1、Nucleic Acid HybridizationNucleic Acid Hybridization核酸杂交技术主主 要要 内内 容容 核酸探针核酸探针 核酸杂交概念及原理核酸杂交概念及原理 核酸杂交的分类核酸杂交的分类Southern blot Northern blotchipChIP on chip生物化学与分子生物学系一、核酸分子杂交的概念及原理一、核酸分子杂交的概念及原理核酸杂交核酸杂交:两个两个不同来源的不同来源的、含有、含有互补碱基序列互补碱基序列的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子稳定的双股分子的过程。的过程。核
2、酸经核酸经加热变性加热变性后，在低于变性温度后，在低于变性温度20-20-3030时，反应系统中加入的时，反应系统中加入的核酸探针核酸探针与与待测核酸样品中具有待测核酸样品中具有互补序列互补序列的单链的单链DNA或或RNA形成双链结构形成双链结构，通过检测，通过检测标记信号标记信号即可检即可检测特定的核酸片段。测特定的核酸片段。核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交技术原理二、核酸探针二、核酸探针 核酸探针核酸探针（nucleic probe）:带有可检带有可检测标记，能与特定序列的核酸片段互补配测标记，能与特定序列的核酸片段互补配对形成双链的一段核酸。对形成双链的一段核酸。核酸探针的质量（核酸探针
3、的质量（标标记效率记效率和和特异性特异性）是核）是核酸分子杂交成功的关键。酸分子杂交成功的关键。1.1.核酸探针的分类核酸探针的分类根据标记物的性质分：根据标记物的性质分：v 放射性标记放射性标记:3232P,P,3535S,S,125125I,I,3 3H H。v 非放射性标记非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧：化学发光标记、酶标记、荧光标记等光标记等敏感度高，半衰期短敏感度高，半衰期短（3232P 14.3P 14.3天，天，3535S 87.1S 87.1天，天，125125I 60I 60天，天，3 3H H 的半衰期长达的半衰期长达12.312.3年，但它所释放年，但它所释放放射
4、线能量太低，只能用于组织原位杂交），放射线能量太低，只能用于组织原位杂交），有辐射危害有辐射危害。根据探针中根据探针中核酸的性质核酸的性质分：分：DNA (包括包括cDNA)探针探针RNA探针探针(包括包括cRNA)寡核苷酸探针寡核苷酸探针肽核酸（肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）探针）探针(1)DNA探针（包括探针（包括cDNA探针）的优点：探针）的优点：这类探针多这类探针多克隆在质粒载体克隆在质粒载体中，易于扩增，中，易于扩增，取之不尽，制备方法简便。取之不尽，制备方法简便。DNA探针探针较稳定较稳定（相对（相对RNA而言）。而言）。DNA探针的探针的标记方法较成熟
5、标记方法较成熟，有多种方法，有多种方法可供选择，能用于可供选择，能用于同位素和非同位素标记同位素和非同位素标记。(2)RNA探针：主要是探针：主要是细胞细胞mRNA和和病毒病毒RNA探针。探针。vRNA探针和探针和cRNA探针的特点：探针的特点：杂交反应效率高、杂交反应效率高、易于降解、标记方法复杂易于降解、标记方法复杂。v用途：用途：用于检测用于检测DNA和和mRNA，以及研究基因表，以及研究基因表达中的转录。达中的转录。vcRNA探针探针：以双链：以双链DNA中与中与mRNA 序列相同的序列相同的一条链为模板转录得到的一条链为模板转录得到的RNA链，其序列与链，其序列与mRNA互补，也称为
6、反义互补，也称为反义RNA。采用化学合成的短链寡核苷酸探针采用化学合成的短链寡核苷酸探针,最常用最常用的寡核苷酸探针有的寡核苷酸探针有18-4018-40个碱基。个碱基。(3)寡核苷酸探针特点：特点：链短、序列复杂度低、分子量小链短、序列复杂度低、分子量小，与，与等量靶位点完全杂交的时间短。等量靶位点完全杂交的时间短。寡核苷酸探针可寡核苷酸探针可识别靶序列内识别靶序列内1 1个碱个碱基的变化基的变化。一次可大量合成寡核苷酸探针，使得一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉。这种探针价格低廉。2.探针设计的条件 被检基因结构清楚；有明确的基因产物;具备下列条件之一，就可以设计、制备具备下
7、列条件之一，就可以设计、制备特异性基因探针。特异性基因探针。3.3.核酸探针的常用标记方法核酸探针的常用标记方法 核酸探针的标记核酸探针的标记几乎总是先将几乎总是先将底物底物标标记相应的信号，然后记相应的信号，然后利用利用核酸合成核酸合成的方法的方法合成具有标记信号的合成具有标记信号的核苷酸链。核苷酸链。Pol.substrateprobe 切口平移法（切口平移法（nick translationnick translation）PCR PCR法法 DNA DNA快速末端标记快速末端标记 T4 T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA 5DNA 5末端末端 随机引物延伸随机引物延伸 放射性探
