壳素膜甲壳素膜EGDEBSA交联改性纤维素交联改性纤维素磺酸基磺酸基乳清蛋白乳清蛋白交联改性纤维素交联改性纤维素磺酸基、季胺基磺酸基、季胺基离子交换膜层析的应用研究实例离子交换膜层析的应用研究实例例：例：IMCIMC纯化纯化DNADNA质粒
20、和肽链等生物分子质粒和肽链等生物分子采用甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为基质，二乙氨乙基(DEAE)为离子交换基团，在5mL/min的流速下有效地分离了四种寡聚核苷酸(长度分别为8，10，12和14个核苷酸)。还在同样的基质接上-SO3-基团后，用于肽链的分离。例：蛋清中分离溶菌酶例：蛋清中分离溶菌酶通过射线引发接枝获得甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA膜，先在中空纤维膜上接入环氧基团，然后通过亚硫酸钠接入SO3H基团，再与镁离子交联，制成离子交换膜介质，膜的蛋白质平衡容量可达到0.42g/g以NaHCO3-NaOH缓冲液为洗脱液，在pH为9.0时洗脱率达到100%。由于膜上螯合了Mg2+，使得膜的透
21、过速率也有较大增加。例：人凝血酶原分离例：人凝血酶原分离采用纤维素膜共价连接DEAE的径向IMC，从血浆的分离物(Nitschmannfrac-tion)中分离人凝血酶原样品的通过速率为2030mL/min，在不降低分离效率的前提下，洗脱速率达到40mL/min。这种膜还可用于DNA、多肽和其它蛋白质的分离。由于疏水配基结构简单，通用性好且成本较低，故疏水层析已成为蛋白质分离纯化的常用技术之一。但是，目前常用的疏水层析大多采用琼脂糖凝胶、葡聚糖等“软”基质，分离速度不够理想，且不易放大，疏水膜层析就是在此基础上发展起来的。疏水膜层析上的配基，常用的有甲基、丁基、苯基、辛基、己二胺、聚乙二醇等，
22、通过目标物质与这些配基之间疏水作用的不同而实现分离。影响疏水膜层析操作情况的主要因素有:盐离子的种类，离子强度，pH和柱温等。（3 3）疏水膜层析疏水膜层析目标蛋白目标蛋白膜介质膜介质配基配基牛肝过氧化氢酶牛肝过氧化氢酶纤维素膜纤维素膜苯基苯基牛血清白蛋白牛血清白蛋白纤维素膜纤维素膜苯基苯基热原热原纤维素膜纤维素膜己二胺己二胺肌球素、核酸酶、溶菌酶和胰凝肌球素、核酸酶、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶乳蛋白酶十二烷基甲基丙烯酸酯十二烷基甲基丙烯酸酯-GMA-EDMA共聚物共聚物十二烷基十二烷基牛血清白蛋白牛血清白蛋白聚乙烯膜聚乙烯膜苯基苯基人肿瘤坏死因子人肿瘤坏死因子QuickDisk丁基、苯丁基、苯基基
23、疏水膜层析的应用研究实例疏水膜层析的应用研究实例三三 与双水相集成的分离与双水相集成的分离技术技术双水相萃取技术双水相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，当两种聚合物在排斥力作用下达到平衡时，就形成了稳定的两相，两种聚合物分别位于两个互不相溶的两相中。体系具有生物相容性生化工程中常用的双水相体系（1 1）双水相萃取）双水相萃取与层析技术结合与层析技术结合在某一种聚合物上衍生一定的功能配基，不但使体系具有双水相处理量大的特点，而且通过离子交换或亲和作用，增大分配系数。离子交换双水相亲和双水相等配料发酵液亲和配基对聚乙二醇4000(PE
24、G4000)的羟基进行活化，以亚氨基二乙酸(DA)为螯合剂，制取含有Cu2+的金属螯合亲和配基PEG-DA-Cu(II)，并以PEG和羟丙基淀粉(PES)形成双水相，用于直接处理含纳豆激酶的发酵液，如图6.6所示，经过两次分配分离流程后，纳豆激酶的总收率为81%，纯化倍数达到3.52。例例1 1 纳豆激酶纳豆激酶的双水相纯化的双水相纯化例例2 2 PEG-PEG-色素色素/AquaphaseAquaphase-PPT(-PPT(一种淀粉的羟丙基衍生物的商品名一种淀粉的羟丙基衍生物的商品名)系统系统从从猪肌组织中连续萃取猪肌组织中连续萃取乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH）1 1、猪、猪肌组织
