1、流式细胞技术及其在科研中的应用流式细胞技术及其在科研中的应用 哈尔滨医科大学附属二院检验科哈尔滨医科大学附属二院检验科 刘彦虹刘彦虹课程内容课程内容n第一部分第一部分 概要概要n第二部分第二部分 仪器构造及工作原理仪器构造及工作原理n第三部分第三部分 技术及方法技术及方法n第四部分第四部分 应用应用1.1 基本概念基本概念=流式细胞技术（流式细胞技术（Flow Cytometry,FCM）是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。参数、快速定量分析和分选的技术。(荧光显微镜技术的改荧光显微镜技术的改良良)
2、=流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometor,FCM）是一项集激光技术、）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。又称又称(Fluorecence activated cell sorter,FACS)FACSort FACSCalibur FACSVantage 1.2 技术特点技术特点 n单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制体液中的
3、细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。成单细胞悬液。n快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。1.2 技术特点技术特点n多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当当同时用多种分子探针同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行
4、多色荧光染色单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、使细胞亚群的识别、计数等更为准确。计数等更为准确。n定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如成分如DNADNA含量、抗原或受体表达量、含量、抗原或受体表达量、Ca2+Ca2+浓度等浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。均可进行单细胞水平的定性与定量分析。第二部分第二部分 仪器构造及工作原理仪器构造及工作原理2.1 仪器构造仪器构造1.流动室及液流流动室及液流驱动系统驱动系统2.激光光源及光激光光源及光
5、束形成系统束形成系统3.光学系统光学系统4.信号检测与存信号检测与存贮、显示、分贮、显示、分析系统析系统5.细胞分选系统细胞分选系统2.2 工作原理工作原理1.流动室流动室n仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。n流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为一个孔径为430180um长方形孔，供细胞长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心。单个流过，检测区在该孔的中心。n流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且包，使样品流不会脱
6、离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。而得到准确的细胞荧光信息。液流驱动系统液流驱动系统将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成
7、一个圆形的流速（即鞘微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。次通过流式细胞仪的检测区域。2.2 工作原理工作原理2.2 工作原理工作原理2.激光光源激光光源 目前目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为大多采用氩离子气体激光器，波长为488nm。激光是一种相干光源，它能提供单。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光光束聚焦后，可以在照射区
8、得到一个近似扁平光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平的椭圆形光斑，其厚度可达的椭圆形光斑，其厚度可达20m。当流动的。当流动的细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射和发射荧光。和发射荧光。2.2 工作原理工作原理3.光学系统光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测长的荧光信号送入到不同的电子探测器。器。2.2 工作原理工作原理4.信号检测信号检测（1 1）散射光信号散射光信号 前向角散射前向角散射(Forward Scat