8、针的标记放射性探针的标记由由DNase和大肠和大肠杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNase：在双链在双链DNADNA上随机打开若上随机打开若干个单链切口，产干个单链切口，产生生3-OH3-OH端端大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶：53DNA53DNA聚聚合酶活性；合酶活性；5353核酸外切酶活性核酸外切酶活性(1)(1)切口平移标记法切口平移标记法（nick translation）随机引物随机引物：含有各种可：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。片段的混合物。4 46 6=40964096DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段：53DNA聚合酶活
9、性聚合酶活性 弱弱35外切核酸酶活性外切核酸酶活性无无53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（2 2）随机引物法）随机引物法（random priming）产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷酸。个核苷酸。Klenow片段没有片段没有5 3外切酶活性外切酶活性,反应稳定反应稳定,可以获可以获得大量的有效探针。得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模模板也可进行反应。板也可进行反应。生物化学与分子生物学系(3)(3)末端标记法末端标记法用途：制备高比活性探针(1010 cpm/g DNA);DNA末端修饰-缺失 外切酶活性
10、外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTPT4 DNA聚合酶聚合酶53聚合酶活性，聚合酶活性，1500 nt/min,为为pol I的的两倍两倍 35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA,其切除速度分别为其切除速度分别为40和和 4000nt/min乙醇沉淀法乙醇沉淀法凝胶过滤法凝胶过滤法（G-50 Spin column）探针纯化非放射性探针的标记非放射性探针的标记生物素标记核酸生物素标记核酸 酶标核酸酶标核酸半抗原标记核酸半抗原标记核酸 根据标记物的性质分：根据标记物的性质分：根据标记方法分：根据标记方法分：酶促反应标记法酶促反应标记法化学修饰标
11、记法化学修饰标记法 以以生物素化的脱氧核生物素化的脱氧核苷三磷酸苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷等代替相应脱氧核苷三磷酸，经酸，经DNA聚合酶作用掺聚合酶作用掺入新合成的入新合成的DNA。可以采。可以采用切口平移法和随机引物用切口平移法和随机引物延伸法进行。延伸法进行。生物素标记生物素标记酶促法酶促法基本原理：基本原理：光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活化为芳香基硝基苯化为芳香基硝基苯
12、，很易与腺嘌呤，很易与腺嘌呤N7 位氨基特异结合，位氨基特异结合，形成生物素化的核酸探针形成生物素化的核酸探针。生物素标记生物素标记化学修饰法（光敏法）化学修饰法（光敏法）基本原理：基本原理：酶标法酶标法 使用交联剂戊二醛将使用交联剂戊二醛将辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸）或碱性磷酸酶（酶（AP）标记在标记在DNA上，再通过酶促反应使其无色底物转变成上，再通过酶促反应使其无色底物转变成有颜色的产物有颜色的产物酶标法酶标法碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴溴-4氯氯-3吲哚磷酸盐吲哚磷酸盐-4-甲基胺蓝）甲基胺蓝）NBT（四氮唑蓝）（四氮唑蓝）酶标法酶标法辣根过氧
13、化物酶辣根过氧化物酶(HRP)：DAB（二氨基联苯胺）（二氨基联苯胺）棕色棕色TMB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺）蓝色蓝色 地高辛地高辛（Digoxigenin，DIG）即异羟基洋地黄毒甙，是一）即异羟基洋地黄毒甙，是一种类固醇半抗原，来源于植物（种类固醇半抗原，来源于植物（Digitalis purouren 和和Digitalis lanta）的花和叶中。）的花和叶中。DIG 可以与可以与dUTP反应形成反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合成的通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。抗体来实施检测。地高辛标记地高辛标记基
14、本原理：基本原理：三、核酸分子杂交的类型三、核酸分子杂交的类型 核酸分子杂交可按作用环境大致核酸分子杂交可按作用环境大致分为分为固相杂交固相杂交和和液相杂交液相杂交两种类型。两种类型。以上两种类型根据具体的杂交方以上两种类型根据具体的杂交方式，反应条件等又可以分成多种类型。式，反应条件等又可以分成多种类型。概念：概念：参加反应的一条核酸链被预先固定参加反应的一条核酸链被预先固定在在固相支持物固相支持物上，另一条上，另一条核酸链则核酸链则游离在溶液中游离在溶液中进行的杂交反应。进行的杂交反应。固相支持物：固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜、乳胶颗粒、磁珠、膜、乳胶