25、直接在成相系统中匀浆，固形物分配在下相，而目标产物分肌组织直接在成相系统中匀浆，固形物分配在下相，而目标产物分配在上相配在上相。2 2、用、用离心机分相后，上相用纯下相溶液清洗一次，进入第二个离心机离心机分相后，上相用纯下相溶液清洗一次，进入第二个离心机。3 3、从、从第二个离心机流出的上相与磷酸钠溶液第二个离心机流出的上相与磷酸钠溶液(50%(50%，pH6.97.0)pH6.97.0)混合，形混合，形成成PEG/PEG/磷酸钠双水相系统磷酸钠双水相系统。4 4、由于、由于LDHLDH与色素的亲和作用下降，与色素的亲和作用下降，LDHLDH被反萃到下相被反萃到下相(磷钠溶液磷钠溶液)中得到中
26、得到回收，而上相的回收，而上相的PEGPEG和和PEG-PEG-色素返回匀浆机中循环再利用。色素返回匀浆机中循环再利用。将双水相萃取同生物转化结合在一起，可解决在许多生物转化中存在的两个问题：a)产物抑制 b)酶的重复利用（2 2）双水相萃取与生物转化结合双水相萃取与生物转化结合示意图示意图例例1 1 木质素经过酶水解生产乙醇Bartlett等实现了在双水相系统中-甘露糖苷酶催化糖基转化合成低聚糖。Andersson等研究了在PEG/DEX系统中利用枯草杆菌进行流化发酵生产-淀粉酶，比普通发酵的酶产率提高了63%。其他例子四四 混合模式吸附层析混合模式吸附层析混合模式吸附层析（Mixed Mo
27、de Chromatography，MMC），又称多模式层析（Multy Mode Chromatography，MMC）包含两种或两种以上的作用模式，能够与目标生物分子发生多种相互作用的层析方法。混合模式吸附介质上配基的功能往往具有互补性或协同性，因此它能够适应某种特殊条件下对蛋白质的捕获，或者产生类似于群特异性的亲和吸附效果。混合模式吸附技术发展历程“表面活性剂”型疏水层析离子交换型混合模式层析疏水性电荷诱导层析离子交换型混合模式离子交换型混合模式层析层析示意和示例-O CNH(CH2)10NHCO(CH2)2COO-=NH2+CPAD-SepharosePBA-Eupergit-O CH
28、2COHCH2NH2+(CH2)4PEA-ECH-PerlozaPEA-ACA-CDI-Perlozabenzylamine StreamlineCell-SSP-BAStreamline Direct HST I-O CH2COHCH2NH2+(CH2)2-O CONH(CH2)5 CONH(CH2)2-O CONH(CH2)5 COO-or-O CH2COHCH2NH2+CH2-O CH2COHCH2O CH2COHCH2SCH2CH2COO-NHCO离子交换型混合模式层析介质配基的结构亲硫作用层析亲硫作用层析20世纪60年代，Porath等发现吸附剂配基中硫原子的重要作用。1985年，P
29、orath等制备“T-gel”，并正式将该层析方法称为亲硫作用层析（thiophilic interaction chromatography，TIC）高盐下吸附，低盐下洗脱但是与HIC不同的是，“T-gel”配基具有很好的亲水性，对蛋白质的吸附并不是单纯依靠疏水作用。此外，亲硫层析介质对抗体有特异的选择性，但对血清蛋白等吸附作用很弱T-gel-OCH2CH2SCH2CH2SCH2CH2OHOO-OCH2CHOHCH2S(CH2CH2SCH2CH2)nSCH2CH2OHOO-OCH2CH2SCH2CH2SOON-OCH2CH2SCH2CH2SOON-OCH2CH2SCH2CH2NHC=COO-
30、(C N)3-OCH2CH2SCH2CH2SOONNCH3-OCH2CH2SCH2CH2SOONCOOH2-Mercapto-4-MethylpyrimidineN2-Mercapto nicotinic acid-OCH2CH2SCH2CH2SOONS3-(2-mercaptoethyl)quinoline-OCH2CH2SCH2CH2SCH2CH2OO2-Mercapto thiazoleStructuresligands4-Mercapto pyridine2-Mercapto pyridine2-Mercapto ethanolTricyano amino propene 疏水性电荷诱