9、ter,FSC)(Forward Scatter,FSC)侧向角散射侧向角散射(Side Scatter,SSC)(Side Scatter,SSC)（2 2）荧光信号荧光信号前向角散射光（前向角散射光（FSC）激光器激光器激光器激光器激光探测器激光探测器大颗粒大颗粒小颗粒小颗粒侧向角散射光（侧向角散射光（SSC）激光器激光器侧向散射光探测器侧向散射光探测器流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号荧光信号荧光信号FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCEmitted Fluorescence Intensity Binding SitesFITCFluoresc
10、ent IntensityNumber of Events流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号荧光信号荧光信号2.2 工作原理工作原理5.数据的存贮、显示与分析数据的存贮、显示与分析 FCM数据存贮的方式均采用列表排数据存贮的方式均采用列表排队方式。队方式。数据的显示通常有一维直方图、二数据的显示通常有一维直方图、二维点图等。维点图等。二维散点图二维散点图2.3 细胞分选原理细胞分选原理 当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电晶体产生机械晶体产生机械振动振动带动流动室以相同频率进行振动，使带动流动室以相同频率进行振动，使液流注断裂成一连
11、串均匀的液流注断裂成一连串均匀的液滴液滴，仅少量液滴含有细胞，仅少量液滴含有细胞，有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分选的细胞的特性参数时，选的细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被此类细胞在形成液滴时会被充电充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左的或向左的偏转偏转，落入指定的收集器
12、中，完成细胞分选的，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。目的。第三部分第三部分 技术要点技术要点3.1 荧光探针的选择荧光探针的选择常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料荧光染料 分子量分子量 激发波长激发波长(nm)发射波长发射波长(nm)颜色颜色 用途用途FITC 390 488 525 深蓝深蓝 免疫荧光免疫荧光PE 240000 488 575 橙色橙色 免疫荧光免疫荧光PerCP 35000 488 677 红色红色 免疫荧光免疫荧光PeCy5 224000 488 670 红色红色 免疫荧光免疫荧光PeCy7 224000 488 755 深红色深红色 免疫荧光免疫荧光P
13、I 488 620 橙红色橙红色 免疫荧光免疫荧光 APC 104000 633 670 红色红色 免疫荧光免疫荧光 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）FITC是一种最为常见的荧光探针，其分子量为是一种最为常见的荧光探针，其分子量为389Da，用，用488nm的激光激发后发射荧光的峰的激光激发后发射荧光的峰值在值在520nm附近，使用附近，使用53015 nm的带通滤光的带通滤光片可得到最佳的荧光检测信号。片可得到最佳的荧光检测信号。FL1探测器检测探测器检测FITC。藻红蛋白藻红蛋白 (p-phycoerythrin,PE)PE是在
14、红藻中所发现的一种可进行光合作用的是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，当使的蛋白，当使用用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用用58521nm的带通滤光片，双激光器的流式的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用细胞仪推荐使用57513nm的带通滤光片。的带通滤光片。FL2探测器检测探测器检测PE。多甲藻叶绿素蛋白多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）PerC
