1、(二二)无菌操作和接种技术及微生物的分离、培养无菌操作和接种技术及微生物的分离、培养与数量测定与数量测定第1页，共71页。学习导航学习导航1.学会无菌操作和接种技术。学会无菌操作和接种技术。(重点重点)2研究培养基对微生物的选择作用。研究培养基对微生物的选择作用。(重点重点)3了解平板分离微生物的方法和计数。了解平板分离微生物的方法和计数。(重点重点)4简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。(难难点点)第2页，共71页。新知初探新知初探思维启动思维启动无菌无菌培养基培养基玻璃刮铲玻璃刮铲穿刺穿刺平板划线平板划线第3页，共71页。2.无菌操作无菌
2、操作微生物接种技术的关键微生物接种技术的关键(1)培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要等，在接种之前都需要_。(2)通常接种操作要在通常接种操作要在_的附近进行的附近进行。灭菌灭菌酒精灯火焰酒精灯火焰第4页，共71页。1在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作？作？提示：提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。菌污染。想一想想一想第5页，共71页。二、微生物的分离二、微生物的分离1.原理：根据微生物对原理：根据微生物对_、氧气、氧气、pH等要求的不同，
3、通过只提供目的微生物生长的等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的_条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到能生长，从而达到_微生物的目的。微生物的目的。2.方法方法(1)据菌落形态特征初步分离据菌落形态特征初步分离营养成分营养成分必需必需选择分离选择分离第6页，共71页。菌落：菌落：_微生物在适宜的微生物在适宜的_培养基表培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、有一定的、有一定_的子细胞生长群体。当固的子细胞生长群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，称为体培养基表面众多菌落
4、连成一片时，称为_。菌落特征：不同微生物在菌落特征：不同微生物在_培养基上培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该类微生物进行，可以成为对该类微生物进行_、_的重要依据。的重要依据。单个单个固体固体形态结构形态结构菌苔菌苔特定特定分类分类鉴定鉴定第7页，共71页。涂抹平板法涂抹平板法平板划线法平板划线法单个单个第8页，共71页。(1)使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不再灭菌。再灭菌。()(2)富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，反之则多。反之则
5、多。()(3)菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。()(4)稀释涂抹平板法的结果都可在培养基表面形成稀释涂抹平板法的结果都可在培养基表面形成单个的菌落。单个的菌落。()判一判判一判第9页，共71页。三、土壤微生物的分离和计数三、土壤微生物的分离和计数1.准备实验器材准备实验器材2.采集土壤，制备悬液采集土壤，制备悬液(1)制备悬液制备悬液称取称取0.5 g土壤样品，倒入盛有土壤样品，倒入盛有50 mL无菌水的无菌水的锥形瓶，振荡锥形瓶，振荡20 min，使土样充分打散，即成，使土样充分打散，即成为为102 g/mL的土壤悬液。的土壤悬液。第10页，共
6、71页。(2)等比稀释等比稀释用无菌移液管吸取用无菌移液管吸取0.5 mL土壤悬液注入盛有土壤悬液注入盛有4.5 mL_的的1号试管，配成号试管，配成103 g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号试号试管管3次，使悬液均匀，再吸取次，使悬液均匀，再吸取0.5 mL注入盛有注入盛有4.5 mL无菌水的无菌水的2号试管，配成号试管，配成104 g/mL的的土壤悬液。以此类推，依次配制成土壤悬液。以此类推，依次配制成105 g/mL、106 g/mL、107 g/mL、108 g/mL的土的土壤悬液。壤悬液。无菌水无菌水第11页，共71页。3.选择适于分离特
7、定微生物的培养基选择适于分离特定微生物的培养基不同微生物的代谢特性不同，通过不同微生物的代谢特性不同，通过_可选出所需要的特定微生物。可选出所需要的特定微生物。4.接种接种采用采用3支无菌移液管分别吸取支无菌移液管分别吸取108 g/mL、107 g/mL、106 g/mL的土壤悬液各的土壤悬液各1 mL加入培养加入培养皿中，每个浓度设置皿中，每个浓度设置_个重复，并充分振个重复，并充分振荡混合均匀，用荡混合均匀，用_平板法进行分离。平板法进行分离。选择培养基选择培养基3涂抹涂抹第12页，共71页。5.培养与观察培养与观察将培养皿倒置于将培养皿倒置于_ 恒温箱中培养恒温箱中培养12 d，观察细
8、菌菌落。，观察细菌菌落。6.计数菌落计数菌落培养培养2448 h后取出平板计数，选取菌落数为后取出平板计数，选取菌落数为30300的一组为代表进行统计。的一组为代表进行统计。每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数复培养后的菌落平均数稀释倍数稀释倍数(假定涂抹假定涂抹所用稀释液为所用稀释液为1 mL)。37第13页，共71页。2A同学分离与培养土壤微生物时与其他同学的结同学分离与培养土壤微生物时与其他同学的结果相差很大，请分析可能的原因是什果相差很大，请分析可能的原因是什么？并进一步通过对照实验验证原因。么？并进一步通过对照实验验证原因。想一
9、想想一想第14页，共71页。可能原可能原因因实验验证实验验证结论结论所取土所取土样不同样不同其他同学用与其他同学用与A同学一样的同学一样的土样进行实验土样进行实验若结果与若结果与A同学的一致，同学的一致，则说明土样没问题；若则说明土样没问题；若结果与结果与A同学的不一致，同学的不一致，则说明则说明A同学操作失误或同学操作失误或培养基配制有问题培养基配制有问题培养基培养基污染或污染或操作失操作失误误将将A同学配制同学配制的培养基在不的培养基在不加土样的情况加土样的情况下进行培养，下进行培养，作空白对照作空白对照若有菌落出现，则说明若有菌落出现，则说明培养基被污染，若无菌培养基被污染，若无菌落出现