31、导层析疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)1998年首次由Burton和Harding 提出典型HCIC介质（MEP HyperCel）和吸附洗脱示意：可在含一定量的盐或者无盐下吸附,具有Salt-independent配基密度若40 mmol/ml，则无吸附与免疫球蛋白的保守区中的Trp、Phe等残基有特异性吸附,主要用于抗体的分离，代替Protein A配基pH主导的HCIC介质与蛋白质的作用机理O CH2CH
32、2SOOCH2CH2NNCH3SH+pHpHO CH2CH2SOOCH2CH2NNCH3SpHpHO CH2CH2SOOCH2CH2NNCH3SO CH2CH2SOOCH2CH2NNCH3SO CH2CH2SOOCH2CH2NNCH3SH+pHpHpHpHabcadepH5pH7pH12pH4pH2介质介质配基配基目标物质目标物质产物来源产物来源MEP HyperCelMEP单抗单抗CHO细胞悬浮液细胞悬浮液MEP HyperCelMEP单抗单抗小鼠腹水小鼠腹水MEP HyperCelMEP单抗单抗山羊奶山羊奶MEP HyperCelMEP多抗多抗兔血清兔血清MEP HyperCelMEP多抗
33、多抗兔血清兔血清MEP-SepharoseMEP类风湿因子、抗双链类风湿因子、抗双链DNA抗体抗体人血清人血清MEP HyperCelMEPFc融合蛋白融合蛋白混合溶液混合溶液MEP HyperCelMEP单抗和单抗和Fc融合蛋白融合蛋白CHO细胞细胞MEP HyperCelMEP唾液蛋白唾液蛋白唾液唾液MEP HyperCelMEP前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原精浆精浆MEP HyperCelMEP重组肉毒杆菌神经毒素重组肉毒杆菌神经毒素片断片断毕赤酵母毕赤酵母MEP HyperCelMEP青霉素酰基转移酶青霉素酰基转移酶大肠杆菌大肠杆菌HCIC的应用例子Protein A亲和介质：目前最
34、为常用的抗体亲和层析介质，曾占到所有抗体纯化工艺的70-80%，其局限性：1）Protein A亲和介质十分昂贵，是常规层析介质的10倍左右；2）介质再生困难，重复使用次数有限；3）抗体吸附容量不高；4）Protein A配基易脱落，来源于细菌表面的毒素，影响分离效果和产品质量；5）需要低pH洗脱（pH 3左右），易造成抗体聚集；6）Protein A-抗体的亲和力过强，容易引起抗体结构的变异。“仿亲和”的HCIC介质：）化学配基价格相对便宜，与常规层析介质相当；）配基稳定，再生容易，可多次重复使用；）MEP HyperCel的洗脱pH在4左右，且添加精氨酸等物质可在中性条件下实现洗脱；）亲和
35、力适中，不易引起抗体结构变异。）目前，静态吸附较Protein A高，但动态吸附相对较低；HCIC与传统Protein A亲和对比相同点：通过亲和作用与抗体的Fc片段特异性结合，减低溶液pH实现洗脱。不同点：VSVS五五 扩张床吸附层析扩张床吸附层析扩张床吸附层析（Expanded Bed Adsorpation,EBA）是一种新型的层析操作方式，即结合了传统的流化床（Fluidized Bed）的进料方式，又接近于固定床（Packed Bed）的层析性能，可能看成是一种新型的集成分离技术特点特点用途：集成化用途：集成化扩张床、流化床和固定床的扩张床、流化床和固定床的比较比较操作方式操作方式操