15、P是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，当被，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测探测器检测PerCP。3.1 荧光探针的选择荧光探针的选择 碘化丙啶碘化丙啶 （propidium iodide，PI）可选择性地嵌入核酸（可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双）的双螺旋碱基对中。在对螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除对细胞进行处理，以排除RNA对对DNA荧光定量精度的影响
16、。在荧光定量精度的影响。在488nm波波长激发下，长激发下，PI的发射光谱为的发射光谱为610-620nm。在在FL2探测器检测探测器检测。FL2探测器检测探测器检测PI。3.2 免疫荧光染色免疫荧光染色直接免疫荧光染色法直接免疫荧光染色法 多用于对细胞表面标志的染色分析。选用单克隆荧多用于对细胞表面标志的染色分析。选用单克隆荧光抗体是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一光抗体是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体，一个抗体针对一个抗原。特异性强，荧光标抗体，一个抗体针对一个抗原。特异性强，荧光标记干扰因素少，但需购买多种荧光标记单抗。记干扰因素少，但需购买多种荧光标记单抗。间接免疫荧光染
17、色法间接免疫荧光染色法 选用特异性单抗（一抗）与待测细胞结合后，再选用特异性单抗（一抗）与待测细胞结合后，再用荧光素标记的二抗（针对一抗的抗原特异性的）用荧光素标记的二抗（针对一抗的抗原特异性的）进行标记染色。适用于对一些新的未知抗原的检测，进行标记染色。适用于对一些新的未知抗原的检测，不需要多种荧光抗体。不需要多种荧光抗体。3.4 光谱重叠的补偿光谱重叠的补偿n由于细胞或微球携带两种或两种以上荧光素，由于细胞或微球携带两种或两种以上荧光素，受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应
18、的检测器检测，器检测，而不会检测到另一种荧光。而不会检测到另一种荧光。n由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，使使用了用了BP（带通）和（带通）和LP（长通）滤片后，（长通）滤片后，发射发射光谱范围仍有一定的重叠。克服这种误差最有光谱范围仍有一定的重叠。克服这种误差最有效的方法是使用荧光补偿，即从一个被检测的效的方法是使用荧光补偿，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。3.4 光谱重叠的补偿光谱重叠的补偿 设置补偿的基本步骤
19、设置补偿的基本步骤n（1）选择标准荧光微球或正常细胞。）选择标准荧光微球或正常细胞。n（2）调节光电倍增管（）调节光电倍增管（PMT）电压，使未染色）电压，使未染色 细胞或微球的荧光峰处于细胞或微球的荧光峰处于10道以内。道以内。n（3）画出被分析细胞或微球的门或区域。）画出被分析细胞或微球的门或区域。n（4）增加补偿设置，直至阳性和阴性细胞或）增加补偿设置，直至阳性和阴性细胞或 微球处于最合适的位置。微球处于最合适的位置。3.4 光谱重叠的补偿光谱重叠的补偿3.4 光谱重叠的补偿光谱重叠的补偿3.4 光谱重叠的补偿光谱重叠的补偿 设门（设门（gating）是流式细胞仪分析中的一）是流式细胞仪
20、分析中的一种重要技术，只有通过最佳的设门方式，种重要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。才能准确地获取和分析。“设门设门”是指在细胞分布图中，根据该图是指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。胞群。通过通过“设门设门”得到不同的得到不同的 区域区域（Region）。从而对其中的细胞进行单参）。从而对其中的细胞进行单参数或多参数分析。数或多参数分析。设门策略设门策略3.5 设门策略设门策略设门策略设门策略 对血液中淋巴细胞设门（对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型）分析其免疫表型设门策略设门策略（2）离线设门）
21、离线设门 又称为非实时设门（又称为非实时设门（non-real time gating），），是指在流式细胞仪已获取数据后，通过计算机软件是指在流式细胞仪已获取数据后，通过计算机软件将数据调出，设定不同的散射光和（或）荧光信号将数据调出，设定不同的散射光和（或）荧光信号范围进行数据分析的设门方式。适合于一些需要多范围进行数据分析的设门方式。适合于一些需要多重设门并进行较为复杂分析的数据，尤其是对于一重设门并进行较为复杂分析的数据，尤其是对于一些荧光染色强度不定的样本，可以采用较大范围的些荧光染色强度不定的样本，可以采用较大范围的散射光阈值设门，获取所有信号并储存在计算机硬散射光阈值设门，获取所