10、，则说明未被污落出现，则说明未被污染染提示：提示：第15页，共71页。四、设计实验分离土壤中能分解纤维素的微生物四、设计实验分离土壤中能分解纤维素的微生物1.研究目的研究目的从土壤微生物中筛选出能分解纤维素的微生物。从土壤微生物中筛选出能分解纤维素的微生物。2.实验原理实验原理纤维素分解菌可以分泌纤维素分解菌可以分泌_，在用，在用_作为惟一碳源的培养基中，纤维素分解菌能作为惟一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，其他微生物则不能生长。很好地生长，其他微生物则不能生长。纤维素酶纤维素酶纤维素纤维素第16页，共71页。3.方法步骤方法步骤(1)制备选择培养基：培养基中提供碳源的物质制备选择培
11、养基：培养基中提供碳源的物质只有只有_。(2)分装分装(3)制备土壤稀释液：依次制备稀释度为制备土壤稀释液：依次制备稀释度为101、102、103、104、105的土壤稀释液。的土壤稀释液。纤维素纤维素第17页，共71页。(4)接种培养：分别吸取各稀释度的土壤稀释液接种培养：分别吸取各稀释度的土壤稀释液1 mL接种到滤纸条上，每个稀释度重复接种到滤纸条上，每个稀释度重复4次，置次，置_中培养。中培养。(5)观察：检查各试管中滤纸条上出现的观察：检查各试管中滤纸条上出现的_和滤和滤纸颜色的变化情况。纸颜色的变化情况。培养箱培养箱菌落菌落第18页，共71页。3在等比稀释的过程中如何使微生物在菌液中
12、均匀分在等比稀释的过程中如何使微生物在菌液中均匀分布？你认为计数的菌落与实际菌落之间存在什么样的布？你认为计数的菌落与实际菌落之间存在什么样的关系？关系？提示：提示：每次吸取前都要将土壤悬液充分振荡混合均匀每次吸取前都要将土壤悬液充分振荡混合均匀。实际菌落数目大于计数的菌落数目。实际菌落数目大于计数的菌落数目。想一想想一想第19页，共71页。要点突破要点突破讲练互动讲练互动无菌操作无菌操作1.无菌技术的概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭无菌技术的概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。第20页，共
13、71页。2.无菌技术的具体内容无菌技术的具体内容(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。养基等进行灭菌。(3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。免周围环境中微生物的污染。(4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。与周围物品接触。第21页，共71页。特别提醒特别提醒在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心在微生物的实验室培养中
14、，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。第22页，共71页。细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌锅、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这菌锅、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A接种环、手、培养基接种环、手、培养基B高压锅、手、接种环高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环培养基、手、接种环 D接种环、手、高压锅接种环、手、高压锅第23页，共71页。【解析解析】此题考查学生对无菌技术的掌握。高此题考查学生对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，
15、通常用于培养压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。接种工具，如接种环。【答案答案】C第24页，共71页。1.下列操作错误的是下列操作错误的是()A用酒精擦拭双手用酒精擦拭双手B用氯气消毒水源用氯气消毒水源C实验室用紫外线进行消毒实验室用紫外线进行消毒D玻璃器皿玻璃器皿(吸管、培养皿吸管、培养皿)用酒精直接擦拭用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的即可达到彻底灭菌的目的变式训练变式训练第25页，共71页。解析
16、：选解析：选D。玻璃器皿、金属用具等耐高温、需。玻璃器皿、金属用具等耐高温、需要保持干燥的物品，应采用干热灭菌法进行灭要保持干燥的物品，应采用干热灭菌法进行灭菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底灭菌的目的菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底灭菌的目的。第26页，共71页。1原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的立的活微生物体经过生长、
17、繁殖均可形成便于移植的菌落。菌落。平板分离法平板分离法第27页，共71页。2.常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。基是琼脂固体培养基。3.方法：方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生长。长。(2)混合平板法：分离材料进行混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀倍系列稀释，取
18、一定稀释度样品与溶化的琼脂混合，将与样品混合的琼脂倒入释度样品与溶化的琼脂混合，将与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。第28页，共71页。(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。线等。4.目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的微生物的单个菌落。目的微生物的单个菌落。(1)灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。杀死菌种。(2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂整个操作过程要在
