1、第十节第十节第十节第十节第十节第十节一、一、引言引言二、二、蛋白质（酶）分蛋白质（酶）分离纯化的前处理离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离三、蛋白质（酶）分离与纯化与纯化四、层析技术四、层析技术五、电泳技术五、电泳技术六、离心技术六、离心技术四、层析技术四、层析技术四、层析技术四、层析技术四、层析技术四、层析技术 层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是19061906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Michael TswettTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成有吸附剂的柱子，各种
2、色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法色谱法”（Chromatography)Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。19441944年出现纸层析。年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现薄层层析、气相层析、以后层析法不断发展，相继出现薄层层析、气相层析、高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等。高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等。（一）层析的分类（一）层析的分类（一）层析的分类（一）层析的分类（一）层析的分类（一）层析的分类 按层析的分离机理分类按层析的分离机理分类 排阻层析排
3、阻层析(exclusion chromatography)离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography)吸附层析吸附层析(absorption chromatography)(absorption chromatography)分配层析分配层析(partition chromatography)(partition chromatography)亲和层析亲和层析(affinity chromatography)金属螯合层析金属螯合层析(metal chelating chromatography)疏水层析疏水层析(hydrophobic chromatogr
4、aphy)反向层析反向层析(reverse phase chromatography)聚焦层析聚焦层析(focusing chromatography)灌注层析灌注层析(perfusion chromatography)（二）排阻层析（二）排阻层析（二）排阻层析（二）排阻层析（二）排阻层析（二）排阻层析 （凝胶层析）（凝胶层析）（凝胶层析）（凝胶层析）（凝胶层析）（凝胶层析）凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。凝
5、胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药的研究和生产中必不可少的分离介质。的研究和生产中必不可少的分离介质。1 1 1、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用 特点：设备简单、操作方便、样品回收特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物
6、学活性等优点。品生物学活性等优点。用途：蛋白质用途：蛋白质(包括酶包括酶)、核酸、多糖等生、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。2 2 2、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。概念（概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装排阻层析，分子筛层析）：当生物
7、大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。行分离的技术。原理：原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱
8、出来。被洗脱出来。3.3.3.3.3.3.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质(1)(1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（Sephadex)Sephadex)1)Sephadex G 1)Sephadex G G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。G G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2 2）SephadeX LHSephadeX LH2020，是，是Sephadex GSephadex G2525的羧丙基衍生物，溶于的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用
9、于分离不溶于水的物质。水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。(2)(2)琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。构越密集。(3)(3)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶商
10、品名为生物胶P P（Bio-Gel P).Bio-Gel P).(4)(4)聚丙乙烯凝胶（聚丙乙烯凝胶（Styrogel)Styrogel)大网孔结构。大网孔结构。葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)(Sephadex)(Sephadex)的物理特性的物理特性的物理特性的物理特性的物理特性的物理特性品 名干胶颗粒直径/m得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量Da线性葡聚糖分子质量/Da20lOOSephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319
11、810(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)4.4.4.层析柱的
12、重要参数层析柱的重要参数层析柱的重要参数层析柱的重要参数层析柱的重要参数层析柱的重要参数 柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称引柱体积又称“床床”体积，常用体积，常用Vt 表示。表示。外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用常用Vo表示。表示。内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒
13、内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。表示。不包不包括固体支持物的体积（括固体支持物的体积（Vg）。）。峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用脱液的体积，常用Ve 表示。表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为洗脱液体积为Ve。当样品体积与洗脱体积比较不能
14、当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。洗脱体积洗脱体积5.5.5.5.5.5.凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用1）生物大分子物质的分离纯化生物大分子物质的分离纯化2 2）分子量的测定）分子量的测定3 3）分级分离）分级分离4 4）溶液浓缩
15、）溶液浓缩5 5）平衡常数的测定）平衡常数的测定6 6）细胞及颗粒的分离）细胞及颗粒的分离6.6.6.6.6.6.分子量的测定分子量的测定分子量的测定分子量的测定分子量的测定分子量的测定 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关量有关:LogM=kLogM=k1 1-k-k2 2VeVe（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查标准曲，查标准曲线即可确定分子量。线即可确定分子量。LogM
16、LogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测（三）离子交换层析（三）离子交换层析（三）离子交换层析（三）离子交换层析（三）离子交换层析（三）离子交换层析 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲亲和力和力不同而达到分离的目的。不同而达到分离的目的。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。分子中含有可解离的基团。含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出可解离出H H+；含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，含有碱性可解离基团的称为阴离