22、有信号并储存在计算机硬盘等介质中，再进行离线设门分析，可以更好地保盘等介质中，再进行离线设门分析，可以更好地保持数据的完整性。持数据的完整性。设门策略设门策略白细胞和血小板的光散射设门白细胞和血小板的光散射设门设门策略设门策略FL2-W/FL2-A设门排除双连体细胞对设门排除双连体细胞对G2/M期细胞比例的影响期细胞比例的影响3.5 设门策略设门策略检测范围检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的核的特异性抗
23、原特异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体第四部分第四部分 应应 用用4.1 免疫表型分析免疫表型分析n用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，检测用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，检测细胞上的特异性抗原分子，称为免疫表型分析。细胞上的特异性抗原分子，称为免疫表型分析。可同时鉴别单个细胞上的多种抗原。可同时鉴别单个细胞上的多种抗原。n国际人类白细胞抗原协作组（国际人类白细胞抗原协作组（HLDA）将细胞表）将细胞表面抗原统一编号，用分化群（面抗原统一编号，用分化群（cluster of differentiation,
24、CD）命名，目前已达）命名，目前已达247种。种。CD分子是细胞分子是细胞(白细胞、红细胞、血小板及血管白细胞、红细胞、血小板及血管内皮细胞等内皮细胞等)在分化成为不同谱系、不同阶段细胞在分化成为不同谱系、不同阶段细胞以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的细胞以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的细胞表面标记。表面标记。4.1.1 样品制备样品制备n血液或骨髓血液或骨髓 采集使用采集使用EDTA-K2或或EDTA-K3抗凝，抗凝抗凝，抗凝剂终浓度为剂终浓度为1.52mg/ml。标本采集后室。标本采集后室温保存，温保存，6h内处理。内处理。由于标本已经属于单细胞悬液，不需特殊处由于标本已经属于单
25、细胞悬液，不需特殊处理。但一般分析白细胞时需要用红细胞裂解理。但一般分析白细胞时需要用红细胞裂解液去除红细胞，或用特殊方法分离淋巴细胞液去除红细胞，或用特殊方法分离淋巴细胞或其他白细胞。或其他白细胞。4.1.1 样品制备样品制备n体液和各种灌洗液体液和各种灌洗液 新鲜采集的标本，新鲜采集的标本，10001500r/min离心离心5min，弃去上清取细胞沉淀，用含，弃去上清取细胞沉淀，用含0.1牛血牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤）洗涤12次，次，经经50m的尼龙网过滤后悬浮在的尼龙网过滤后悬浮在0.51ml PBS中待用，一般细胞浓度为（中待用，一般细胞浓度为（
26、25）106/ml，当细胞数不足时可增加标本量进，当细胞数不足时可增加标本量进行浓缩。行浓缩。4.1.1 样品制备样品制备n各种组织细胞各种组织细胞 由于是进行免疫表型分析，应使细胞表面抗原在处由于是进行免疫表型分析，应使细胞表面抗原在处理过程中保持其抗原活性，并且不发生丢失。因此，理过程中保持其抗原活性，并且不发生丢失。因此，不宜选用甲醛、乙醇等固定组织，不宜用酶、表面活不宜选用甲醛、乙醇等固定组织，不宜用酶、表面活性剂等处理细胞。性剂等处理细胞。手工剪切法手工剪切法单细胞仪制备法单细胞仪制备法 匀浆匀浆50um尼龙网过滤后，用含尼龙网过滤后，用含0.1%BSA的的PBS 10002000r
27、/min 离心离心5min，洗涤，洗涤2次，次，悬浮备用。悬浮备用。4.1.2 抗体选择抗体选择n根据信噪比选择抗体的滴度：根据信噪比选择抗体的滴度：特异性荧光信号特异性荧光信号与非特异性结合噪音（同型对照）的比值越大，与非特异性结合噪音（同型对照）的比值越大，表明阳性与对照荧光峰分离越好，可确定为最表明阳性与对照荧光峰分离越好，可确定为最佳抗体滴度。佳抗体滴度。n抗体组合的选择：抗体组合的选择：多种荧光素标记的单克隆抗多种荧光素标记的单克隆抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应用的结果进行比较，无差别结果时才可组合应用的结果进行比较，无差别结
28、果时才可组合使用。组合使用。组合应用时，注意抗体的稀释度。单独使用最组合应用时，注意抗体的稀释度。单独使用最佳用量为佳用量为20ul，而如，而如3种组合时，总体积增至种组合时，总体积增至60ul，每种抗体被稀释，不再是最佳用量。，每种抗体被稀释，不再是最佳用量。4.1.3 免疫荧光染色免疫荧光染色n直接免疫荧光染色法：直接免疫荧光染色法：单色免疫荧光染色法单色免疫荧光染色法 多色免疫荧光染色法多色免疫荧光染色法n间接免疫荧光染色法：间接免疫荧光染色法：单色免疫荧光染色法单色免疫荧光染色法4.1.4 荧光染色对照的设置荧光染色对照的设置n阳性对照阳性对照 是指用已知表达某种抗原的细胞作为样本检测
