1、 第六章第六章 扫描电镜生物样品扫描电镜生物样品 制备技术制备技术 扫描电镜对生物医学观察样品的要求扫描电镜对生物医学观察样品的要求 扫描电镜是以电子束在样品表面扫描激发出的二次电子作为成像第一信号，最后转换成样品形貌图像的，所以它对观察的样品有特殊的要求，适合扫描电镜观察的样品必须具备以下条件：1 1、在形态结构上应接近生活状态。、在形态结构上应接近生活状态。生物组织内含有大量的水分，因此在观察之前，即要想办法去除水分，又不能改变了它的原始形貌。2 2、表面应具有很好的导电性能。、表面应具有很好的导电性能。生物样品是由低原子序数的物质组成的，除在含水时能导电外，当干燥后基本是一个绝缘体，这就
2、要想办法进行导电处理，使它能够导电。3 3、应能产生丰富的二次电子。、应能产生丰富的二次电子。可以导电的物质很多，并非都能用作扫描电镜生物样品的导电处理。目前常用于扫描生物样品制备导电处理的物质有黄金、铂金及铂钯合金和铂铱合金。只有这些金属对生物样品导电处理后，才能产生丰富的二次电。4 4、样品能耐高真空和耐电子束的轰击、样品能耐高真空和耐电子束的轰击。如果样品制作的不合乎要求，当电子束在表面扫描时，会产生电荷的积累，造成观察图像亮的地方很亮，黑的部位很黑，样品的结构细节看不清楚，严重时会造成样品的损伤。生物医学样品为了满足扫描电镜的观察要求，必须严格按照制作程序制作，含水的和不含水的样品制作
3、方法是不同。第一节第一节 含水生物扫描样品制备的含水生物扫描样品制备的 基本步骤与方法基本步骤与方法 在生物扫描样品制备技术中，除了一些含水量很少（如植物的花粉，干燥的木材），外壳很坚硬，自然干燥不会造成形貌变化的材料（如骨骼、甲壳虫等）外，所有含水生物材料都要按如下步骤制作样品。1 1、取材与清洗、取材与清洗 扫描生物样品对取材的要求有很多方面同超薄切片，但也有不同之处。1）、取材的方法）、取材的方法 动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品块可稍大一些
4、，一般观察面大小可在长X宽大约为3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞的盖片直接进行制样处理。细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌落涂到干净的盖片上，进行制样。悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌，然后再进行制样。2 2）、）、取材的注意事项取材的注意事项（1）、所取材料块的大小要适中，在便于操作的情况下，应尽量取得小一些。因为样品块过大制样时虽然好操作，但各步骤处理的时间要加长；如果样品块取得太小，不便于操作。（2）、取材的部位一定要准确。在取材的过程中一定要尽量去掉不需要的组织。（3）
5、、需要取对比样品时，实验组和对照组一定要取相同一致的部位，这样才有对比意义。（4）、对某些时间要求严格的样品，在取材时一定要严格掌握取材的时间。（5）、一些塑性大、脆性大的样品，为避免切割造成的损伤，可采取冷冻断裂取材。3 3）、样品的清洗）、样品的清洗 生物的组织器官，它们在体内由于执行不同的生理功能，它们的表面都有不同的污物（如血液、分泌物、粘液等）。为使这样的组织的真面目充分暴露出来，以利于在扫描电镜下观察到真正的表面形貌，就必须进行认真的清洗。根据组织表面的不同污物可采取不同的清洗方法，清洗方法主要有如下几种：（1 1）、用缓冲液、蒸馏水漂洗或冲洗。）、用缓冲液、蒸馏水漂洗或冲洗。这种
