1、郑 磊 南方医科大学南方医院 质谱技术在EVs检测中的应用1.1.细胞外囊泡（细胞外囊泡（EVsEVs）简介）简介2.2.EVsEVs用于疾病诊断用于疾病诊断3 3.我们的工作我们的工作8/17/20224 4.EVEVs s学术组织学术组织1.1.细胞外囊泡（细胞外囊泡（EVsEVs）简介）简介8/17/2022所有细胞都分泌细胞外囊泡所有细胞都分泌细胞外囊泡（Extracellular Vesicles）细胞外囊泡（细胞外囊泡（Extracellular Vesicles）细胞外囊泡（细胞外囊泡（EVs)EVs)是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出
2、释放出30-2000nm30-2000nm的微小囊泡；的微小囊泡；EVsEVs内含多种生物学活性物质如：核酸、蛋白质、脂类等内含多种生物学活性物质如：核酸、蛋白质、脂类等Marina Colombo et al,Annual Review Cell Developing Biology(2014)200 nmEV 的体内分布的体内分布我们能看见我们能看见EVs吗吗?我们能看见我们能看见EVs吗吗?外泌体（外泌体（ExosomeExosome）微泡（微泡（MicrovesiclesMicrovesicles）凋亡小体（凋亡小体（Apoptotic bodiesApoptotic bodies）E
3、Vs的种类的种类Bence Gyorgy et al,Cellular and Molecular Life Sciences(2015)8/17/20221946 Chargaff and West“the clotting factor ofwhich the plasma is deprived”20-50nm,1.020-1.025 g/ml,“platelet dust”1967Wolf1983 Harding et al.1992Johnstone et al.MVB associated with Exosome formation and secretionExosomes m
4、ay play a role in antigen presentation convincingly demonstrate vesicle secretion by cells1996 Raposo et al.Exosomes transfer mRNA and miRNA between cells 2006Lotvall et al.2011ISEVInternational Society for Extracellular Vesicles were foundedWorlds First Exosomal RNA-Based Liquid Biopsy2016ExoDx,Inc
5、2015Lyden et al.Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis细胞释放细胞释放抗原提呈抗原提呈ISEVISEV成立成立 第一款诊断试剂第一款诊断试剂观察到观察到EVsEVs物理性质物理性质释放机制释放机制水平转运水平转运肿瘤转移肿瘤转移Exosomes may play a role in antigen presentation 1996 Raposo et al.Exosomes transfer mRNA and miRNA between cells 2006Lotvall et al.EVEV相关文
6、章相关文章EVsEVs的研究热潮的研究热潮NSFC NSFC 资助资助EVsEVs的研究方向的研究方向研究较多的方向：临床应用，肿瘤，免疫，细胞间相互作用研究较多的方向：临床应用，肿瘤，免疫，细胞间相互作用Wang Yiran et al,Oncotarget(2017)8/17/2022样品收集样品收集EVsEVs纯化纯化检测检测EVsEVs颗粒颗粒EVsEVs内部分子内部分子EVsEVs生物功能生物功能检测分析检测分析EVsEVs的常见研究策略的常见研究策略根据实验要求根据实验要求确定纯化方法确定纯化方法8/17/2022EVs 研究指南研究指南：ISEV,ISTH,AHAMethodol
7、ogical Guidelines to Study Extracellular Vesicles.Circ Res,2017.Obstacles and opportunities in the functional analysis of extracellular vesicle RNA-an ISEV position paper.J Extracell Vesicles,2017.EV-TRACK:transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.Nat Methods
8、,2017.Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination:results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop.J Thromb Haemost,2013.Standardization of sample collection,isolation and analysis methods in extracellular vesicle res