29、，是指用已知表达某种抗原的细胞作为样本检测，应出现阳性结果的对照实验。是检查已知阳性标应出现阳性结果的对照实验。是检查已知阳性标本能否用所测条件与方法确定为阳性，否则可能本能否用所测条件与方法确定为阳性，否则可能是单克隆抗体的质量与浓度、荧光染色条件、仪是单克隆抗体的质量与浓度、荧光染色条件、仪器状况等存在问题。阳性对照达不到要求时不能器状况等存在问题。阳性对照达不到要求时不能进行实验。进行实验。n阴性对照阴性对照 是指用已知不表达某种抗原的细胞作为是指用已知不表达某种抗原的细胞作为样本检测，应出现阴性结果的对照实验。样本检测，应出现阴性结果的对照实验。阴性对照试验可以避免单克隆抗体的纯阴性对
30、照试验可以避免单克隆抗体的纯度不够或特异性差等因素造成的假阳性度不够或特异性差等因素造成的假阳性结果。结果。4.1.4 荧光染色对照的设置荧光染色对照的设置n同型对照同型对照 是指与单克隆抗体相同的、未免疫小鼠的免疫球是指与单克隆抗体相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光素，如：也应标记荧光素，如：IgG1 FITC、IgG2a PE等。等。同型对照主要考虑了细胞的自发荧光、同型对照主要考虑了细胞的自发荧光、Fc受体介导受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，的抗体结合和非特异性抗体结合等影响
31、因素。此外，同型对照与单克隆抗体所标记的荧光色素、浓度、同型对照与单克隆抗体所标记的荧光色素、浓度、标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值（F/P比比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与单克隆抗体不相胞的界标有重要意义，切忌使用与单克隆抗体不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备的产品。艺或方法制备的产品。4.1.4 荧光染色对照的设置荧光染色对照的设置4.1.6标本的固定与保存标本的固定与保存n 固定用于延长检测
32、时间。固定用于延长检测时间。n荧光抗体与细胞抗原结合后，一些低亲和力的荧光抗体与细胞抗原结合后，一些低亲和力的抗体在洗涤过程中可能与抗原分离，或不能及抗体在洗涤过程中可能与抗原分离，或不能及时检测，可导致假阴性或阳性减弱。时检测，可导致假阴性或阳性减弱。n终浓度为终浓度为1%多聚甲醛，固定多聚甲醛，固定30分钟。分钟。n在荧光染色之后进行。在荧光染色之后进行。24小时之内检测。最长小时之内检测。最长可达可达10天。天。4.1.7 免疫表型分析的影响因素免疫表型分析的影响因素n抗体的用量：抗体的用量：使用抗体浓度使用抗体浓度3g/ml时，表明抗体的亲时，表明抗体的亲和力或特异性低，最好不用。和力
33、或特异性低，最好不用。最佳浓度一般为最佳浓度一般为0.011 g/ml，相当于每个测试，相当于每个测试10100ng。n非特异性结合（非特异性结合（NSB）：）：是指非抗原抗体的结合。是指非抗原抗体的结合。Fc受受体结合抗体是导致其重要因素。任何细胞上只要存在未结体结合抗体是导致其重要因素。任何细胞上只要存在未结合的合的Fc受体，都可能有受体，都可能有NSB。采用高浓度的纯化鼠。采用高浓度的纯化鼠IgG可可用于阻断用于阻断Fc受体的受体的NSB。免疫球蛋白聚集可增加。免疫球蛋白聚集可增加NSB。由于冰冻、复溶和冻干处理，抗体均可出现聚集。对于新由于冰冻、复溶和冻干处理，抗体均可出现聚集。对于新
34、近购买的抗体，可通过高速离心去除聚集。近购买的抗体，可通过高速离心去除聚集。n抗原抗体反应温度：抗原抗体反应温度：一般在室温条件下进行。一般在室温条件下进行。n死细胞：死细胞：可增加抗体的非特异结合。因此，标本采集后应可增加抗体的非特异结合。因此，标本采集后应尽快进行荧光染色，固定后的保存时间可相对较长。此外，尽快进行荧光染色，固定后的保存时间可相对较长。此外，也可在标本制备前计数死细胞的百分率。也可在标本制备前计数死细胞的百分率。4.2 细胞周期与细胞周期与DNA倍体分析倍体分析n在生物细胞核中，在生物细胞核中，DNA含量并非恒定，随含量并非恒定，随细胞增殖周期时相不同而发生变化。细胞增殖周
35、期时相不同而发生变化。n整个细胞周期从整个细胞周期从DNA含量变化可以描述为含量变化可以描述为G0/G1、S、G2/M期三个细胞峰。期三个细胞峰。nG0/G1期细胞的期细胞的DNA含量相同，均为二含量相同，均为二倍体倍体DNA含量。含量。nG2/M期细胞的期细胞的DNA含量均为四倍体含量均为四倍体DNA含量。含量。4.2 细胞周期与细胞周期与DNA倍体分析倍体分析FCM分析的基本方法分析的基本方法n荧光染料（如荧光染料（如PI）与细胞）与细胞DNA分子特异结合，分子特异结合，而且有一定的量效关系，即而且有一定的量效关系，即DNA含量的多少与荧含量的多少与荧光染料结合量成正比，荧光强度与荧光直方