6、方法主要适用于组织表面附着的易溶于水的污物或附着不牢固的污物的清洗（如一些动物体表面和植物组织表面的污物）。（2 2）、生理盐水清洗。）、生理盐水清洗。本法主要适用于动物组织的清洗，多数动物组织都可采用这一方法进行清洗，但那些表面结构复杂（主要是凹凸不平）；组织表面的污物粘附牢固的样品，不能单纯用这种方法进行清洗。（3 3）、超声波清洗法。）、超声波清洗法。对那些表面污物较多、形态结构复杂的样品，采取一般方法很难清洗干净时，可用本法进行清洗。但是所选用的频率和功率一定要合适，否则，会损伤样品。一般情况下功率用2025瓦；频率用500025000Hz,清洗0.515分钟就可以。（4 4）、水解蛋
7、白酶清洗法。）、水解蛋白酶清洗法。对组织表面粘附的蛋白类物污，可用适当浓度的相应的水解蛋白酶水溶液清洗。但使用的浓度和清洗的时间要严格掌握。除上述几种方法外，有时还可以选用吐温20生理盐水溶液清洗。生物扫描样品的清洗很重要，生物扫描样品的清洗很重要，样品制作时必须认真对待。样品制作时必须认真对待。2 2、固定、固定 固定所使用的固定液与透射电镜的相同。一般也是采用戊二醛和锇酸双重固定法。在扫描电镜的生物样品制备技术中，用锇酸固定结束，一定要用双蒸水进行清洗，不能用缓冲液清洗，如果用缓冲液清洗，干燥后的样品表面会出现结晶，影响扫描图像的质量。另外，由于一般情况下，扫描样品块都较大，所以固定的时间
8、要适当加长。3 3、脱水、脱水 生物扫描样品的脱水同透射电镜生物样品的脱水。也是采用上升浓度的方法，使用的脱水剂可以用酒精和丙酮两种。由于扫描电镜主要是观察研究生物组织或细胞的表面形貌结构。因此，在脱水过程中，除了脱水要干净、彻底；另一个必须注意的问题是，应严防在换液时造成样品的自然干燥。4 4、样品的干燥处理、样品的干燥处理 在生物扫描样品制备中，这是一个很关键而重要的步骤。如果干燥方法不当，会造成样品原始形貌的损伤甚至完全破坏。我们知道样品经过脱水后，虽然组织中的水分被脱水剂取代掉了，但样品依然浸泡在液体脱水剂中。大量试验证明，当液体物质自然挥发时，会产生很大的表面张力，对生物组织细胞的表
9、面微细结构造成严重的损伤。如可使样品不受液体表面张力作用，又能把液体物质从样品中除去，使样品真正达到干燥，这就要求样品制备专业技术人员选择一种好的干燥方法才行。只有干燥方法得当，才能最大程度的保留下生物组织细胞的生活状态时的原始形貌。目前可用的干燥方法有多种，我们可以根据样品的质地不同，选择不同的干燥方法。常用的干燥方法有如下几种：（1 1）、空气干燥法（也叫自然干燥法）：）、空气干燥法（也叫自然干燥法）：将经过脱水的样品或含水较少外壳坚硬（如虫卵、硬外壳的昆虫等）的生物样品，直接放在防尘的地方让它自然干燥，这就叫自然干燥法。这种方法一般不用。因为液体会发挥产生表面张力，对样品在城损伤。（2
10、2）、冷冻干燥法：）、冷冻干燥法：本方法是将新鲜的样品或经固定、脱水的样品迅速冷冻后，放入真空环境中，使玻璃态的冰直接升华跑掉，最终样品干燥。在样品的干燥过程中不存在液体的挥发，也就消除了液体表面张力的作用了，从理论上讲可以最大程度的保存样品的原始形貌。但是本法的干燥速度太慢，有人做过试验一块0.5平方毫米生物样品，在80度中干燥需要24小时。，如果样品块再大一些干燥需要的时间会更长。所以本法在扫描样品制备时也不常用。（3 3）、莰烯低真空干燥法）、莰烯低真空干燥法：莰烯是一种具有樟脑味，无色透明的结晶。能溶于醚、环己烷、氯仿和丙酮中，它在室温下为固态，遇空气很易升华，升华的速度与温度成正比。