9、earch.J Extracell Vesicles,2013.Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions:a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.J Extracell Vesicles,2014.2017.20188/17/2022 MISEV2018 JEV,20181.1.E EV Vs s 的分离与纯化常用技术的分离与纯化常
10、用技术差速离心差速离心尺寸排阻尺寸排阻梯度密度离心梯度密度离心化学沉降化学沉降磁珠捕获磁珠捕获Bogdan Mateescu et al,Journal of Extracellular Vesicles(2017)plasma/serum was diluted in the same or larger volume of PBS经典分离方法经典分离方法-超速离心法超速离心法/蔗糖梯度离心蔗糖梯度离心concentrate with Centriconconcentrate CCM300 x g,10minpellet=cellssupematantsupematantsupematant
11、2000 x g,20min10000 x g,30minpellet=dead cellspellet=cell debris磁珠捕获磁珠捕获新型试剂盒新型试剂盒？EVsEVs2.EVs2.EVs的经典鉴定方法的经典鉴定方法核酸核酸高通量测序技术转录组学分析荧光实时定量PCR基因芯片数字PCR内容物分析内容物分析蛋白质蛋白质蛋白质组学分析（质谱，2-DE等）流式细胞术ELISAWestern Blot微型核磁共振系统脂类脂类质谱分析薄层色谱法3.EVs3.EVs内容物分析内容物分析4.4.E EVs Vs 检测技术检测技术-粒径分布及数量粒径分布及数量检测检测NTANTA技术技术可以清晰观察
12、到带有散可以清晰观察到带有散射光的颗粒的布朗运动，得到射光的颗粒的布朗运动，得到EVsEVs浓度大小及粒径分布范围浓度大小及粒径分布范围Q-Q-NanoNano技术技术具有样品用量少、具有样品用量少、尺寸小、可便携等特点，可实现尺寸小、可便携等特点，可实现快快速，准确的计数和测量纳米微米颗速，准确的计数和测量纳米微米颗粒的浓度粒的浓度蛋白组分析代谢组分析基因组分析MALDI-ToF MS 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱Mass Array分子量阵列基因分析 QToF MS/Orbit 飞行时间/轨道离子阱分析器LC-MS/MS 液相色谱-串联质谱ICP-MS电感耦合等离子体质谱GC-MS 气
13、相色谱-串联质谱E EVs Vs 检测技术检测技术-多组学标志物多组学标志物检测检测 基因组学 蛋白质组和代谢组学对可能发生事件的预测通过代谢物信息库提示“已经发生了什么”蛋白质组学和代谢组学比基因组学更重要也更困难！质谱可以解决！E EVs Vs 检测技术检测技术-多组学标志物多组学标志物的检测的检测基因组基因组25,000 基因转录组转录组100,000 转录本蛋白质组蛋白质组1,000,000 蛋白质代谢组代谢组2,500 化合物PossibilityProbabilityWhats happeningWhat happened质谱质谱二代测序二代测序基因是静止的，蛋白质和代谢物是动态的
14、！基因是静止的，蛋白质和代谢物是动态的！基因是有限的，蛋白质和代谢物是无限的！基因是有限的，蛋白质和代谢物是无限的！E EVs Vs 检测技术检测技术-蛋白及代谢组蛋白及代谢组标志物检测标志物检测蛋白质组蛋白质组代谢组代谢组分析深度达到分析深度达到2500种化合物，种化合物，10年提高一个数量级年提高一个数量级一个血浆样本近一个血浆样本近1000种代谢物。种代谢物。这些代谢物变化和疾病相关。这些代谢物变化和疾病相关。常规测定技术困难，质谱可以常规测定技术困难，质谱可以解决！解决！人类蛋白质组草图人类蛋白质组草图(2014)：17,294 种种 蛋蛋白质（白质（84%基因覆盖）基因覆盖）血浆：血
15、浆：1000种蛋白；组织：种蛋白；组织：10,000种蛋白种蛋白采用质谱技术，采用质谱技术，3小时从采小时从采血到出报告血到出报告E EVs Vs 检测技术检测技术-蛋白及代谢组蛋白及代谢组标志物检测标志物检测E EVs Vs 检测技术检测技术-蛋白及代谢组蛋白及代谢组标志物的检测标志物的检测超高分辨质谱卓越的灵敏度和准确性可很好地应对外泌体低丰度生物标志物检测的挑战！纳米流式检测仪纳米流式检测仪E EVs Vs 检测技术检测技术-特定蛋白标志物特定蛋白标志物的检测的检测u 特定亚群的鉴定特定亚群的鉴定u 疾病诊断和治疗监控疾病诊断和治疗监控u 外泌体纯化方法的分析表征外泌体纯化方法的分析表征