19、酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。菌污染。(3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。基划破。第29页，共71页。(2012盐城高二检测盐城高二检测)下图是微生物平板下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为划线示意图。划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是下列操作方法正确的是()A操作前要将接种环放在火焰旁边灼烧灭菌操作前要将接种环放在火焰旁边灼烧灭菌B划线操作要在火焰上进行划线操作要在火焰上进行C在在5区域中才可以得到所需菌落区域中才可以得到所需菌落D在在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接区域中划线前后都要对接种环灭菌种环灭菌第30
20、页，共71页。【解析解析】操作前要将接种环放在酒精灯的外焰操作前要将接种环放在酒精灯的外焰灼烧进行灭菌；整个操作过程要在酒精灯旁进行灼烧进行灭菌；整个操作过程要在酒精灯旁进行；1、2、3、4、5这五个区域都可能有所需菌落；这五个区域都可能有所需菌落；在每次画线前对接种环灼烧是为了杀死上次画线结在每次画线前对接种环灼烧是为了杀死上次画线结束后接种环上残留的菌种，画线结束后对接种环灭束后接种环上残留的菌种，画线结束后对接种环灭菌是为了杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染菌是为了杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。环境和感染操作者。【答案答案】D第31页，共71页。变式训练变式训练
21、2.有关稀释涂抹平板法的叙述，错误的是有关稀释涂抹平板法的叙述，错误的是()A首先将菌液进行一系列的梯度稀释首先将菌液进行一系列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面固体培养基的表面C适宜条件下培养适宜条件下培养D结果都可在培养基表面形成单个的菌落结果都可在培养基表面形成单个的菌落第32页，共71页。解析：选解析：选D。稀释涂抹平板法是将菌液进行一系列。稀释涂抹平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有琼脂固体培养基的表
22、面，在适宜条件下培养。只有在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。的菌落。第33页，共71页。菌落数目的统计方法菌落数目的统计方法1.显微镜直接计数法显微镜直接计数法(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。微生物的数量。第34页，共71页。(2)方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其
23、上有特定的面积为片，其上有特定的面积为1 mm2，高为，高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成的计数室，一个计数室又被分成25个个(或或16个个)中中格，每个中格再被划分成格，每个中格再被划分成16个个(或或25个个)小格，每小格，每个计数室都由个计数室都由400个小格组成。个小格组成。(3)操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数玻片，然后在显微镜下计数45个中格中的细个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。按计算公式求出每毫升样品中所
24、含的细菌数。第35页，共71页。(4)计算公式计算公式每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数。稀释倍数。(5)缺点：不能区分死菌与活菌。缺点：不能区分死菌与活菌。2.间接计数法间接计数法(活菌计数法活菌计数法)(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。能推测出样品中大约含有多少活菌。第36页，共71页。(2)操作操作设置
25、重复组，增强实验的说服力与准确性。设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。养，计算出菌落平均数。第3
26、7页，共71页。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数，若设置的重复组中结果的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。相差太远，意味着操作有误，需重新实验。3.滤膜法滤膜法(1)实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。第38页，共71页。(2)过程：将已知体积的水过滤后，将滤膜放于过程：将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿
27、色的菌落数目，计算出水样中大肠培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。杆菌的数量。第39页，共71页。特别提醒特别提醒统计菌落数目的注意事项：统计菌落数目的注意事项：一般选择菌落数在一般选择菌落数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。验结果的影响，提高实验结果的可信度。第40页，共71页。下列是关于检测土壤中细菌
28、总数实验操下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是作的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板温、高压灭菌后倒平板B取取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水倍的土壤稀释液和无菌水各各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培恒温培养养2448小时小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上以上的实验组平板进行计数的实验组平板进行计数第41页，共71页。【思路点拨思路点拨】本题主要考查统