11、它在45度以上时变为液态。只因为莰烯可从固态直接变为气体，不经过液态就能挥发跑掉，就不存在表面张力的作用了。所以就建立了莰烯低真空干燥法，用本法干燥的生物样品可有效地保存生物组织细胞的原始形貌。其操作方法是：其操作方法是：样品经过固定、清洗后，用上升浓度的丙酮进行脱水；然后用纯丙酮和莰烯等量混合液在室温下浸泡样品30分钟；再在45度中用液态纯莰烯浸泡样品30分钟；换一次纯液态莰烯再浸泡样品30分钟；这时将样品从液态的莰烯中取放到室温的滤纸上，组织内外的莰烯会马上变为固态，再在样品表面覆盖一薄层液态莰烯（也会迅速凝固）。最后将滤纸和样品一同放入低真空设备中，继续抽真空，直到组织内外的固体莰烯完全
12、挥发掉，样品就达到干燥的目的了。在进行真空干燥时可以用真空干燥器，也可用真空喷镀仪的低真空操作进行干燥。（4 4）、临界点干燥法：）、临界点干燥法：在扫描电镜生物样品制备技术中，临界点干燥法是最有效、最可靠和最常用的干燥方法。这种干燥法是在一种专用的仪器（叫临界点干燥仪）中进行的，这种仪器国内外都有定型的产品。最常见的是日立公司生产的HCP-2型，其结构原理见下图：HCP-2临界点干燥仪 1、外观图 2、原理图 临界点干燥法的原理：临界点干燥法的原理：实验证明，任何物质都有固体、液体和气体三种存在状态，当外部条件变化时，三种状态可以相互转化。当把液态物质放在一个密闭的容器中，施加一定的条件（提
13、高温度），盛有液态物质的密闭容器内的温度和压力达到一定程度时，容器内的液态物质就会气、液界面消失，这时的状态就叫这种液态物质的临界状态，这时所指示的温度就是这种物质的临界温度；这时的压力就是这种物质的临界压力。这种状态时就不存在液体表面张力了。处于临界状态的气体，压力再增大也不会变为液体，这时如果逐渐放掉，会使组织中的其它液体物质变为蒸汽跑掉，使样品干燥，从而就避免了表面张力对样品的作用。临界点干燥器就是根据物质在临界状态下液体表面张力亦随之消失的特性，而设计制造的。干燥媒介液及其中间置换液的选择干燥媒介液及其中间置换液的选择：干燥媒介液就是用来进行临界点干燥的液体物质，它的选择条件是临界压力
14、和临界温度应较低；容易提纯和保存；对大自然和人类危害小；价格便宜。部分可用于临界点干燥媒介液的特性比较部分可用于临界点干燥媒介液的特性比较 媒介液 临界压力 临界温度 中间置换液 氟利昂 38.2 28.9 丙酮 氟利昂23 47.7 25.9 乙醇 氟利昂116 29.4 19.7 乙醇 液体二氧化碳 72.8 31.5 醋酸异戊酯 液氮 36.5 71.6 不需要 从上表可看出，有些液体物质是优良的临界点干燥媒介液。但它们都有各自的不足，有的不易提纯，有的不好储存，而有的对大气和人类危害严重（如氟利昂）。所以现在都用液体二氧化碳作为临界点干燥媒介液。它不仅易提纯、易保存、价格又便宜、对人体
