1、第四章第四章 抗体制药抗体制药张忠山 第一节 概述 第二节 单克隆抗体及制备 第三节 基因工程抗体及制备 第四节 多功能抗体及制备 第五节 抗体工程 第六节 抗体诊断试剂 第七节 抗体治疗药物第一节 概述 1、免疫学发展经历 免疫学是一门既古老而又新兴的科学。免疫学的发展是人们在实践中不断探索、不断总结和不断创新的结果。一般认为免疫学的发展经历了四个时期即经验经验免疫学时期、经典免疫学时期、近代免疫学时期免疫学时期、经典免疫学时期、近代免疫学时期和现代免疫学时期。和现代免疫学时期。经验免疫学时期：早在公元 11 世纪，我国医学家在实践中创造性地发明了人痘苗，即用人工轻度感染的方法预防天花。在明
2、代隆庆年间（朱载垕，15671572），人痘苗已在我国广泛应用。至17世纪，人痘苗接种预防天花的方法引起邻国的注意，先后传入俄国、朝鲜、日本、土耳其、英国等地，进而使人痘苗预防天花的方法得以推广和验证。此即经验免疫学时期。它是人类认识机体免疫性的开端，为以后英国医生Jenner（琴纳）发明牛痘苗奠定了基础。该时期发现了免疫现象，对医学实为一项伟大贡献。经典免疫学时期：18世纪至20世纪中叶为经典免疫学时期。这一时期，人们对免疫功能的认识由人体现象的观察进入了科学实验时期。在此期间取得的重要成果包括：（1）牛痘苗的发明：患过牛痘的挤奶工不再患病（2）减毒活疫苗的发明：19世纪末，法国免疫学家巴斯
3、德（Pasteur）和德国细菌学家柯赫（Koch）在创立了细菌分离培养技术的基础上，通过系统地科学研究，利用物理、化学，以及生物学方法获得了减毒菌苗，并用于疾病的预防和治疗。Pasteur以高温培养法制备了炭疽疫苗，用狂犬病毒在兔体内经连续传代制备了狂犬病疫苗。这些减毒疫苗的发明不但为实验免疫学打下了基础，也为疫苗的发展开辟了新局面。（3）抗体的发现：1890年德国学者Behring（贝苓）和日本学者北里用白喉外毒素免疫动物时发现，在被免疫的动物血清中有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。将此免疫血清被动转移给正常动物，使后者获得了中和外毒素的能力。同年Behring又与北里将白喉抗毒素正式用
4、于白喉的治疗，开创了人工被动免疫疗法之先河。为此，Behring于1901年获得诺贝尔医学和生理学奖。后来，人们相继发现了凝集素、沉淀素等能与细菌或细胞特异性反应的物质，统称为抗体；而将能引起抗体产生的物质称为抗原，从而确立了抗原和抗体的概念。免疫抗原；反应抗原 近代免疫学时期：生物体的免疫反应性有了比较全面的认识，出现了全新的免疫学理论。包括迟发性超敏反应、免疫耐受的发现、细胞系选择学说的提出、免疫学技术的发展。现代免疫学时期：在这一时期，确认了淋巴细胞系在免疫反应中的地位，阐明了免疫球蛋白的分子结构与功能。免疫球蛋白相关概念相关概念 抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗体
5、的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。T淋巴细胞 B淋巴细胞2 2、抗体药物的发展、抗体药物的发展 1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。白喉杆菌白喉杆菌 1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白和丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。1975年：Khler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。1984年：人-鼠
6、嵌合抗体（30:70)1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。特殊化学基团喉类毒素：8个，流感病毒：40多个 抗原决定簇单克隆抗体单克隆抗体和多克隆抗和多克隆抗体的制备体的制备抗原脾B淋巴细胞融合融合淋巴细胞骨髓瘤细胞克隆1克隆2克隆3克隆4 3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用 用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以
7、下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大（10万以上），难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。解决办法：(1)降低单克隆抗体的免疫原性；(2)降低单克隆抗体的相对分子质量。第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备 1、抗原与动物免疫 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 3、筛选阳性克隆与克隆化 4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 5、单克隆抗体的大量制备 6、单克隆抗体的纯化1 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫（1）制备用于动物免疫的适当抗原。a、化学合成抗原，如精制的地高辛。b、多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至是极不纯的混合物，如部
8、分纯化的干扰素。c、通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时，情况较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原，经过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子上的单克隆抗体。（2）稳定的杂交瘤的获得 因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。BALB/c小鼠：1923年美国培育，1985年引进我国。Lou大鼠：1972年美国培育，1985年引进我国。（
9、3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8-12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1-3周，再追加免疫1-2次，可溶性抗原则按每只小鼠10-100g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2-4周，再用不加佐剂的原抗原追加免疫1-2次。体外免疫法：所需要的抗原量少，一般只需几个g，免疫期短，仅4-5天，干扰因素少，已成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液
10、，再加入适当抗原使其浓度达0.5-5 g/mL，在5%CO2、37下培养4-5天，再分离脾脏细胞，进行细胞融合。2 2、细胞融合与杂交瘤细胞的、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养选择性培养（1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（2107-3107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。（2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。（3）诱导剂PEG的影响：分子量及浓度越大，促融率越高，但其粘度和对细胞的毒性也随之增大。目前常用的PEG
11、的浓度为40%-50%，相对分子质量以4000为佳。为了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亚砜（DMSO）。但必须严格限制它们和细胞的接触时间，可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然后用新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞。细胞融合后可产生多种融合，脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞，以及未融合的细胞。（4）培养基的正确选择：常用的选择培养基为HAT培养基，它是次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。（5）选择性培养方法：细胞悬浮 96孔板 换液（HAT培养液）改用HT培养液 普通的RPMI1640完全培养液。从融合后8-9天就可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体
12、的阳性克隆。（6）饲养细胞：由于在最适的条件下大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。常用的检测方法有免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术等。1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10g/ml，4，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清
