1、第三章第三章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶第一节第一节 基因工程的工具酶基因工程的工具酶 第二节第二节 DNA的切割反应的切割反应第一节第一节 基因工程的工具酶基因工程的工具酶一、限制性内切酶（一、限制性内切酶（Endonucleosase）二、二、T4-DNA连接酶（连接酶（T4-DNA Ligase）三、核酸酶三、核酸酶 四、聚合酶四、聚合酶五、五、DNA修饰酶修饰酶 一、限制性核酸内切酶（一、限制性核酸内切酶（Endonucleosase）（一）限制性内切酶的发现与分类（一）限制性内切酶的发现与分类 1）限制修饰系统限制修饰系统：细菌能将外来细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上片段
2、在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰。得以保护，这种现象叫做限制修饰。2）限制性核酸内切酶的类型）限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型限制修饰限制修饰 多功能多功能 单功能单功能 双功能双功能 蛋白结构蛋白结构 异源三聚体异源三聚体 同源二聚体同源二聚体 异源二聚体异源二聚体 辅助因子辅助因子 ATP Mg2+SAM ATP Mg2+SAM Mg2+Mg2+ATP
3、Mg2+SAM ATP Mg2+SAM识别序列识别序列 TGAN8TGCT TGAN8TGCT 旋转对称序列旋转对称序列 GAGCCGAGCC AACN6GTGC CAGCAG AACN6GTGC CAGCAG切割位点切割位点 距识别序列距识别序列1kb1kb处处 识别序列内或附近识别序列内或附近 距识别序列下游距识别序列下游 随机性切割随机性切割 特异性切割特异性切割 24-26bp24-26bp处处（二）（二）II类限制性内切酶的命名及特性类限制性内切酶的命名及特性 命名原则命名原则H Haemophilus aemophilus InInfluenzue fluenzue d d嗜血流感
4、杆菌嗜血流感杆菌d d株株属名种名株名属名种名株名H i n d IIIH i nd III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶（三）（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点及切割位点 几种最常用的限制性核酸内切酶几种最常用的限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶名称限制性核酸内切酶名称BamH Cla EcoR Hind HindKpnNot Pst Sal Sau3A Sfi Sma Xba Xho 识别序列和切割点识别序列和切割点GGATCC ATCGATGAATTCAAGCTTGTPyPuACGGTACCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACGA
5、TCGGCCNNNNNGGCCCCCGGGTCTAGACTCGAG 二、二、T4-DNA连接酶连接酶（T4-DNA Ligase）来源于来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复复3端羟基和端羟基和5端磷酸基因，脱水形成端磷酸基因，脱水形成3-5磷磷酸二酯键。酸二酯键。三、核酸酶三、核酸酶 作用作用：降解磷酸二酯键降解磷酸二酯键分为：外切酶分为：外切酶 内切酶内切酶（一）（一）Bal 31(来自于细菌来自于细菌 Alteromonas espejiana)单链特异内切，双链特异外切，依赖于单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+用途：用途：构建限制酶图谱构建限制酶图
6、谱产生末端缺失突变产生末端缺失突变DNADNA超螺旋线性化超螺旋线性化（二）（二）E.coli外切酶外切酶III只降解只降解DNA分子的一条链，产生单链的分子的一条链，产生单链的DNA分子。分子。（三）（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌）核酸酶（来源于米曲霉菌）特性：特性：1.降解单链降解单链DNA或或RNA，降解，降解DNA的速度大的速度大于降解于降解RNA的速度的速度2.降解发生的方式为内切降解发生的方式为内切3.酶切活性需酶切活性需4.0-4.5pH环境，环境，Zn2+激活激活4.酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低解活性比单链低75000
7、倍倍（四）（四）DNase I:来自于牛胰腺，既可来自于牛胰腺，既可以降解单链也可以降解双链，没有特异以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链性，产生单核苷酸或短链（五）（五）RNase H：切割切割DNARNA杂交双链中的杂交双链中的RNA序列，使杂交双链变成单链序列，使杂交双链变成单链DNA结构结构四、聚合酶四、聚合酶（一）（一）（二）（二）Klenow酶酶 该酶无该酶无5-3外切活性，保留了外切活性，保留了5-3聚合活性聚合活性及及3-5外切活性。外切活性。基因工程中利用该酶：基因工程中利用该酶：修复限制性内切酶造成的修复限制性内切酶造成的5突出的粘性末端突出的粘性末端标
8、记标记DNA探针探针催化催化cDNA第二条链的合成第二条链的合成末端终止法测序末端终止法测序 3 5GA新链合成方向新链合成方向5C（三）（三）T4 DNA聚合酶聚合酶（四）（四）T7 DNA聚合酶聚合酶测序酶测序酶（五）（五）Taq DNA聚合酶聚合酶耐高温，主要用于耐高温，主要用于PCR反应反应 DNA聚合酶活性聚合酶活性 RNase H活性活性 DNA内切酶活性内切酶活性 核酸结合活性核酸结合活性（六）依赖于（六）依赖于RNA的的DNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：以以RNA为模板聚合为模板聚合cDNA链链3AAAAAAAAAAAAAA 5m