36、图的光染料结合量成正比，荧光强度与荧光直方图的通道数成正比。通道数成正比。n在流式细胞分析在流式细胞分析DNA中，只有在染色体数目变化中，只有在染色体数目变化引起引起DNA含量与正常细胞有差异时，才可能有含量与正常细胞有差异时，才可能有DNA异倍体检出。在异倍体检出。在DNA含量未见异常并不能除含量未见异常并不能除外染色体异常的存在。外染色体异常的存在。细胞群的细胞群的DNA含量在含量在FCM分析中一般以分析中一般以DNA指指数（数（DNA index，DI）表示其相对含量，一个）表示其相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其正常的二倍体细胞峰，其 G0/G1期细胞期细胞DNA含量为含量为2C，D
37、I值值1.0。DI=样本样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数期细胞峰平均荧光道数/正常正常二倍体标准细胞二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数期细胞峰平均荧光道数4.2.1 DNA倍体的判定标准倍体的判定标准倍体（倍体（ploidy）原指染色体数目。）原指染色体数目。流式细胞分析中用来描述总的流式细胞分析中用来描述总的 DNA总量。总量。根据根据DI判定判定DNA倍体。倍体。DI=1.00.1（0.901.10）为二倍体）为二倍体 DI=1.00.15（0.851.15）为近二倍体）为近二倍体 DI=2.00.1（1.902.10）为四倍体）为四倍体 DI2.10为多倍体为多倍体 其余其余
38、DI值均为非整倍体值均为非整倍体1.单细胞悬液制备单细胞悬液制备 n 新鲜或新鲜冰冻标本：新鲜或新鲜冰冻标本：白血病标本、穿刺液很容白血病标本、穿刺液很容易获得单细胞悬液。实体肿瘤可在含去污剂的缓冲易获得单细胞悬液。实体肿瘤可在含去污剂的缓冲液中手工机械处理，细胞核可释放至悬液中。液中手工机械处理，细胞核可释放至悬液中。n新鲜固定的标本：新鲜固定的标本：标本切成标本切成12mm2的小块，在的小块，在含胃蛋白酶的含胃蛋白酶的0.1mol/L HCl液中孵育或用胰蛋白液中孵育或用胰蛋白酶处理，使其释放细胞核。酶处理，使其释放细胞核。n甲醛固定、石蜡包埋的标本：甲醛固定、石蜡包埋的标本：从包埋组织上
39、切片从包埋组织上切片至少至少50m厚，太薄的切片会含有太多切碎的核，厚，太薄的切片会含有太多切碎的核，从而增加从而增加DNA直方图的碎片干扰。组织切片被脱蜡、直方图的碎片干扰。组织切片被脱蜡、经过乙醇处理并水化后，用蛋白水解酶处理，使其经过乙醇处理并水化后，用蛋白水解酶处理，使其释放细胞核。释放细胞核。2 固定固定 n采用采用70%预冷乙醇预冷乙醇(04C)。n运送标本时应保证样本完全浸没在固定剂中。运送标本时应保证样本完全浸没在固定剂中。n由于由于PI不能通过活细胞进入胞内染色，因此要用不能通过活细胞进入胞内染色，因此要用乙醇将细胞膜打孔，把染料引入胞内并将细胞固乙醇将细胞膜打孔，把染料引入
40、胞内并将细胞固定。定。n若同时使用抗体鉴别细胞应选择对抗原无损的固若同时使用抗体鉴别细胞应选择对抗原无损的固定剂，并在抗体标记之后进行固定。定剂，并在抗体标记之后进行固定。4.2.2 样本制备样本制备4.2.2 样本制备样本制备3染色染色 n应用应用PI染色液。染料要足够，以保证饱染色液。染料要足够，以保证饱和结合。和结合。PI的推荐浓度至少为的推荐浓度至少为20ug/106细胞。细胞。n由于由于PI也与双链也与双链RNA结合，分析前样本结合，分析前样本应用应用RNase处理。处理。n细胞用细胞用50um尼龙网过滤后上机检测。尼龙网过滤后上机检测。4细胞浓度细胞浓度 单细胞或细胞核的最终浓度应
41、为单细胞或细胞核的最终浓度应为 106/ml。浓度太低时，。浓度太低时，流式细胞仪检测室样本的流速不得不提高，从而使流式细胞仪检测室样本的流速不得不提高，从而使CV增大。如果细胞或细胞核浓度太高，则可能导致染料增大。如果细胞或细胞核浓度太高，则可能导致染料的相对不足，影响的相对不足，影响CV和检测结果。和检测结果。流式细胞分析的高分辨率或精密度可检出不同细胞群流式细胞分析的高分辨率或精密度可检出不同细胞群体体DNA含量的细微差别，通常的检测分辨率或精密度含量的细微差别，通常的检测分辨率或精密度由由DNA含量直方图中含量直方图中G0/G1峰的变异系数（峰的变异系数（CV）来反）来反映。映。CV越
42、小，质量越好。新鲜标本越小，质量越好。新鲜标本CV常常3%，石蜡，石蜡包埋标本的包埋标本的CV5%。4.2.2 样本制备样本制备5样本制备的质量样本制备的质量 制备完成后的标本可用光学显微镜检查制备完成后的标本可用光学显微镜检查其质量，注意观察：其质量，注意观察：样本中细胞或细胞核浓度样本中细胞或细胞核浓度 细胞聚集或过多的碎片细胞聚集或过多的碎片 大多数核有肿瘤样的外观大多数核有肿瘤样的外观 分离的核上没有参与细胞质附着分离的核上没有参与细胞质附着4.2.3 样本分析样本分析4.3 细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)是指有核细胞在是指有核细胞在一定条件下，通过内源