29、计菌落数目的方法，本题主要考查统计菌落数目的方法，解答本题需从以下几点入手：解答本题需从以下几点入手：区分实验材料的灭菌方法。区分实验材料的灭菌方法。理解空白对照在菌落计数实验中的作用。理解空白对照在菌落计数实验中的作用。明确菌落计数的选择范围。明确菌落计数的选择范围。第42页，共71页。【解析解析】本题考查的是土壤微生物总数的本题考查的是土壤微生物总数的计数，所以培养所使用的培养基就应该是基计数，所以培养所使用的培养基就应该是基本培养基，并要经过高压蒸汽灭菌处理；涂本培养基，并要经过高压蒸汽灭菌处理；涂布时要对样本的水溶液进行稀释，一般选取布时要对样本的水溶液进行稀释，一般选取104、105
30、、106倍的土壤稀释液各倍的土壤稀释液各0.1 mL进行进行涂布，为了检查平板培养基是否制备合格，涂布，为了检查平板培养基是否制备合格，要同时把一培养基接种少量无菌水，以作空要同时把一培养基接种少量无菌水，以作空白对照；白对照；第43页，共71页。培养一段时间后，如果平板上菌落个数在培养一段时间后，如果平板上菌落个数在30300之间之间，即可把该组所有平板的菌落计数，然后取其平均，即可把该组所有平板的菌落计数，然后取其平均值，即可计算出土壤细菌的总数。而值，即可计算出土壤细菌的总数。而D项是菌落数在项是菌落数在300以上，故以上，故D项错。项错。【答案答案】D第44页，共71页。互动探究互动探
31、究C项倒置平板的目的是什么？项倒置平板的目的是什么？【提示提示】防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成培养基污染。培养基污染。第45页，共71页。【探规寻律探规寻律】每一稀释度下设置多于每一稀释度下设置多于3个平板个平板，一般选择菌落数在，一般选择菌落数在30300之间的平板计数。若之间的平板计数。若几个平板的菌落数均不在几个平板的菌落数均不在30300之间，但几个之间，但几个平板菌落数目相近，且接近平板菌落数目相近，且接近30300之间之间(如菌落如菌落数目为数目为28、25、24、27)，则也可以取其平均值作，则也可以取其平均值作为菌落数。为菌落数。第46页，
32、共71页。变式训练变式训练3.(2012安康高二检测安康高二检测)自然界中的微生物往往自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。答有关问题。步骤如下：步骤如下：制备稀释倍数为制备稀释倍数为102、103、104、105、106的的系列稀释液。系列稀释液。第47页，共71页。为了得到更加准确的结果，应选用为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。法接种样品。适宜温度下培养。适宜温
33、度下培养。结果分析：结果分析：(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是实更加接近的是()A一个平板，统计的菌落数是一个平板，统计的菌落数是23第48页，共71页。B两个平板，统计的菌落数是两个平板，统计的菌落数是22和和26，取平，取平均值均值24C三个平板，统计的菌落数分别是三个平板，统计的菌落数分别是21、5和和52，取平均值，取平均值26D四个平板，统计的菌落数分别是四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和和25，取平均值，取平均值25第49页，共71页
34、。(2)一同学在稀释倍数为一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平的培养基上测得平板上菌落数的平均值为板上菌落数的平均值为23.4，那么每升样品中，那么每升样品中的菌落数是的菌落数是(涂布平板时所用的稀释液体积为涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量测得的数量_(多、少多、少)，因为，因为_。第50页，共71页。解析：若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂抹解析：若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂抹平板法接种样品。实验时，每一个浓度至少涂布三平板法接种样品。实验时，每一个浓度至少涂布三个平板，以增强
35、实验的说服力和准确性。个平板，以增强实验的说服力和准确性。(1)应选应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)23.40.21061.17108。(3)因为菌落可能因为菌落可能由由1个或多个大肠杆菌连在一起生长而成，所以实个或多个大肠杆菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。际活菌数量要比测得的数量多。第51页，共71页。答案：步骤答案：步骤：稀释涂抹平板：稀释涂抹平板(1)D(2)1.17108(3)多当两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板多当两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上观察的是一个菌落上观察的是一个菌落第52页，共7
36、1页。实验探究实验探究专项突破专项突破【操作与实践】【操作与实践】微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。三个步骤。微生物的分离微生物的分离第53页，共71页。1.稀释稀释用用1 mL无菌吸管吸取无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加大肠杆菌培养液，加入到盛有入到盛有9 mL无菌水的大试管中，充分混匀，无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一加入另一支盛有支盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，依次无菌水的试管中，混合均匀，依次类推制成类推制成101、102、103、104、105
37、、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。系列稀释度的大肠杆菌稀释液。第54页，共71页。第55页，共71页。2.划线或涂布划线或涂布(1)平板划线分离法平板划线分离法在近火焰处，左手拿在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种和连续划线两种(如图如图)。平行划线时，每转。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。培养皿盖，做好标记。第56页，共71页。第57页，共71页。特别提醒特别提醒平