15、颗粒、磁珠、微孔板，芯片等微孔板，芯片等1.1.固相杂交固相杂交u分类：分类：杂交后，游离片段杂交后，游离片段容易经漂洗除去容易经漂洗除去；菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、SouthernSouthern印迹杂交、印迹杂交、NorthernNorthern印迹杂交、印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。组织原位杂交和夹心杂交等。u 固相杂交的特点：固相杂交的特点：支持物上留下的支持物上留下的杂交物容易检测杂交物容易检测；能防止能防止靶靶DNA自我复性自我复性。因此，该法最为常用。因此，该法最为常用。常用杂交方法介绍基本原理：基本原理：是是1975年由英国人年由
16、英国人Southern创建，在遗传病诊断、创建，在遗传病诊断、DNA图谱分析及图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。产物分析等方面有重要价值。DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离，然后将离，然后将DNA从凝胶中转印至滤膜上从凝胶中转印至滤膜上与探针杂交。与探针杂交。通过检测与探针互补通过检测与探针互补DNA条带来确定在众多酶解产物中含条带来确定在众多酶解产物中含某一特定序列的某一特定序列的DNA片段的位置和大小。片段的位置和大小。（一）、（一）、Southern印迹印迹（Southern blot）提取提取DNA限制性内切酶消化限
17、制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影预杂交预杂交tissueSDSPro KPhenolCHCl3ETOH pptSpin1、提取基因组DNA SDS使组织蛋白与使组织蛋白与DNA分子分离分子分离 蛋白酶蛋白酶K消化分解蛋白质消化分解蛋白质 酚、氯仿酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，异戊醇抽提除去蛋白质，乙醇沉淀纯化乙醇沉淀纯化DNA 加入加入EDTA能抑制能抑制DNase的活性，的活性，RNase除去除去RNA，此法可获得，此法可获得100200kb的的DNA片段。片段。2、限制性
18、核酸内切酶切断DNA基因组基因组DNA很大，需要将其切割成片段后用于杂交分析。很大，需要将其切割成片段后用于杂交分析。一般选择一种限制酶来切割一般选择一种限制酶来切割DNA分子。分子。有时可采用有时可采用部分和充分消化相结合部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交的方法获得一些具有交叉顺序的叉顺序的DNA片段。片段。消化消化DNA后，加入后，加入EDTA，65加热灭活内切酶。加热灭活内切酶。样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品。样品。3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性 先将先将DNA样品样品(含不同大小的含不同大小的DNA片段片
19、段)先按片断长短进行先按片断长短进行分离，然后进行杂交分离，然后进行杂交。琼脂糖凝胶电泳可分辨琼脂糖凝胶电泳可分辨7080000bp的的DNA片段。片段。DNA样样品与上样缓冲液混匀，上样。品与上样缓冲液混匀，上样。DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构 为了有效地实现为了有效地实现DNA片段转移，最好将片段转移，最好将DNA片段控制在片段控制在2kb以下。若以下。若DNA片段大于片段大于15kb，将电泳凝胶浸泡在，将电泳凝胶浸泡在0.25M 的的HCl溶液约溶液约10分钟作脱嘌呤处理，打断分钟作脱嘌呤处理，打断DNA片段。片段。将电泳凝胶移至碱性溶
20、液中浸泡，使将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性，再用中性变性，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4、将DNA转移至尼龙膜将凝胶中单链将凝胶中单链DNA片段片段转移到固相支持物转移到固相支持物上。注意保持各上。注意保持各DNA片段的相对位置不变片段的相对位置不变。用于转膜的固相支持物有多种，包括用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（膜）、尼龙（Nylon）膜）膜、PVDF膜、化学活化膜和滤纸等膜、化学活化膜和滤纸等。a处理膜时应戴手套并用平头镊子操处理膜时应戴手套并用平头镊子操作，作，膜切角膜切角。b去离子水完全润湿
21、膜，去离子水完全润湿膜，浸入变性转浸入变性转移液至少移液至少5分钟。分钟。c.制作转印制作转印“三明治三明治”，用，用玻棒赶出玻棒赶出其其间滞留的间滞留的气泡气泡。d.DNA转移持续进行转移持续进行8-24小时。小时。重物重物玻璃板玻璃板吸水纸吸水纸滤纸滤纸NC滤膜滤膜凝胶凝胶滤纸滤纸支持物支持物转移缓冲液转移缓冲液n毛细管虹吸转移法尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极电极+滤纸滤纸电极电极n电转移法n真空转移法5 5膜的洗涤、固定膜的洗涤、固定1）膜置于）膜置于0.5M TrisCl（pH7.2）、）、1M NaCl中，室中，室温浸泡温浸泡15分钟，分钟，