16、u EV相关产品的质量控制相关产品的质量控制u 数字数字PCRPCR技术技术Chevillet John R et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2014,111(41):14888-93.E EVs Vs 检测技术检测技术核酸核酸标志物的检测标志物的检测2.2.EVsEVs用于疾病诊断用于疾病诊断8/17/2022E EV Vs s与疾病诊断与疾病诊断1.1.EVsEVs作为诊断标志物的优势作为诊断标志物的优势 无创，有望作为病情监测标志物；无创，有望作为病情监测标志物；更全面的反应肿瘤情况；更全面的反应肿瘤情况；灵敏度高且血清干扰较少；灵敏度高且血清干扰较少；存
17、在于多种体液中；存在于多种体液中；脂质双层膜保护作用，分子更稳定，脂质双层膜保护作用，分子更稳定，易于保存易于保存EVs biomarkersDNARNALipidsProteinsMetabolitesPeptideGlycan,ect.2.2.EVsEVs诊断标志物诊断标志物EVsEVs中中蛋白质蛋白质作为诊断标志物作为诊断标志物Nature.2015 Jul 9;523(7559):177-82.GPC1GPC1+exosomeexosome用于诊断早期胰腺癌用于诊断早期胰腺癌胰腺癌小鼠模型血液胰腺癌小鼠模型血液exosome GPC 1升高早于影像学。升高早于影像学。胰腺癌患者手术后，
18、胰腺癌患者手术后，GPC1+exosomeGPC1+exosome下降多，下降多，患者生存率高。患者生存率高。EVsEVs中中蛋白质蛋白质作为治疗效果标志物作为治疗效果标志物Nature.2018 Aug;560(7718):382-386血液循环血液循环Exosomal PD-L1Exosomal PD-L1用于用于区分健康人和黑色素瘤病人区分健康人和黑色素瘤病人外泌体外泌体PD-L1PD-L1分子的水平最分子的水平最适合用于区分健康人和黑适合用于区分健康人和黑色素瘤病人。色素瘤病人。黑色素瘤小鼠血浆外泌体中黑色素瘤小鼠血浆外泌体中PD-PD-L1L1分子水平明显上调，且与肿分子水平明显上调
19、，且与肿瘤体积大小成正相关。瘤体积大小成正相关。EVsEVs中中蛋白质蛋白质作为治疗效果标志物作为治疗效果标志物Nature.2018 Aug;560(7718):382-386血液循环血液循环Exosomal PD-L1Exosomal PD-L1用于用于指导临床用药和预测临床预后指导临床用药和预测临床预后第第3-63-6周，外泌体周，外泌体PD-L1PD-L1水平的倍数增加大水平的倍数增加大于于2.432.43时，可更好地区分治疗响应好和坏时，可更好地区分治疗响应好和坏的患者。的患者。治疗前期，血浆中的外泌治疗前期，血浆中的外泌体体PD-L1PD-L1水平越高，药物水平越高，药物响应越差，
20、预后越差。响应越差，预后越差。Proc Natl Acad Sci U S A.2017 Mar 21;114(12):3175-3180PTMs of proteins in EVs as biomarkers Higher levels of miR-1290 and-375 were significantly associated with poor overall survival(p 0.004)in the follow-up cohort.Xiaoyi Huang et al,European Urology(2015)8/17/2022EVsEVs中中核酸核酸作为诊断标志物作
21、为诊断标志物EVsEVs中中脂类脂类作为诊断标志物作为诊断标志物尿液尿液exosomeexosome中乳糖神经酰胺（中乳糖神经酰胺（LacCerLacCer）和磷脂酰丝氨酸（和磷脂酰丝氨酸（PSPS）用于前列腺癌检测）用于前列腺癌检测Skotland T et al,European Journal of Cancer(2017)Theranostics.2017 Aug 23;7(16):3824-3841.Glucuronate,etcGlucuronate,etcEVsEVs中中代谢物代谢物作为诊断标志物作为诊断标志物NIHNIH注册的注册的exosomeexosome诊断试剂临床试验诊
22、断试剂临床试验ContinueContinue。JAMA Oncol.doi:10.1001/jamaoncol.2016.00971500余例标本多中心的研究中，余例标本多中心的研究中，将高级别前列腺癌（将高级别前列腺癌（GS7）与低级别前）与低级别前列腺癌（列腺癌（GS 6）及前列腺良性病变的）及前列腺良性病变的鉴别诊断效能从鉴别诊断效能从0.63提高到提高到0.73收集尿液，提取外泌体，检测外泌体中收集尿液，提取外泌体，检测外泌体中3条条RNA，代入诊断模型，评估前列腺癌风险，代入诊断模型，评估前列腺癌风险CLIA认证，临床可用认证，临床可用第一个基于外泌体液体活检的临床检测试剂盒第一个