13、液（）（4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（）（4，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选（2）克隆化有限稀释法和软琼脂法 筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。一般融合后获得的 杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不
14、含HT的RPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，移入96孔板中继续培养。用这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定（1）杂交瘤细胞的鉴定 正常鼠的脾细胞染色体数为40，全部是端着丝粒染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色体数目的总和，在结构上除多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。
15、染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且比较分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。（2）抗体性状的鉴定 可用羊或兔抗Ig不同类和亚类的抗体，进行免疫扩散或ELISA法来鉴定。在单克隆抗体鉴定中还必须进行亲和力测定，它可为正确选择不同用途的单克隆抗体提供依据。另外根据需要不同，还应对单克隆抗体的特异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进行测定。五、单克隆抗体的大量制备五、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法可获得10g/ml的抗体。（2）动物体内诱生法，可获得5-20mg/ml的抗体。目前多采用后者生产制备单克隆抗体。因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞均来自BALB/c小
16、鼠，所以应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。动物体内诱生法操作简便，也比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。六、单克隆抗体的纯化六、单克隆抗体的纯化 1、澄清和沉淀处理 小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力1000g离心5min，去除残留的小颗粒物质；再用0.2m的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。2、分离 根据用途可选用不同的方法，主要分离方法有凝胶过滤、阴离子
17、交换层析、亲和层析等。（1）凝胶过滤 用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化。常用Sephadex G200作分离介质，可收集到三个峰，最高峰为IgM，另两个峰为IgG，抗体回收率达50%-80%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。（2）阴离子交换层析：用于IgG类单克隆抗体的分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度条件下洗脱下来，其纯度较高。IgG2b、IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。在pH5.5条件下，把杂交瘤细胞培养的上清液加到琼脂糖柱上时，所有的抗体都能结合到柱上
18、，而55%的杂蛋白可被洗脱掉，再用不同离子强度的洗脱剂洗下。（3）离子交换法 在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析分离单克隆抗体可以纯化25-100倍。高容量、高流速、化学稳定的新型离子交换剂适宜单克隆抗体的大规模纯化。（4）亲和层析 多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体的纯化。IgG与蛋白A的结合与pH有密切关系，鼠源性单克隆抗体在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度很高，但也有
19、极微量的杂蛋白。第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改进鼠源性单克隆抗体的改进 改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道，见书中表4-4，给出了改造后的单抗的类型和特性。一、人一、人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 制备方法：提取杂交瘤细胞系的mRNA，经过逆转录成cDNA，并以其为模板，采用特异引物，用PCR方法分别扩增VL和VH基因，再分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，将VL基因克隆到人Ig的CL基因表达
20、载体上，将VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表达载体上，再将人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，转染后用含霉酚酸进行筛选，形成集落的细胞即为共转染细胞，所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠IgG1或IgG2b，则可有效地加强多肽的ADCC效应与免疫调理作用。二、改形抗体二、改形抗体 如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫
21、原性。这种改形抗体（reshaping antibody）又称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）。书中表4-5给出几种改形抗体及其潜在的临床应用。三、小分子抗体三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的1/80-1/3。也就是说，保留了CDR区，而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型：（1）Fab抗体，由完整的轻链和重链（VH和CH1）所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（single chain antibody SCA 或single
22、chain FV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。四、双功能抗体四、双功能抗体 双功能抗体就是双特异性抗体（biospecific antibody,BsAb）。它是一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法 2、生物学方法（
23、杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的 杂种-杂交瘤细胞。3、基因工程方法 采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性（SCFV)2。五、抗体融合蛋白五、抗体融合蛋白 类型有：（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（4）受体-FV型融合蛋白。（5）酶-抗体型融合蛋白。其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位
24、置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。构建抗体融合蛋白的原则是：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。第四节第四节 抗体工程抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获得目的基因 2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。4、表达与
25、鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程。二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库 抗体文库1011库容，能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。VH和VL随机重组增加抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术 3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，因此产生的抗体必然都是高亲和力的。三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗体的表达 1、原核细胞表达 2、真核细胞表达 3、转基因植物表达 4、转基因动物表达