36、作原理操作原理能否处理含颗能否处理含颗粒的料液粒的料液上样方式上样方式吸附效率吸附效率优缺点优缺点扩张床扩张床料液接近平推流通料液接近平推流通过床层，返混小过床层，返混小能能自下而上自下而上好好需特制的介质需特制的介质和装置和装置流化床流化床料液和介质充分混料液和介质充分混合，返混大合，返混大能能自下而上自下而上不好不好为达到一定吸附率，为达到一定吸附率，需循环上样需循环上样固定床固定床流体以平推流通过流体以平推流通过床层床层不能不能自上而下自上而下好好确证可行，已广泛确证可行，已广泛工业化工业化扩张床床层扩张床床层基质的特性基质的特性密度、粒径及其分布和结构组成Sedimented gel
37、volumeD50VDensitymL%mg/mL304972104121928411441.151641.161861.172381.19基质基质的的结构结构ABCA，核壳型；B，混合型；C，均一型商品扩张床介质商品扩张床介质介质介质生产公司生产公司组成和类型组成和类型密度密度g/ml粒径粒径,m/平均粒平均粒径径,m功能基团功能基团StreamlineA m e r s h a m Biosciences琼脂糖-石英砂核壳型基质1.2100300/200DEAE,Q,SP,CM,Chelating,P h e n y l,H e p a r i n,rProtein AStreamline
38、Direct HST IA m e r s h a m Biosciences琼脂糖-不锈钢混合型基质1.880165/130混合模式混合模式UpfrontFastline ProUpfrontChromatographyA/S琼脂糖-碳化钨混合型基质2.53.5 20200离子交换、离子交换、混混合合模式模式扩张床吸附技术的操作扩张床吸附技术的操作(1)平衡 扩张床在每次吸附操作前需用平衡缓冲液扩张，让扩张床扩张到一定程度，并使其达到平衡。在此阶段，基质的功能基团亦达到平衡。在扩张过程中，需要确定一个合适的扩张率E（定义为扩张床床层高度H与沉降床高度H0之比）。扩张率太低，会使料液中的固体颗
39、粒通过困难，造成局部堵塞；扩张率过高，流速太大，会导致液相返混增加，吸附效率降低。一般认为，扩张床吸附层析操作的合适扩张率为23。另外，维持一个最低的沉降床高度，对消除进口处不均匀流化的影响，获得稳定的、返混程度小的床层十分重要，床层稳定时理论塔板数一般为170200 N/m，轴向混合系数在10-6m2/s数量级。(2)吸附 待平衡操作结束后，迅速将进样口由平衡缓冲液切换成料液，开始上样吸附。由于原料液的粘度和密度一般要高于平衡缓冲液，若维持上样流速不变，床层高度就会增加。因此，为保持扩张率不变，需要降低流速；而在吸附过程后期，由于吸附了目标产物和一些杂质，基质颗粒的密度有所增加，此时需要增加
40、流速来维持原来的扩张率。也可以维持不变、根据扩张高度的变化来调节上分布器的位置。Chang等对这两种操作方式作了比较，认为前一种方式较佳，可以获得较高的动态吸附容量。(3)清洗 吸附操作结束以后，介质内外不可避免地残留了部分料液和杂质，因此在对目标产物洗脱前，需先进行清洗操作。清洗一般仍采用扩张床方式，维持上样时的流速不变。清洗液可使用平衡缓冲液或高粘度缓冲液。采用后者可以减少清洗液的用量，同时保证清洗液以更接近于平推流的方式流过床层，获得更好的清洗效果。(4)洗脱 洗脱是层析过程的关键步骤。扩张床层析过程有两种洗脱方式，即固定床方式（自上而下）和扩张床方式（自下而上）。如果介质与目标产物之间
41、的结合力较弱，产物主要吸附在床层的下半部分，应采用固定床方式洗脱；如果介质的吸附容量已经达到饱和，产物相对均匀地分布于整个床层之中，则采用扩张床洗脱方式更为有效。两种洗脱方式各具特色，采用固定床方式不仅可以减少洗脱液的用量，增加产物的浓度，还可以避免目标产物的过度稀释，但缺点是洗脱时间长，操作过程复杂，介质颗粒会聚集，影响其再度扩张；而采用扩张床洗脱方式的优点是过程简单，操作方便、迅速，不会造成介质的聚集，设备简单，有利于工业化控制，可以实现连续化操作。(5)再生 再生必须在洗脱之后马上进行，是必不可少的一环。扩张床介质比传统的固定床介质更容易遭到细胞、细胞碎片、脂类、核酸等杂质的污染，这往往