22、除去粘附的琼脂糖除去粘附的琼脂糖。2）将膜平铺于一张纸巾上，）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥室温干燥30分钟分钟以上。以上。3）DNA固定：在真空烤箱或普通固定：在真空烤箱或普通烘箱烘箱内于内于80烘烤烘烤0.52小时。小时。6.6.探针标记探针标记和预杂交预杂交 预杂交：预杂交：将膜上所有能与将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。结合的位点全部封闭。预杂交液预杂交液：含有鲑鱼精子含有鲑鱼精子DNA（该（该DNA与哺乳动物的同源性与哺乳动物的同源性极低，不会与极低，不会与DNA探针杂交）、牛血清等。探针杂交）、牛血清等。southern印迹杂交炉印迹杂交炉 用用杂交袋杂交袋封装。封装。每平方
23、厘米每平方厘米NCNC膜需膜需预杂交液预杂交液0.2ml0.2ml。鲑鱼精鲑鱼精DNADNA置沸水浴中置沸水浴中10min10min，迅速置冰，迅速置冰上冷却上冷却1-2min1-2min，使使DNADNA变性，保持单链变性，保持单链。变性的鲑鱼精变性的鲑鱼精DNADNA加至加至终浓度终浓度200g/ml200g/ml。4242水浴中温育水浴中温育4h4h。7 7、杂交、洗膜、杂交、洗膜加入标记的探针加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链（预先热变性成为单链DNA分子）。分子）。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。然后在较高
24、温度下用盐溶液洗膜。然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高。离子强度越低，温度越高。（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将（二）在暗室内，将2张张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，合上暗盒。固定，合上暗盒。（三）将暗盒置（三）将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。天）。8 8、放射性自显影检测、放射性自显影检测（四）从冰箱中取出暗盒，置室温（四）从冰箱
25、中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲，使其温度上升至室温，然后冲洗洗X光底片。光底片。Southern blot 是研究是研究DNA图谱的基本技术，图谱的基本技术，在在遗传诊断遗传诊断、DNA图谱分析图谱分析及及PCR产物分析产物分析等方等方面有重要价值。面有重要价值。Southern blot 的应用血迹中的血迹中的DNAnDNA指纹分析指纹分析基本原理：将基本原理：将RNARNA标本标本经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至硝经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至硝酸纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。酸纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。（二）、（二）、Northern印迹印迹（norther
26、n blot northern blot）注意：注意：A A 甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNARNA变性变性,不不能用能用NaOHNaOH （会使（会使RNARNA水解）。水解）。B B 样品样品RNARNA变性后进行变性后进行电泳分离电泳分离。C C 转印后，烘烤固定前转印后，烘烤固定前不能用低盐缓冲液洗不能用低盐缓冲液洗 D D 胶中不能加胶中不能加EBEB（影响（影响RNARNA与硝酸纤维素膜的与硝酸纤维素膜的结合）结合）RNA RNA提取提取甲醛变性电泳甲醛变性电泳 印迹转移印迹转移预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针）洗膜洗膜放射自显影或化学发光放射
27、自显影或化学发光甲醛变性电泳：甲醛变性电泳：RNA变性，消除RNA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶。在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。四、核酸分子杂交实验因素的优化v探针的类型、标记方法和浓度探针的类型、标记方法和浓度v杂交反应温度杂交反应温度v杂交反应时间杂交反应时间v杂交促进剂杂交促进剂根据不同的杂交实验要求，选择不同的探针：1.探针的选择检测检测单个碱基改变单个碱基改变：首选用：首选用寡核苷酸探针寡核苷酸探针；检测检测单链靶序列单链靶序列：选用与其互补的：选用与其互补的DNADNA单链探针单链探针（M13M13噬菌体）或噬菌