23、基于外泌体液体活检的临床检测试剂盒8/17/2022EVs标志物研究机制研究临床研究screeningscreeningverificationverificationtrainingtrainingvalidationvalidation体外实验体外实验体内实验体内实验EVsEVs提取、表征提取、表征相关性分析相关性分析ROCROC生存分析生存分析表达差异表达差异诊断模型诊断模型离心、沉淀、层析；粒径、离心、沉淀、层析；粒径、WBWB、电镜、电镜测序、芯片、蛋白质谱、脂质分析测序、芯片、蛋白质谱、脂质分析摄取实验摄取实验共培养实验共培养实验细胞功能实验细胞功能实验EVsEVs改造改造靶器官成
24、像靶器官成像局部局部/静脉给药静脉给药病理观察病理观察形态功能评价形态功能评价胞内分子机制胞内分子机制脂质染料、脂质染料、CD63-GFPCD63-GFP质粒质粒剂量、周期；加入剂量、周期；加入EVsEVs或抑制或抑制EVsEVs分泌分泌瞬转、稳转瞬转、稳转EVsEVs刺激后细胞功能改变刺激后细胞功能改变靶基因、信号通路分析靶基因、信号通路分析剂量、周期剂量、周期EVsEVs在靶器官聚集在靶器官聚集EVsEVs诊断标志物筛选主要策略诊断标志物筛选主要策略1.1.细胞系；细胞系；2.2.临床血液体液样本；临床血液体液样本；3.3.患病组织；患病组织；4.4.前期研究或文献前期研究或文献8/17/
25、2022EVsEVs诊断标志物筛选主要策略诊断标志物筛选主要策略1.1.细胞系样本细胞系样本8/17/2022 validation setAUC,0.961AUC,0.9682.2.临床血液体液样本临床血液体液样本Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinomaDifferentially expressed proteinsAZU1(P0.01,fold-change=31.59).Tissue-exudative EVs(Te-EVs)characterizationIEM:Labeled with CD9T:
26、tumor,N:Normal(Jingushi,Uemura et al.Int J Cancer 2018)3.3.临床患病组织临床患病组织观察到不同转移倾向细胞的外泌体靶向不同器官，质谱分析发现差异蛋白整合素敲低外泌体整合素，注射小鼠，观察细胞定植转移改变用外泌体整合素亚型预测乳腺癌患者发生转移的器官通过细胞系筛选到潜在标志物，利用临床标本进行验证，在小鼠体内进行机制研究4.4.前期研究或文献前期研究或文献1.1.快速简便的提纯方法；快速简便的提纯方法；2.2.鉴定器官或疾病特异性的鉴定器官或疾病特异性的EVsEVs；3.3.区分区分EVsEVs功能亚群；功能亚群；4.4.检测方法标准化。
27、检测方法标准化。8/17/2022EVsEVs诊断标志物研究应用的主要问题诊断标志物研究应用的主要问题8/17/20223.3.我们的工作我们的工作EVsEVs临床应用临床应用开发新型开发新型EVsEVs检测技术检测技术EVsEVs相关相关循环标志物研究循环标志物研究 探索探索EVsEVs纯化定量方法纯化定量方法多种多种EVsEVs纯化定量方法比较纯化定量方法比较我们比较了多种我们比较了多种ExosomeExosome纯化及核酸定量方法，总结出纯化及核酸定量方法，总结出各方法的优缺点，便于后续选择合适的各方法的优缺点，便于后续选择合适的EVsEVs纯化方案纯化方案INT J MOL MED 2
28、017,40(3):834-844.细胞培养液中Exosomes和Exosomes RNA提取方法比较方法提取效率优缺点推荐用途exosomesExo-RNA浓度纯度浓度纯度Ultra+Trizol/SeramirLHLMexosomes蛋白污染少,提取效率低起始体积较大样本（CCM、尿液等），蛋白组学研究Exoquik+SeramirHLHLexosomes提取效率高;有蛋白污染;exoRNA含长链RNA片段总exoRNA分析exoquik+HLRexoquik+HLRTEI+TERTEI+TERH HL LH HH Hexosomesexosomes提取效率高提取效率高;有蛋白污染有蛋白污
29、染;小小RNARNA质量高，无长链干扰质量高，无长链干扰高通量测序或其它小高通量测序或其它小RNARNA分分析研究析研究注：H：高；M：中，L：低；粗体标记方法为推荐方法INT J MOL MED 2017,40(3):834-844.多种多种EVsEVs纯化定量方法比较纯化定量方法比较-细胞培养液细胞培养液Bradford法定量exosomes蛋白浓度实时荧光定量PCR分析不同方法提取exo-RNA中4种miRNA表达水平UC+TrizolExoquick+SeraMirTEI+TERExoRNeasy4种方法提取RNA质量分析多种多种EVsEVs纯化定量方法比较纯化定量方法比较-血清血清中
30、华检验医学杂志，中华检验医学杂志，2016，39（6）Shuhuai Yao,Lei Zheng,Xiaonan Xu,Chunchen Liu,Yu Hu,Quantification,Isolation,and Characterization of Exosomes using Droplet-based and Well-based Microfluidic Systems,2017/10/05,USA,(62/606,687)基于微液滴技术实现外泌体的单个分析及绝对定量基于微液滴技术实现外泌体的单个分析及绝对定量新型新型EVsEVs检测技术的开发检测技术的开发Nano Letters