17、子交换树脂，可解离出可解离出OHOH-。1.1.1.离子交换层析的原理离子交换层析的原理离子交换层析的原理离子交换层析的原理离子交换层析的原理离子交换层析的原理 生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式。不同的分子大小及电荷排列方式。当在一定当在一定pHpH下净电荷为负的蛋白质分子可通下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；当在一定当在一定pHpH下净电荷为正的蛋白质分子可下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；通过静电键结合到带负电荷
18、的阳离子交换剂上；大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或离子强度或(和和)pH)pH使大分子再从离子交换剂上使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。先后被洗脱下来。2.2.2.离子交换层析的应用离子交换层析的应用离子交换层析的应用离子交换层析的应用离子交换层析的应用离子交换层析的应用1)1)水处理水处理 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用
19、于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。水软化以及污水处理等方面。2)2)分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质 离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在酸混合液在pHpH值为值为2 23 3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的离子强度和上，再逐步提高洗脱液的离子强度和pHpH值，这样各种氨值，这样各种氨
20、基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。3)3)分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。种重要手段。由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离
21、方法结合使用。合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。交换层析可以得到较满意的分离效果。（四）吸附层析（四）吸附层析（四）吸附层析(absorption chromatography)(absorption chromatography)(absorption chromatography)吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。集在其表面的现象。利用吸附层析介
22、质表面的活性分子或活性基团，利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。法，称之为吸附层析。固定相为固体，流动相为液体。固定相为固体，流动相为液体。物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在固体内部，分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在固体内部，分子之间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处子之间互相作用的力是对称的，其力场
23、互相抵消。而处于固体表明的分子所收的力是不对称的，向内的一面受于固体表明的分子所收的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的
24、分子之间可以建立动子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。吸的动态平衡过程。实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和淀粉。淀粉。常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物。醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物。吸附层析通常用于分离脂类、
25、类固醇类、类胡吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物。性不强的有机物。（五）分配层析（五）分配层析（五）分配层析(partition chromatography)(partition chromatography)(partition chromatography)分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。一种连续性的溶剂抽提方法。在分配层析中，固定相是极
26、性溶剂（例如水、在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此类溶剂能和多孔的支持稀硫酸、甲醇等）。此类溶剂能和多孔的支持物物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，使呈紧密结合，使呈不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂。不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂。分配系数分配系数()是指在一定温度和压力条是指在一定温度和压力条件下达到平衡，物质在固定相和流动相件下达到平衡，物质在固定相和流动相两部分的浓度比值。两部分的浓度比值。分配系数（分配系数（）物质在固定相中的浓度物质在固定相中的浓
27、度 物质在流动相中的浓度物质在流动相中的浓度 在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移动。当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进行动。当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进行分配，一部分进入固定相。通过这样不断进行的流动分配，一部分进入固定相。通过这样不断进行的流动和再分配，溶质沿着流动方向不断前进。各种溶质由和再分配，溶质沿着流动方向不断前进。各种溶质由于分配系数不同，向前移动的速度也各不相同。分配于分配系数不同，向前移动的速度也各不相同。分配系
28、数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的物质，动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快。从而将分配系数不同的物质分离开来。流动速度较快。从而将分配系数不同的物质分离开来。（六）（六）（六）（六）（六）（六）亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性
29、。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物合的特性。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。1.1.1.亲和层析的原理亲和层析的原理亲和层析的原理 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性
30、特异结合的化合物（称配体）连接到质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的脱下来，从而达到分离提纯的目的。配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交
31、联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体2.2.2.亲和层析的特点亲和层析的特点亲和层析的特点 纯化效率极高：亲和层析由于配体与待纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍纯的效率极高，提纯度可达几千倍。3.3.3.亲和层析的应用亲和层析的应用亲和层析的应用 1）抗原和抗体抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲
32、和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为108-1012 M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。的洗脱条件。2)激素和受体蛋白激素和受体蛋白 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以