15、及大自然危害小，而且其性能指标可以满足要求。在用液体二氧化碳作为干燥媒介液时，应该用醋酸异戊酯作为中间置换液。经过脱水的样品，要用置换液处理后才能进行临界点干燥。处理的方法处理的方法是：是：用纯酒精和醋酸异戊酯等量混合液浸泡样品15分钟，再用纯醋酸异戊酯浸泡样品30分钟，就可进行临界点干燥了。临界点干燥的操作程序：临界点干燥的操作程序：A.样品经固定、脱水和中间液置换；B.预冷样品室。经过多次充放液体二氧化碳，使样品室冷却到10度以下；C.向样品室内放置样品。把处理好的样品放入样品筐内，再放入临界点干燥器的样品室内，旋紧样品室的盖；D.液体二氧化碳的注入。先打开盛液体二氧化碳钢瓶的阀门，再打开
16、临界点干燥器的进气阀门。使二氧化碳慢慢进入样品室，达到样品室容量的80；E.置换。将样品室温度控制钮调到15度，达到此温度后处理15分钟；再把温度调到20度，处理5分钟；f.临界状态处理。把样品室温度调到35度以上，当样品室内的温度达到31.5度，压力达到72.8个大气压时，样品室内的液体二氧化碳就达到临界状态（气相和液相两相消失），在此状态下处理5分钟；F.放气并取出样品。打开转子流量放气阀，缓缓放出样品室内处于临界状态的二氧化碳，当样品室内的压力降到30个大气压时，关掉加热电源，待样品室内的压力降到零，使温度接近室温后，打开样品室的盖，取出样品筐，此时样品就完全干燥了。临界点干燥应注意的事
17、项：临界点干燥应注意的事项：A.样品从中间置换液中取出时，要尽量去掉过多的置换液，并在尽短的时间内放入干燥器的样品室内，防止自然干燥。B.样品室和进液管必须预冷，否则样品室内会冲的液体二氧化碳不足，样品干燥不好。C.向样品室内充二氧化碳，速度要慢，以防止液体二氧化碳的冲击力过大，对样品造成损伤。D.样品筐的底部和顶部要盖一层滤纸，防止样品的污染。E.严格控制操作温度和压力，严守操作规程。F.保证所用二氧化碳的纯度，不纯会使干燥失败。5 5、粘托、粘托 样品干燥后，需要用胶粘物质将干燥的样品粘到样品托上。1 1）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件：）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件：（
18、1）、有一定的粘度，在室温下易干燥。（2）、具有较低的电阻率，导电性能好，颗粒细。（3）、干燥后收缩率小，胶膜平滑。（4）、化学性质稳定，受电子束轰击不分解。根据上述选择条件，目前在样品粘托时常用的胶粘物有：银粉导电胶、碳导电胶、铜导电胶带和双面胶带。2 2）、粘托时要注意的问题）、粘托时要注意的问题（1）、要根据样品的形状和大小不同，采取相应的粘托方式，胶粘的要坚固，但涂的胶不能太多。（2）、粘托之前应正确辨认出样品的观察面，保证观察面向上，以免错粘而造成样品的损坏。（3）、干燥后的样品脆性大、易碎。因此，胶粘时应做到动作轻、安放准确，防止用力过大和反复夹持样品。（4）、为防止对镜筒的污染，
19、粘托后的样品必须待导电胶干透，再进行以后的处理。6 6、样品的表面金属镀膜（导电处理）、样品的表面金属镀膜（导电处理）前面已经讲过，扫描电镜观察的样品必须能导电，并能产生丰富的二次电子。因生物样品是由低原子序数的物质组成，干燥后基本是绝缘体。所以必须进行导电处理后，才能进行扫描电镜观察。目前对生物扫描样品的导电处理有两种方法，一种是金属镀膜法。另一种是采用组织导电技术（非镀膜法）使样品导电。金属镀膜法是常用的方法。金属镀膜法有两种方法：金属镀膜法有两种方法：1 1）、真空镀膜法：）、真空镀膜法：这是一种利用真空喷镀仪，在高真空条件下，把需要蒸发镀膜的金属加热，蒸发成金属蒸气，蒸气状态的金属粒子