31、,2018Nano Letters,2018Our droplet digital ExoELISA approach is able to detect as few as 10 exosomes/L.58Specificity assays two negative controls:a sample using magnetic beads without CD63 Ab,a sample using CD63-functionalised magnetic beads with no exosomes;three kinds of non-cancerous exosomes:huma
32、n normal liver exosomes(HL-7702 exo),mouse normal macrophage exosomes(RAW264.7 exo),human embryonic stem exosomes(hES exo).8/17/2022Proteomics，2019血清血清EVsEVs蛋白质组学筛选肺癌生物标志物蛋白质组学筛选肺癌生物标志物8/17/2022ABCDProteomics，2019血清血清EVsEVs蛋白质组学筛选肺癌生物标志物蛋白质组学筛选肺癌生物标志物8/17/2022Differentially expressed EVs proteins be
33、tween lung carcinoma Differentially expressed EVs proteins between lung carcinoma tissue and para-carcinoma tissue and their bioinformatics tissue and para-carcinoma tissue and their bioinformatics analysisanalysis基于肿瘤组织基于肿瘤组织EVsEVs蛋白质组筛选生物标志物蛋白质组筛选生物标志物Unpublished data8/17/2022基于肿瘤组织基于肿瘤组织EVsEVs蛋白质
34、组筛选生物标志物蛋白质组筛选生物标志物Unpublished dataABCD8/17/20224.4.EVsEVs学术组织学术组织2 2011011年年国际囊泡协会国际囊泡协会（International Society For Extracellular Vesicles，ISEV）创办官方会刊创办官方会刊 Journal of Extracellular VesiclesJournal of Extracellular Vesicles（JEVJEV）召开年会时间地点参会人数2012，April 18-20Gothenburg,The Sweden4802013，April 17-20B
35、oston,The USA2014，April 30 May3Rotterdam,The Netherlands6852015，April 23-26Washington DC,The USA7802016，May 4-7Rotterdam,The Netherlands8602017，May 18-21 2018,May 2-62019，April 24-28Toronto,CanadaBarcelona,SpainKyoto,Japan96012001200国际细胞外囊泡协会（国际细胞外囊泡协会（ISEVISEV）Editors-in-Chief Clotilde Thery,Instit
36、ut Curie,INSERM,FrancePeter J.Quesenberry,Brown University,United States Yong Song Gho,Pohang University of Science and Technology,Korea Online ISSN:2001-3078；国际囊泡协会ISEV会刊；严格同行评议审查，免费获得全文；文章形式：original research,review,case report,meeting report,technical report；版面费：ISEV会员，7页以内文章950/篇；年发文章量：约60篇；2018
37、年影响因子:11Journal of extracellular vesicles(JEV)2018.11.18-20,Guangzhou,Southern Medical UniversityISEV 走进亚洲走进亚洲CSEV 2017CSEV 2017年成立年成立20172017年年6 6月月 中国广州中国广州学会官网：学会官网： ProvinceTime:2018.11.16-18 2018 2nd CSEV Annual Meeting2019年10月18日-20日时间：时间：2019 3rd CSEV Annual Meeting 2019 2019 第三届全国细胞外囊泡大会第三届全国细胞外囊泡大会Thanks!