33、利用影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（激素和受体蛋白间的高亲和力（10-61012 M）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。啡、胰岛素等等多种激素的受体。3)凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖
34、、中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A能结合含能结合含-D-吡喃甘露糖苷或吡喃甘露糖苷或-D-吡吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。喃葡萄糖苷的糖蛋白。麦胚凝集素可以特异的与麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集、红细胞膜凝集素受体等的分离。素受体等的分离。洗脱时只
35、需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。蛋白洗脱下来。4）多核苷酸和核酸）多核苷酸和核酸 利用利用poly-U作为配体可以用于分离作为配体可以用于分离mRNA以及各种以及各种poly-U结合蛋白。结合蛋白。poly-A可以用于分离可以用于分离RNA聚合酶以及其它聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。结合蛋白。以以DNA作为配体可以用于分离各种作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、结合蛋白、DNA聚合酶、聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。5）辅酶）辅酶 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多
36、种酶的辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。以用于分离各种激酶和脱氢酶。6）分离病毒、细胞）分离病毒、细胞 利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。
37、利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。等。（七）金属螯合层析（七）金属螯合层析（七）金属螯合层析（七）金属螯合层析（七）金属螯合层析（七）金属螯合层析(metal chelating chromatography)(metal chelating chromatography)(metal chelating chromatography)利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二
38、酸为利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。离的方法，称之为金属螯合层析。金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的
39、分离于表达蛋白的分离于表达蛋白的分离于表达蛋白的分离于表达蛋白的分离于表达蛋白的分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein（八）高效液相色谱（八）高效液相色谱（八）高效液相色谱（八）高效液相色谱（八）高效液相色谱（八）高效液相色谱（HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC）高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相象挥发性和热稳定性的限制
40、，因而弥补了气相色谱法的不足。色谱法的不足。目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占的约占20%，而，而80%则需用高效液相色谱来分则需用高效液相色谱来分析。析。1.1.1.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。的高效分离分析方法。2.2.2.液相色谱仪、主要部件及流程液相色谱仪、主要部件及流程液相色谱仪、主要部件及流程液相色谱仪、主要部件及流
41、程液相色谱仪、主要部件及流程液相色谱仪、主要部件及流程主要部件主要部件主要部件主要部件主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（很小的固定相（10m），），液体的流动相高速通过时，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的压、高速是高效液相色谱的特点之一。特点之一。(2)(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一利
42、用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同极性将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(3)(3)(3)进样装置进样装置进样装置进样装置进样装置进样装置流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：(4)(4)(4)高效分离柱高效分离柱高效分离柱高效分离柱高效分离柱高效分离柱柱体为直
43、型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(5)(5)(5)高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器紫外光度检测器（紫外光度检测器（UV）：最小检测量）：最小检测量10-9gmL-1，对流，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。最常用的检测器。光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处
44、理，三维立体谱图，如图所示定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。3.3.3.影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素 影响分离的主要因素有影响分离的主要因素有:固定相及分离柱；固定相及分离柱；流动相的流量、性质和极性流动相的流量、性质和极性;1 1 1）固定相及分离柱）固定相及分离柱）固定相及分离柱）固定相及分离柱）固定相及分离柱）固定相及分离柱选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作
45、，一般很少自行制备。常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。研制高效柱填料是一活跃领域。2 2 2）流动相及流动相的极性）流动相及流动相的极性）流动相及流动相的极性）流动相及流动相的极性）流动相及流动相的极性）流动相及流动相的极性（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流
46、动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。种类型分离柱上的出峰顺序相反。流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。
47、按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。4.4.4.高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型1 1）吸附色谱（液）吸附色谱（液-固吸附色谱）固吸附色谱）以固体吸附剂为固定
48、相，如硅胶、氧化铝等，较常以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。不同极性的一元或多元溶剂。2 2）分配色谱（液）分配色谱（液-液分配色谱）液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。学键将固定液结合在担体表面。3 3）离子交换色谱）离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机固定相为离子交换树脂，
49、流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。的交换能力的不同而得到分离。4 4）凝胶色谱（空间排阻色谱）凝胶色谱（空间排阻色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；硬质凝胶；五、电泳技术五、电泳技术五、电泳技术 电泳的概念电泳的概念：带电物质在电场中向相反电
50、极移动的现带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄国物理年俄国物理学家学家ReRessss进行了世界上第一次电泳实验进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技）。但电泳技术的广泛应用，则是在术的广泛应用，则是在19371937年用滤纸作为支持介质成年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物术发展很快，各种类型的电泳