42、引起吸附容量的降低和介质颗粒之间的聚集，使介质的流体动力学特性和吸附性能的重复性不佳。再生操作首先由配基性质而定，与固定床介质的再生方式基本相同；其次根据扩张床介质的基球性质，需避免对基球结构和材料的破坏。一般商品介质给出了最优的再生方案扩张床吸附技术的应用扩张床吸附技术的应用目标产物目标产物产物来源产物来源吸附剂吸附剂收率收率纯化倍数纯化倍数纳豆激酶纳豆激酶枯草杆菌Streamline SP93%8.7-乳清蛋白乳清蛋白脱脂牛奶Streamline Phenyl人人Fab片断片断重组大肠杆菌Red Fastmabs90%8.7融合蛋白融合蛋白重组大肠杆菌Streamline SP7080%1
43、00GST-(His)6重组大肠杆菌Streamline Chelating80%3.3乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶猪肉浆Cibacron Blue Celbeads100%31Kinesin-(His)6重组大肠杆菌Streamline Chelating100%-半乳糖苷酶半乳糖苷酶重组大肠杆菌Streamline Chelating86%6人纤维生长因子人纤维生长因子重组大肠杆菌Streamline SP87%17人表皮生长因子人表皮生长因子重组大肠杆菌Streamline DEAE80%4.3Luciferase-(His)6昆虫细胞Streamline Chelating糖基转移酶糖基转移酶
44、肺球菌发酵液Affinity HEG Beads38%95甲酸脱氢酶甲酸脱氢酶大肠杆菌Procion Red Streamline85%单抗单抗IgG1CHO细胞液Streamline Protein A单抗单抗IgG1-kCHO细胞液Protein A Sepharose F F7782%hGH-GST融合蛋白融合蛋白蛋白裂解液Streamline SP XL90%MBP-(His)6重组大肠杆菌Streamline Chelating66%5.9单核白细胞单核白细胞外周血液Antibody FEP-PVA77%人表皮生长因子人表皮生长因子重组大肠杆菌Streamline SP93%20抗抗
45、-rHBsAg细胞培养液Streamline Protein A92%7荧光蛋白荧光蛋白重组大肠杆菌Streamline Chelating94%19Endostatin酵母培养液CM HyperZ85%40纳豆激酶纳豆激酶枯草杆菌Fastline PRO47.3%12.3b-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶酵母培养液酵母培养液Streamline Direct HST74%17工业上血液体系的纯化有较多的应用 如凝血八因子、凝血十三因子等特色特色应用应用分组讨论1膜层析在生物大分子纯化中的应用 1-3小组，每组准备2个应用案例 每组选派代表，10min左右PPT 每组必须提问至少一个问题混合模式吸附层析
46、的应用 4-7小组，每组准备2个应用案例 每组选派代表，10min左右PPT 每组必须提问至少一个问题分组讨论2根据以下两篇文献，做中文PPT介绍主题：抗体的纯化技术1、Klaus Huse,Hans-Joachim Bohme,Gerhard H.Scholz.Purification of antibodies by affinity chromatography J.Biochem.Biophys.Methods 51(2002)2172312、Ana C.A.Roque a,b,Claudia S.O.Silva a,M.Angela Taipa.Affinity-based methodologies and ligands for antibody purification-Advances and perspectives.Journal of Chromatography A,1160(2007)4455每位同学做PPT介绍，根据情况选择代表上台讲述。