43、性一定条件下，通过内源性DNA内切酶的内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。激活而发生的细胞死亡过程。4.3.1 细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的生化特征nCaspase 蛋白酶和丝氨酸蛋白酶激活：蛋白酶和丝氨酸蛋白酶激活：n核酸内切酶激活：核酸内切酶激活：DNA电泳出现电泳出现“梯状梯状”改变。改变。n线粒体通透性增高：线粒体膜电位下降。线粒体通透性增高：线粒体膜电位下降。n胞质胞质Ca2+和和pH变化：细胞内变化：细胞内Ca2+升高，升高，pH降低。降低。4.3.1 FCM检测凋亡的方法检测凋亡的方法n凋亡细胞形态学特征的检测凋亡细胞形态学特征的检测n细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检
44、测nCaspase的检测的检测n线粒体功能的检测线粒体功能的检测n细胞内钙离子和细胞内钙离子和pH的检测的检测n溶酶体质子泵变化的检测溶酶体质子泵变化的检测nDNA断裂的检测断裂的检测n细胞细胞DNA含量的检测含量的检测n蛋白及蛋白及RNA含量的检测含量的检测n膜磷脂重新分布的检测膜磷脂重新分布的检测n凋亡小体的检测凋亡小体的检测n凋亡相关蛋白的检测凋亡相关蛋白的检测4.3.1.1 PI单染色法单染色法n原理原理 由于凋亡细胞由于凋亡细胞DNA被降解后，小分子被降解后，小分子DNA可通过细可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成了
45、凋亡细胞的，造成了凋亡细胞的DNA含量非倍体性下降，含量非倍体性下降，由此可导致对由此可导致对DNA染料的着色能力下降，表现为在染料的着色能力下降，表现为在G1期峰前出现亚二倍体峰，即亚期峰前出现亚二倍体峰，即亚G1期峰。常用的期峰。常用的DNA染料为染料为PI。由于。由于PI不能通过活细胞进入胞内染不能通过活细胞进入胞内染色，因此具体操作时要用乙醇将细胞膜打孔，把染色，因此具体操作时要用乙醇将细胞膜打孔，把染料引入胞内并将细胞固定。由于料引入胞内并将细胞固定。由于PI同时与细胞内同时与细胞内RNA和和DNA结合，因此需用结合，因此需用RNA酶将酶将RNA降解，方降解，方可检测细胞可检测细胞D
46、NA含量的变化。含量的变化。4.3.1.2 Annexin V/PI双染色法双染色法n原理原理 在凋亡细胞的形态学改变中，胞质膜的改变是最早出现的。在凋亡细胞的形态学改变中，胞质膜的改变是最早出现的。在凋亡的早期阶段，细胞内在凋亡的早期阶段，细胞内Ca2+快速、持续升高，致使大量快速、持续升高，致使大量Ca2+激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞质膜激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞质膜磷脂不对称性丧失，导致膜内侧磷脂不对称性丧失，导致膜内侧PS从细胞膜内层暴露于外层，从细胞膜内层暴露于外层，从而可被从而可被PS特异的特异的Annexin V探针所标记。探针所标记。PS转移到
47、细胞转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。两种细膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞死亡方式间的差别是在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死在早期阶段细胞膜的完整性就被破坏了。由于胞坏死在早期阶段细胞膜的完整性就被破坏了。由于PI对细对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡是拒染的，而对膜完整性被破胞膜完整的活细胞和早期凋亡是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin V结合结合PI进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。由于正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上胞。由于正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin V，坏死和凋亡晚期细胞可被，坏死和凋亡晚期细胞可被PI染色，因此可将各染色，因此可将各群细胞明显地区分开。群细胞明显地区分开。