28、体）或RNARNA探针，寡核苷酸探针探针，寡核苷酸探针也可；也可；长的长的双链双链DNADNA探针探针特异性较强，适宜检测复杂的特异性较强，适宜检测复杂的靶核酸序列和病原体靶核酸序列和病原体 ，但不适宜于组织原位杂，但不适宜于组织原位杂交交 视个人的习惯和可利用条件而定，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。n通常，放射性探针比非放射性探针灵敏度高；n在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法；n在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶检测系统。2.探针的标记方法3.3.探针的浓度u探针浓度增加，杂交率增加；u在较窄的范围内，探针浓度
29、增加，敏感性增加。膜杂交中，放射性探针与非放射性探针的用膜杂交中，放射性探针与非放射性探针的用量分别为量分别为5-10ng/ml5-10ng/ml和和25-1000ng/ml25-1000ng/ml；原位杂交中，用量均为原位杂交中，用量均为0.5-5.0g/ml0.5-5.0g/ml。4.杂交温度杂交最重要的因素之一是选择恰当的杂交温度。杂交最重要的因素之一是选择恰当的杂交温度。温度温度 ：温度温度 ：杂交特异性杂交特异性 ，杂交率杂交率 杂交特异性杂交特异性杂交率杂交率 ，如两个同源性在如两个同源性在50%50%左右或更低些的左右或更低些的DNADNA，调整杂交，调整杂交温度可使它们之间的杂
30、交率变化温度可使它们之间的杂交率变化1010倍，因此在实验前必倍，因此在实验前必须首先确定须首先确定杂交温度杂交温度。最适复性温度：最适复性温度：T Toror=T=Tm m 25 25苛刻复性温度：苛刻复性温度：T Ts s =T=Tm m (10 (10或或15)15)非苛刻复性温度：非苛刻复性温度：T Tnsns=T=Tm m (30 (30或或35)35)通常有三种温度可供参考，即通常有三种温度可供参考，即最适复性温度最适复性温度、苛刻复性温度苛刻复性温度及及非苛刻复性温度非苛刻复性温度。5.5.杂交反应时间杂交反应时间 在其他条件都得到满足的情况下，杂交的成在其他条件都得到满足的情况
31、下，杂交的成败取决于败取决于保温时间保温时间。时间短了，杂交反应不完。时间短了，杂交反应不完成；时间长了会引起非特异结合增多。成；时间长了会引起非特异结合增多。常用促进剂：惰性多聚体可促进惰性多聚体可促进250nt250nt以上的探针以上的探针的杂交率。的杂交率。硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖，平均，平均MWMW为为500000500000；聚乙二醇聚乙二醇（PEG），），MW MW 为为6000-80006000-8000、粘度低、粘度低、价廉，但它不能完全取代硫酸葡聚糖；价廉，但它不能完全取代硫酸葡聚糖；聚丙烯酸聚丙烯酸，用其钠盐，用其钠盐，MWMW约约9000090000，浓度，浓度2-4%2-4
32、%。价廉，粘度低。价廉，粘度低。6.杂交促进剂（三）、（三）、DNA芯片（芯片（DNA chip）n1995年斯坦福大学年斯坦福大学Schena M和和 Brown PO等发表第等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵（点阵（microarrays）技术）技术DNADNA芯片的浪潮。芯片的浪潮。nDNA芯片是将各种芯片是将各种“探针探针”固定在基质上，用于检固定在基质上，用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。变化。基因芯片基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列（技
33、术是指通过微阵列（Microarray）技术将高密度）技术将高密度DNA片段通过高速机器片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。的基因表达及监测等方面研究的技术。1、概念基因芯片工作流程基因芯片工作流程（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特异性地富集目的蛋白结合的特
34、异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；于芯片分析；寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与白质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。四、染色质免疫共沉淀四、染色质免疫共沉淀-芯片芯片基本原理基本原理甲醛处理使细胞内蛋白质和甲醛处理使细胞内蛋白质和DNA交联交联 超声波打碎超声波打碎 特异性抗体免疫沉淀特异性抗体免疫沉淀目的目的DNA片段纯化、扩增片段纯化、扩增荧光标记和芯片检测荧光标记和芯片检测芯片数据分析芯片数据分析（3）研究范畴
35、）研究范畴主要集中在两个领域：主要集中在两个领域：第一，确定转录因子及其作用位点第一，确定转录因子及其作用位点 能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示基因组岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系甲基化和组蛋白修饰之间的联系