20、沉降在样品的表面，形成一层导电膜的方法。本法所用的设备叫真空喷镀仪，这种仪器种类型号很多，我国使用的多数是日本日立公司生产的 HUS-5和HUS-5GB 型，其结构原理 如右、下图所示：在进行真空喷镀时所用的金属一般是黄金、铂金或是铂铱、铂钯合金。其他金属有时也可以使用，但不如上述金属产生的二次电子丰富。2 2）、离子溅射镀膜法：）、离子溅射镀膜法：这种镀膜法是生物扫描电镜样品导电处理的最好方法。它的特点是它的特点是：对真空度的要求低；镀膜均匀，不会产生死角；溅射出的金属粒子细，不会掩盖样品的微细形貌。进行离子溅射镀膜的仪器叫离子溅射仪，现在大多数电镜室用的都是日本产的IB-5型离子溅射仪。它
21、它的工作原理是：的工作原理是：该仪器由一个低真空的玻璃罩，内装一个金属制成的阴极靶（铂金或黄金）和与阴极对应的并能调节距离的阳极样品台。把要导电处理的生物样品放到阳极上，在已抽真空的玻璃罩内通入少量的惰性气体（如氩气、氮气等）或新鲜的空气，IB-5离子溅射仪 1、外观图 2、原理图 使玻璃照内处于惰性气体的低真空状态。然后在两极间通电就产生辉光放电，气体被电离产生的阳离子，在负电场的加速下去轰击金属钯，使金属分子溅射出来，在正电场的加速下飞向阳极上的样品表面，途中又不断与气体分子碰撞而改变方向，使带有负电的金属分子向四面八方散射。由于样品各个区域都带有正电位，吸附金属离子的机会是相等的，所以在
22、样品表面就形成了一层均匀的导电膜，并且不会产生死角。在进行离子溅射镀膜时，应掌握好溅射的条件，一般是：真空度为0.0050.1讬，溅射电压为18002100伏，溅射电流50100毫安，溅射镀膜的时间是0.52分钟，镀膜的厚度约为510nm.3 3）、离子溅射镀膜和真空镀膜的比较）、离子溅射镀膜和真空镀膜的比较（1）、离子溅射镀膜的颗粒细而均匀。以相同的厚度比较，本法形成的“岛状结构”仅为真空镀膜的15110。因此，用离子溅射镀膜对非导电样品进行导电处理更有利于显示其表面的微细形态结构。（2）、对于那些高凹不平形貌复杂的样品，由于溅射出的金属分子与真空喷镀所蒸发出的金属颗粒受力不同，可绕射进入样
23、品的凹陷处，不会产生镀膜的死角，可以获得较满意的镀膜效果，其二次电子的发射率也比真空镀膜法高许多。（3）、离子溅射镀膜时要求的真空度较低，不需要复杂的真空系统。所以仪器的体积小、造价低、结构简单、操作方便。（4）、离子溅射仪可一机多用。兼有离子净化，离子蚀刻的功能。（5）、具有节省金属的特点，因为镀膜都是用黄金或铂金。生物扫描样品导电处理结束，就可以进行扫描电镜观察了。在生物扫描样品制备中，除了上述常规制备方法外，还有一些适应特殊研究要求的样品制备方法。如冷冻割断法，采用这种方法制作的样品，可以在扫描电镜中研究细胞的内部结构，有兴趣的同学可查看有关书籍。另外还有管道铸形法，主要是用于腔性器官的分布情况和腔内壁形态的研究。对于一些不含水的固体不导电样品（如干燥的植物花粉、木材），粘托之后，进行导电处理就可进行扫描电镜观察了。一些可以导电的固体材料样品（如一些金属材料的扫描电镜研究），粘托后就可送入扫描电镜中观察。含水生物样品SEM图像 鸽子气管粘膜上皮细胞表面的纤毛鸽子气管粘膜上皮细胞表面的纤毛 离体培养细胞 不含水生物样品SEM图像 两种植物的花粉表面形态两种植物的花粉表面形态