38、板划线法中的注意事项平板划线法中的注意事项取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：的如下表：第58页，共71页。取菌种取菌种之前之前每次划线之前每次划线之前划线结束划线结束目目的的杀死接杀死接种环上种环上原有的原有的微生物微生物杀死上次划线后接种杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接下次划线的菌种直接来源于上次划线的末来源于上次划线的末端，使每次划线后菌端，使每次划线后菌种数目减少种数目减少杀死接种环上杀死接种环
39、上残存的菌种，残存的菌种，避免细菌污染避免细菌污染环境和感染操环境和感染操作者作者第59页，共71页。从第二次以后的划线操作总是从上一次划从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。而来的菌落。第60页，共71页。(2)涂布分离法涂布分离法取取3个平板，底面分别用个平板，底面分别用记号笔写上记号笔写上104、105和和106三种稀释度，三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各液各0.1 m
40、L，放入已标记好的平板上，用无，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置室温下静置510 min，使菌液吸附进培养基，使菌液吸附进培养基(如图如图)。第61页，共71页。第62页，共71页。特别提醒特别提醒将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为70%的酒的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。焰上引燃。操作中一定要注意防火，不要将过热的玻璃操作中一定要注意防火，不要
41、将过热的玻璃刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。酒精。第63页，共71页。3.培养培养将划线或涂布接种的平板倒置于将划线或涂布接种的平板倒置于37 培养箱培养箱中，培养中，培养1624 h，即可长出单菌落。，即可长出单菌落。第64页，共71页。【问题与探究问题与探究】1.在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？【提示提示】(1)酒精灯与培养皿的距离要适中。酒精灯与培养皿的距离要适中。(2)接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。(3)接种环要用酒精灯灼烧。接种环要用酒精灯灼烧。(4)将
42、沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。第65页，共71页。2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？【提示提示】如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要重后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要重新制备。新制备。第66页，共71页。3.在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立菌落？了独立菌落？【提示提示】如果培养基上生长的菌落的颜色、如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特形状
43、、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上出现其他菌落，有其他杂菌混杂，可再一次进出现其他菌落，有其他杂菌混杂，可再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。行分离、纯化，直到获得纯培养。第67页，共71页。【例题例题】有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制、硝酸盐、
44、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题：。分析回答问题：(1)培养基中加入的化合物培养基中加入的化合物A是是_，为微生物的，为微生物的生长提供生长提供_，这种培养基从功能上进行分类，这种培养基从功能上进行分类，应属于，应属于_培养基。培养基。第68页，共71页。(2)若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答：若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答：在接种时，为什么在操作的第一步以及每次划在接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？线之前都要灼烧接种环？_。在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？在
45、划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？_。除此之外，还可用除此之外，还可用_法来获得纯净的菌株。法来获得纯净的菌株。第69页，共71页。【解析解析】若筛选到能利用纤维素若筛选到能利用纤维素(可产生纤维素可产生纤维素酶酶)的微生物，培养基中加入的化合物的微生物，培养基中加入的化合物A，应为纤维素。，应为纤维素。制备只以纤维素作碳源的选择培养基，能在该培养基中制备只以纤维素作碳源的选择培养基，能在该培养基中生长的微生物应为可产生纤维素酶的微生物，此即目标生长的微生物应为可产生纤维素酶的微生物，此即目标微生物。微生物。【答案答案】(1)纤维素纤维素 碳源碳源 选择选择 第70页，共71页。(2)第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基；每次划线前灼烧接种环微生物而污染培养基；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落划线结束后仍要灼烧接种环，以免菌种对环境造划线结束后仍要灼烧接种环，以免菌种对环境造成污染成污染稀释涂抹平板稀释涂抹平板第71页，共71页。