9、RNA5TTTTTTTTTTTTTTT 3cDNA3AAAAAAAAAAAAAA 5mRNA5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18反转录酶 Mg2+dNTP反转录酶的基本特性反转录酶的基本特性：（RNase H）双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链5 3RNA3 5DNA 5 3RNA3 5DNA3 5DNA反转录酶反转录酶五、五、DNA修饰酶修饰酶 有大量的修饰酶，主要的有以下几种：有大量的修饰酶，主要的有以下几种：1）碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉可以去掉DNA分子的分子的5端的磷酸基团。端
10、的磷酸基团。2）polynucleotide kinase:来自于来自于T4侵染的侵染的大肠杆菌，在大肠杆菌，在5端增加磷酸基团。端增加磷酸基团。5 3 3 5 ppOHHO 3）末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase）来自于小牛胸腺组织，在来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的分子的3端增加端增加一个或多个脱氧核苷酸。一个或多个脱氧核苷酸。5 33 5ATGCATAGCADNADNA重组技术中最常用的工具酶重组技术中最常用的工具酶 酶酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶聚合酶 或其大片段（或其大片段（Kleno
11、w）Taq DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶末端转移酶末端转移酶SI核酸酶，绿豆核酸酶核酸酶，绿豆核酸酶DNA端酶端酶RNA酶酶A磷酸酶磷酸酶主要用途主要用途识别识别DNA特定序列，切断特定序列，切断DNA链链缺口平移制作标记缺口平移制作标记DNA探针探针 合成合成cDNA的第二链的第二链填补双链填补双链DNA3凹端凹端DNA序列分析序列分析 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）连接两个连接两个DNA分子或片段分子或片段催化多核苷酸催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针羟基末端磷酸化，制备末端标记探针在在3末端加入同质多聚物尾末端加入同质多聚物尾降解单链降解
12、单链DNA或或RNA，使双链，使双链DNA突出端变为平端突出端变为平端降解降解DNA，在双链，在双链DNA上产生随机切口上产生随机切口降解除降解除RNA切除核酸末端磷酸基切除核酸末端磷酸基第二节 DNA的切割反应一、缓冲系统的组成一、缓冲系统的组成 二、酶切操作二、酶切操作 三、酶切结果分析三、酶切结果分析 四、多酶联合酶解四、多酶联合酶解 五、定位酶切位点五、定位酶切位点 六、六、限制性内切酶的限制性内切酶的star活性活性 一、缓冲系统的组成一、缓冲系统的组成 II类酶的酶活条件：类酶的酶活条件：Tris-HCl pH7.5,25-50mM；10mM MgCl2；NaCl 0-150mM；
13、DTT 1mM 根据不同酶对盐离子要求根据不同酶对盐离子要求不同，可将缓冲液分为以下不同，可将缓冲液分为以下三种情况：三种情况：高盐：高盐：100-150mM 中盐：中盐：50-100mM低盐：低盐：0-50mM 二、酶切操作二、酶切操作 DNA量的确定，加入酶量的确定，反量的确定，加入酶量的确定，反应体积的确定（应体积的确定（20l），反应时间的确定，），反应时间的确定，1-1.5hr，一般为，一般为37，但也有例外，如，但也有例外，如Taq I在在65C时活性最高。时活性最高。单位限制性内切酶定义为：单位限制性内切酶定义为：在最佳缓在最佳缓冲系统和冲系统和20l体积中反应体积中反应1小时，
14、完全水解小时，完全水解1gDNA所需的酶量所需的酶量。三、酶切结果分析三、酶切结果分析（一）（一）酶切片段的检测酶切片段的检测 1）通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。的分子。2）DNA分子的检测分子的检测 a.染色染色EB，DNA分子小于分子小于25ng，很难检测到。，很难检测到。b.放射性自显影放射性自显影,可以监测少到可以监测少到2ng DNA分子。分子。（二）估计（二）估计DNA分子的大小分子的大小 根
15、据根据DNA分子的迁移率，可以用公式计分子的迁移率，可以用公式计算出分子量算出分子量 D=a b(logM)D是移动的距离，是移动的距离，M是分子量，是分子量，a,b是恒量但是恒量但随着电泳条件的改变而改变。随着电泳条件的改变而改变。也可根据已知大小的片段进行比较，误也可根据已知大小的片段进行比较，误差约在差约在5%左右。左右。四、多酶联合酶解四、多酶联合酶解 对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶解；对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶解；五、定位酶切位点五、定位酶切位点 建立酶切图谱需要的酶类建立酶切图谱需要的酶类确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目进行双酶切进行双酶切比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间的酶切或者在的酶切或者在4 4条件下进行）条件下进行）六、六、限制性内切酶的限制性内切酶的star活性活性 在在pH不合适，或甘油浓度过高不合适，或甘油浓度过高10%时，时，限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。
